Summary
Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.
Abstract
Respuestas de anticuerpos se logran a través de varios procesos críticos células B intrínsecos, incluyendo la hipermutación somática (SHM), la recombinación del ADN del interruptor de la clase (CSR) y diferenciación de la célula de plasma. En los últimos años, las modificaciones epigenéticas o factores, como la desacetilación de histonas y microRNAs (miRNAs), han demostrado interactuar con programas genéticos de células B en respuestas del anticuerpo forma, mientras que la disfunción de factores epigenéticos se ha encontrado para llevar a respuestas de autoanticuerpos. Análisis de expresión de miRNA y mRNA de genoma en las células B en respuesta a moduladores epigenéticos es importante para comprender la regulación epigenética de la célula de B función y anticuerpo respuesta. Aquí, demostramos un protocolo para la inducción de las células de B para someterse a la diferenciación de la RSE y la célula de plasma, tratar estas células B con inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) (IDH) y análisis de expresión de mRNA y microRNA. En este protocolo, se analizan directamente secuencias complementarias de ADN (cDNA) utilizando secuenciación de próxima generación ARNm (ARNm-seq) y tecnologías de miRNA-seq, mapeo de la secuencia se lee y el genoma, la transcripción reversa cuantitativa (qRT)-polimerización en cadena. Con estos planteamientos, hemos definido que, en las células de B inducidas a someterse a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma, IDH, un regulador epigenético, selectivamente modula la expresión de miRNA y mRNA y altera la diferenciación de la RSE y la célula de plasma.
Introduction
Marcas epigenéticas o factores, como la metilación del ADN, modificaciones post-traduccionales de las histonas y RNAs no codificantes (incluyendo microRNA), modulan la función de la célula al alterar la expresión de gen1. Las modificaciones epigenéticas regulan la función de linfocitos B, como la recombinación del ADN de interruptor de la clase de inmunoglobulina (RSE), hipermutación somática (SHM) y diferenciación a células de memoria B o células plasmáticas, tal modo de modulación el anticuerpo y el autoanticuerpo respuestas2,3. RSE y SHM críticamente requieren desaminasa citidina inducida por activación (ayuda, codificado como Aicda), que es altamente inducida en las células B en respuesta a T dependientes y T independientes antígenos4. Las células de B clase-cambiar/hypermutated más diferencian en células plasmáticas, que secretan grandes cantidades de anticuerpos de una manera críticamente dependiente de la proteína de maduración inducida por linfocitos B 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Cambios epigenéticos anormales en las células de B pueden resultar en respuestas del anticuerpo/autoanticuerpo aberrante, que pueden conducir a una respuesta alérgica o autoinmunidad1,4. Comprender factores como epigenéticos, como miRNAs, modular B célula-intrínsecas expresión génica no sólo es importante para el desarrollo de una vacuna, pero también es esencial para revelar los mecanismos de posibles respuestas de anticuerpo/autoanticuerpo anormal.
Desacetilación y acetilación de las histonas son modificaciones de los residuos de lisina de las proteínas histonas típicamente catalizadas por histona acetiltransferasa (HAT) e histona deacetilasa (HDAC). Estas modificaciones conducen a la accesibilidad creciente o decreciente de la cromatina y además permitan o evitar el atascamiento de proteínas o factores de transcripción al ADN y la alteración del gen expresión5,6, 7 , 8. inhibidores de las HDACS (IDH) son una clase de compuestos que interfieren con la función de las HDACs. Aquí, utilizamos el IDH (VPA) para abordar la regulación de las HDACS en el perfil de expresión genética intrínseca de las células B y en su mecanismo.
miRNAs son pequeños, no-codificación RNAs aproximadamente 18 a 22 nucleótidos de longitud que se generan a través de varias etapas. miRNA anfitrión genes se transcriben y forman la horquilla microRNA primario (pri-miRNAs). Se exportan al citoplasma, donde los pri-miRNAs más son transformados en miRNAs del precursor (pre-miRNAs). Finalmente, los miRNAs maduros se forman a través de la hendidura de la pre-miRNAs. miRNAs reconocer las secuencias complementarias dentro de lo 3' región sin traducir de sus mRNAs blanco6,7. A través del silenciamiento postranscripcional, miRNAs regulan la actividad celular, como proliferación, diferenciación y apoptosis de10,11. Varios miRNAs puede apuntar el mismo ARNm, y un único miRNA puede potencialmente objetivo mRNAs múltiple, es importante tener una visión en el contexto del perfil de expresión de miRNA para entender el valor de la persona y el efecto colectivo de miRNAs. miRNAs han demostrado estar involucrados en el desarrollo de células B y diferenciación periférica, así como diferenciación de células B específicas de la etapa, respuesta de anticuerpos y autoinmunidad1,4,9. En el 3' UTR de Aicda y Prdm1, hay varios sitios evolutivamente conservados validados o previsible que pueden ser objetivo de miRNAs8.
Modulación epigenética, incluyendo la modificación de la transcripción de las histonas y miRNAs, muestran un patrón de regulación específica de la etapa de tipo de la célula y la célula del gene expresión9. Aquí, describimos los métodos para definir la modulación mediada por los IDH de miRNA y expresión de mRNA, RSE y diferenciación de la célula de plasma. Estos incluyen protocolos para la inducción de las células B a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma; para el tratamiento de las células B con IDH; y para el análisis de expresión de miRNA y mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq y mRNA-seq10,11,12,8,13.
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Protocol
el protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de la atención institucional del Animal y los comités de uso de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.
1. estimulación de B las células de ratón para RSC, diferenciación de la célula de Plasma y el tratamiento de HDI
- preparación de suspensiones celulares de bazo
Nota: realizar todos los pasos en una campana de flujo laminar excepto ratón eutanasia y disección.- Euthanize los específicos de libre de patógeno C57BL/6J ratón (8-12 semanas de edad) por la inhalación de CO 2.
- Coloque el ratón sobre tablero de disección con el abdomen hacia arriba. Prender las cuatro patas del ratón con agujas hipodérmicas de calibre 18, 1.5 en.
- Esterilizar la piel mediante paños empapado en etanol 70%.
- Utiliza un sistema de autoclave instrumentos quirúrgicos (pinzas y tijeras de disección) para cortar a través de la piel justo debajo de la caja torácica para visualizar el bazo (en el lado izquierdo del abdomen, justo debajo del hígado).
- Utilizar otros estériles pinzas y tijeras tijeras para extraer el bazo, que se encuentra debajo de la curvatura mayor del estómago, bazo de sujeción suavemente con unas pinzas y cortando todo el tejido de conexión con disección. Asegúrese de eliminar todo el tejido conexión.
- Coloque el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 000 μl de medio RPMI1640 completo (Medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal inactivado con calor de 10% (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 μg/mL de penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0.25 μg/mL de anfotericina B y 50 μm de β-mercaptoetanol).
- Colocar un filtro de celular de 70 μm en un tubo de centrífuga cónico polipropileno de 50 mL y vierta el bazo desde el tubo de microcentrífuga en el colador de la célula. Utilice la punta de un tubo de polipropileno de centrífuga cónico de 15 mL para triturar suavemente el bazo a través de la coladera. Enjuague el colador celular con 15 a 20 mL de medio completo.
- Rotación de las células a 350 x g por 5 min y descarte el sobrenadante.
- Eliminar los glóbulos rojos de las suspensiones de células de bazo. Resuspender el precipitado de células en tampón de lisis ACK (5 mL por bazo). Incubar durante 4 min a temperatura ambiente con agitación ocasional y luego apagar con 25 mL de medio completo.
- Vuelta abajo a las células a 350 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 1 o 10 mL de medio completo. Contar las células viables usando un hemocitómetro.
- Aislamiento de células B
Nota: las células de B aislar por selección negativa tras el fabricante ' instrucciones. Las células de B no son objeto de eliminación con biotinilado anticuerpos dirigidos contra células de B no (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) y TER119) y de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Tubo de fondo redondo de- preparar una suspensión de células de 0.25 a 2 mL de 1 x 10 8 células/mL en medio completo en un poliestireno estéril 5 mL (12 x 75 mm). Añadir el suero de rata normal (50 μl/mL) a la muestra.
- Aislamiento de añadir 50 μl/mL coctel a la muestra. Mezcle las células pipeteando suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces e incubar a temperatura ambiente durante 10 min
- Añadir 75 μl/mL recubiertas de estreptavidina partículas magnéticas a la muestra. Mezclar la mezcla transfiriendo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces e incube durante 2,5 min a temperatura ambiente.
- Añadir el Medio RPMI 1640 completo. Mezcle las células pipeteando suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces.
- Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incubar a temperatura ambiente durante 2,5 min vierta fuera el sobrenadante que contiene células B vírgenes en un nuevo tubo cónico de 15 mL.
- Contar las células viables usando un hemocitómetro y tinción de azul de tripano. Evaluar la pureza de las células B por análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie de células B, como B220 y CD19.
- IDH tratamiento y estimulación de células B
- resuspender las células B purificadas en Medio RPMI 1640 completo a una concentración final de 0,3 x 10 6 células/mL.
- Utilizar una placa de cultivo celular 48 pozos para cultivo celular. Para cada bien, añadir 1 mL de la suspensión de células B purificada (0.3 x 10 6 células/mL), LPS (concentración final de 3 μg/mL) de Escherichia coli, IL-4 (concentración final de 5 ng/mL) y 0 o 500 μm IDH (ácido valproico; VPA).
- Incubar a las células a 37 ° C y 5% CO 2 para 60 h para qRT-PCR y análisis de alto rendimiento mRNA y miRNA-secuenciación, o 96 h para análisis de citometría de flujo.
- Flujo cytometry análisis de RSC y la diferenciación de la célula de plasma
- después de 96 h de la cultura, separar las células de cada pozo, pipetear las células arriba y abajo varias veces. Transferir la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Desactivación de las células a 350 x g durante 5 minutos utilizando una centrífuga de mesa y descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células con 100 μl de tampón HBSS que contiene 1% de BSA y 0,5 ng/mL (FITC) fluoresceína - cabra conjugado anti – Anticuerpo IgM de ratón (Ab) , 0,2 ng/mL allophycocyanin (APC)-anti-ratón conjugado rat IgG1 Ab monoclonal (mAb), ficoeritrina ng/mL 0.2 (PE)-conjugado rata anti-ratón B220 mAb, 0,2 ng/mL conjugado con PE Cy7 rata anti-ratón CD138 mAb y 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorescencia (paso 1.4.2) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar las células con 1 mL de HBSS con 1% BSA.
- Rotación de las células a 1.500 x g durante 5 minutos utilizando una centrífuga de sobremesa y descarte el sobrenadante.
- Resuspender las células en 300 μL de HBSS con 1% BSA y transferir la suspensión de células a un tubo de poliestireno fondo redondo. Cubrir el tubo con papel aluminio para evitar la exposición a la luz.
- Realizar análisis de citometría de flujo en una suspensión unicelular. Recoge 50.000 eventos para cada muestra de compensación y 250.000 para las otras muestras. Analizar los datos utilizando el software de equipo.
- Eliminar los desechos y dobletes utilizando una puerta de geometría de pulso (FSC-H x A de FSC y SSC-H x SSC-A). Adecuadamente la parcela en 7-AAD para excluir las células muertas de la puerta.
2. Alto rendimiento mRNA-Seq
- después de 60 h de cultivo, extraer el ARN total de 2-4 x 10 6 células usando un kit de aislamiento de RNA total que puede recuperar ARN pequeño siguiendo el fabricante ' instrucciones. Incluyen una ADNasa paso tratamiento.
- Verificar la integridad del RNA usando un equipo bioanalyzer, después el fabricante ' instrucciones s.
- Uso de 500-1.000 ng de RNA total de calidad (número de integridad del RNA RIN > 8.0) para RNA-seq preparación de biblioteca con un RNA comercial muestra pkit REP siguiendo el fabricante ' instrucciones s.
- Las bibliotecas de cada mRNA-seq basadas en sus porciones respectivas índice de 6 puntos de ebullición de los adaptadores de la piscina y las bibliotecas en secuencia de bp 50 la secuencia. Utilizar un sistema de ADN de alto rendimiento según el fabricante ' protocolos s.
- Después del análisis de la secuencia, desmultiplexar con yuca para generar el fichero fastq para cada muestra. Realizar asignación de lecturas y análisis bioinformática, como anteriormente se describe 11.
- Alinear todas las lecturas de secuenciación con sus genomas de referencia (UCSC ratón genoma construir mm9) usando TopHat2 por defecto configuración 14. Procesar los archivos de bam de alineación HTSeq-count para obtener las cuentas por gen en todas las muestras de.
3. Alto rendimiento miRNA-Seq
- uso 100 ng-1 μg de ARN total de alta calidad, preparados en paso 2.1, para la preparación de biblioteca de pequeños RNA-seq utilizando un kit comercial de RNA-seq pequeño.
- Ligan los 3 degenerados ' adaptador en la 5 ′ extremos de las partida de pequeñas moléculas de ARN con un kit comercial de la ligadura. Ligar el degenerado 5 ' adaptador 3 ′ extremos de las partida de pequeñas moléculas de ARN con un kit comercial de la ligadura. Convertir el RNA a cDNA por la transcripción inversa y amplificación de la pequeña biblioteca de RNA-seq por amplificación por PCR con kits comerciales.
- Use gel 6% TBE nativo página para aislar la pequeña biblioteca de RNA-seq final. Correr el gel con 1 buffer de X TBE a 200 V hasta que el grupo de seguimiento de colorante azul de bromofenol se acerca a la parte inferior del gel (0.5 - 1 cm).
- Quitar el gel de las placas de vidrio y tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/mL en agua) en un recipiente limpio durante 2-3 minutos visualiza bandas de gel en un transiluminador UV u otro instrumento de documentación de gel.
- Corte la banda de ~ 150-bp con una navaja limpia y colóquelo en un tubo de 1,7 mL.
- Extraer el ADN utilizando un kit de extracción de gel según las instrucciones del fabricante.
- Comprobar la distribución de tamaño de la biblioteca final con un análisis de ADN de alta sensibilidad comercial y la concentración con un ensayo de dsDNA comerciales por los fabricantes de ' las instrucciones.
- Las bibliotecas de la piscina para amplificación y una secuenciación posterior con un sistema de secuenciación de ADN alto rendimiento comercial por el fabricante ' protocolos s.
- Demultiplex con yuca para generar el fichero fastq para cada muestra por el fabricante ' protocolos s.
- Para RNA-seq pequeño análisis de cada muestra, utilizar Flicker pequeña alineación de RNA por el fabricante ' protocolos de s.
- Eliminar lecturas que estén alineados a los contaminantes, como las mitocondrias, rRNA, imprimaciones, etc..
- Alinear los datos para madurar miRNA secuencias.
- Alinear los datos en secuencias de lazo de horquilla (precursor miARN).
- Alinear los datos a otros pequeños RNA secuencias (usando la base de datos de fRNA) 15.
- Después de todas las muestras están cuantificadas, definir los miRNAs expresados diferencial entre diferentes grupos y muestras. Predecir miRNAs que las mRNAs o mRNAs que puede ser objeto de un miRNA selectiva con miRNA en línea herramientas de predicción de la blanco, como TargetScan 16, microcosmos 17 PicTar 18 .
- Si es necesario el análisis funcional de la anotación o vía, presentar los genes predichos para análisis de vía ingenio (IPA) o DAVID.
4. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) de mRNAs y miRNAs
- qRT-PCR Análisis del mRNA
- extraer ARN de 0.2-5 × 10 6 células usando un kit total comercial de la aislamiento de RNA que puede recuperar el pequeño ARN, siguiendo la fabricante ' instrucciones. Incluyen una ADNasa paso tratamiento.
- Sintetizar cDNA del ARN total con un sistema de síntesis de primera-strand cDNA usando la cartilla de oligo-dT.
- Cuantificar cDNA por qRT-PCR con iniciadores apropiados, utilizando 2 x mezcla maestra de PCR en tiempo real con el siguiente protocolo: 95 ° C por 15 s, 40 ciclos de 94 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 30 s.
- Realizar adquisición de datos durante la etapa de extensión de 72 ° C y realizar análisis de la curva fusión de 72 a 95 ° C.
- qRT-PCR Análisis de miRNA
- ARN alícuotas de las muestras preparadas en el paso 4.1.1.
- Reverso-transcribir el RNA en cDNA. Utilice un kit de transcripción reversa comercial microARN, después el fabricante ' instrucciones s.
- Realizar PCR en tiempo real para microRNA usando una mezcla maestra SYBR Green en tiempo real PCR con 250 nM miRNA maduros adelante iniciadores junto con una cartilla reversa universal.
Cartilla
- deshielo 2 x PCR Master Mix, miRNA específicos primer avance y retroceso universal a temperatura ambiente. Mezclar las soluciones individuales.
- Preparar una mezcla de reacción como sigue para un volumen de 25 μl por pocillo reacción (utilizado en placas de PCR de 96 pocillos):
2 x PCR Master Mix 12.5 μl
miRNA adelante cartillas (2,5 μM) 2.5 μl
Universal inversa primer (2,5 μM) 2.5 μl
RN μl de ase-libre water5 - añadir 22,5 μL de la mezcla de reacción a una placa PCR de 96 pocillos. Añadir 2,5 μl de cDNA de plantilla (50 ng del pg-3) en los pocillos de la placa individual.
- Sello fuertemente la película de placa. Centrifugar la placa durante 1 min a 1.000 x g y temperatura ambiente.
- Colocar la placa en el cycler en tiempo real e iniciar el siguiente programa ciclismo: 95 ° C por 5 min, 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s.
- Utilizar el método ΔΔCt para análisis de datos de qRT-PCR con una hoja de cálculo. Normalizar la expresión de los miRNAs pertinentes a la expresión de pequeño nuclear/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2 Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 y Snord70/SNORD70.
- Análisis estadístico
- realizar el análisis estadístico para determinar los valores de p por emparejado y desapareado estudiante ' s t - test usando una hoja de cálculo y considerar valores p < 0,05 como importante.
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Representative Results
Usando nuestro protocolo, purificada de células B con LPS (3 μg/mL) e IL-4 (5 ng/mL) para 96 h puede inducir 30-40% de la RSE a la IgG1 y ~ 10% de la diferenciación de la célula de plasma. Después del tratamiento con HDI (500µM VPA), la RSE a IgG1 disminuyó a 10-20%, mientras que la diferenciación de la célula de plasma disminuyó a ~ 2% (figura 1). Inhibición mediada por el IDH de la RSE más fue confirmada por la disminuida cantidad de recombinación posterior Iμ-Cγ1 y madura VHDJH-transcripciones de Cγ1, que son las características distintivas de la RSE completa. Medida por qRT-PCR, la expresión de Aicda, que es crítico para la RSE/SHM, Prdm1 y Xbp1, que son importantes para la diferenciación de la célula de plasma, fueron demostrados para ser inhibida por VPA (figura 2).
La modulación de la expresión de mRNA por IDH en las células de B fue altamente selectiva. Medida por el mRNA-seq en las células B estimuladas con LPS y la IL-4, sólo el 0.3% de estos mRNAs altamente expresados fueron upregulated por IDH más de dos veces y sólo el 0.36% de la altamente expresada (> 20 copias/célula en las células B sin tratamiento IDH) mRNAs, incluyendo Aicda, Prdm1, y Xbp1, fueron reducidos por IDH más del 50% (figura 3).
El downregulation de Aicda Prdm1y Xbp1 expresión potencialmente podría estar mediado por miRNAs, que son reguladores negativos de la expresión génica. Gracias a miRNA a herramientas de predicción (TargetScan.org, miRNA.org y miRbase.org), se identificaron varios miRNAs que puede potencialmente Aicda o Prdm1. El análisis de miRNA-seq de perfiles de miRNA en células B tratados con HDI o nil demostró que IDH selectivamente alza Aicda - y Prdm1 -targeting miRNAs (figuras 4-6).
Figura 1. La expresión superficial de la célula de B marcador B220 superficie anticuerpos IgG1 y marcador de células plasmáticas CD138 fueron analizadas por citometría de flujo.
B220+ IgG1+ las células eran las células de B a IgG1. B220bajaCD138+ las células eran las células de plasma. El porcentaje de las células de B cambia de IgG1 y las células plasmáticas de las células B estimuladas con LPS y la IL-4 en presencia de nil o HDI (VPA, 500 M) de 96 h se indican como números dentro de las puertas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Expresión de características de RSE completa; madura VHDJH-Cγ1 transcripciones y transcripciones de recombinación posterior Iμ-Cγ1; Aicda, Prdm1y Xbp1 fueron analizados por qRT-PCR, normalizado de las transcripciones de Cd79b , y se muestra en un histograma.
Expresión génica en las células B estimuladas con LPS y la IL-4 en presencia de 500 μm de VPA y relevantes para la expresión de genes en B las células con los mismos estímulos en presencia de nil se representaron como 1. Los datos son de tres experimentos independientes. valores de p , pares t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las células B estimuladas con LPS y la IL-4 y HDI (VPA, 500 μm) o cero para la expresión de mRNA de 60 h. fue analizada por mRNA-SS.
(A) niveles de expresión de mRNA promedio en tres experimentos independientes (lecturas por kilobase por millón lecturas asignadas, RPKMs) fueron representados en diagramas de dispersión. Cada parcela corresponde a un nivel individual de expresión de mRNA. Las dos líneas discontinuas son dos líneas. Dispersión de parcelas sobre la línea punteada superior o por debajo de la parte inferior línea discontinua indica mRNAs que expresan más de dos veces o menos de la mitad cuando inducida por VPA y cero, respectivamente. (B) los gráficos de barras muestran la variación promedio en los niveles de expresión de mRNA (RPKMs promedio de tres experimentos independientes) en LPS y células B estimuladas por IL-4 tratadas con HDI, en comparación con ésos en las células de B trataron con nada. Sólo los mRNAs en un RPKM promedio > 20 LPS y B IL-4-estimulado las células tratadas con nil están incluidas. La expresión del mRNA en cada experimento individual, como se muestra en un diagrama de dispersión (C) o un gráfico de barras (D), se representan de la misma forma como en (A) y (B). valores de p , pares t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Las células B estimuladas con LPS y la IL-4 y HDI (VPA, 500 μm) o nula expresión de miRNA h. 60 fue analizada por miRNA-SS.
(A) el cambio en los niveles de expresión de miRNA promedio en tratados con HDI en comparación con las células de B que en las células de B tratados con nil fueron representados por gráficos de barras. Las células (B) el cambio en los niveles de expresión de miRNA en B tratadas con HDI en comparación con que en las células de B trataron con nulo en tres experimentos independientes fueron representadas por gráficos de barras. Sólo los miRNAs en promedio RPM > 0.5 LPS y B IL-4-estimulado las células tratadas con nil están incluidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. IDH aumenta la expresión del Aicda-dirigidas a los miRNAs, como se muestra por miRNA-SS.
(A) secuencia de alineación de los miRNAs y sus sitios de destino en el 3' UTR de los mRNAs Aicda . (B) las células de B fueron cultivadas con LPS y la IL-4 en la presencia o ausencia del IDH (VPA, 500 M) de 60 h. La expresión de los miRNAs que se predijo al destino Aicda 3' UTR fueron analizados por miRNA-seq y representado como RPM. valores de p , pares t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. IDH aumenta la expresión del Prdm1-dirigidas a los miRNAs, como se muestra por miRNA-SS.
(A) secuencia de alineación de los miRNAs y sus sitios de destino en el 3' UTR de Prdm1 mRNAs. (B) las células de B fueron cultivadas con LPS y la IL-4 en la presencia o ausencia del IDH (VPA, 500 M) por 60 h. expresión de los miRNAs que se pronosticaban para Prdm1 3' UTR fueron analizados por miRNA-seq y representado como RPM. valores de p , pares t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona enfoques integrales para inducir el cambio de clase de la célula de B y la diferenciación de la célula de plasma; analizar sus efectos epigenéticos moduladores, es decir, IDH; y detectar el efecto del IDH en la expresión de mRNA y miRNA en estas células. La mayoría de estos enfoques puede utilizarse también para analizar el impacto del factor epigenético humano expresión de función y mRNA/miRNA de células B. Los enfoques de mRNA-seq/miRNA-seq y qRT-PCR también pueden utilizarse para analizar células B aisladas de ratones tratados con epigenéticos moduladores, como el IDH.
El módulo epigenético puede afectar muchas funciones de diferentes células, como la proliferación celular y la viabilidad, que podría afectar la diferenciación de la RSE y la célula de plasma. Por lo tanto, debe analizarse la proliferación celular, viabilidad y los ciclos celulares de las células B, con o sin tratamiento de IDH. Uno de los desafíos para el análisis de la modulación de la expresión de mRNA y miRNA IDH u otros reguladores epigenéticos por qRT-PCR es elegir una adecuada limpieza gene o ARN pequeño. Muchos genes comunes de limpieza pueden ser modificados en diversos grados por epigenéticos moduladores. Los niveles de expresión de muchos genes diferentes de limpieza deben medir y utilizados para normalizar la expresión de genes específicos mediante qRT-PCR. Este problema también puede ser abordado por mRNA-seq y miRNA-seq, donde la expresión de mRNAs individuales o miRNAs puede ser normalizada por los niveles de mRNA o miRNA de genoma.
MARN-seq no sólo puede definir el perfil de expresión de mRNA con un pipeline bioinformática apropiado, pero este enfoque también puede definir el perfil de RNA (lncRNA) larga noncoding. mRNA-seq típicamente implica el enriquecimiento de poly(A) + ARN por la selección de oligo(dT). Como un número de lncRNA conocen a la falta de colas de poly(A), el enfoque de mRNA-seq con selección de oligo (dT) no puede determinar la información completa de expresión lncRNA. Con el fin de lograr una cobertura completa de perfiles de expresión de mRNA y lncRNA, debe utilizarse un enfoque de RNA-seq con agotamiento del rRNA. En la mayoría de nuestros experimentos, utilizamos un kit comercial para extraer el ARN total, incluyendo miRNA, miRNA-seq, mRNA-seq y qRT-PCR. Antes de construir una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento, la calidad del RNA total se valida mediante la ejecución de una alícuota en un sistema de control de calidad automatizado RNA, DNA y proteínas muestra. Se recomienda que las muestras de RNA tienen un RIN número de 7.0 o superior si han de utilizarse para la preparación de biblioteca de RNA pequeño. Muestras con números más bajos del RIN tienen un mayor porcentaje de productos degradados de RNA en el rango de tamaño de las especies de RNA pequeño (15-30 nucleótidos). Cuando el número RIN está por debajo de 7.0, la cobertura no será tan buena. Otra opción para las muestras de RNA menos que ideal es realizar una aproximación de agotamiento de rRNA en lugar de un enfoque de aislamiento del mRNA, pero esto requiere que las muestras sean al menos 10 ng/mL.
Los protocolos de mRNA-seq utilizada aquí están optimizados para 100-1.000 ng de RNA total. Para miRNA-seq con menos de 100 ng de RNA total, preparación de biblioteca de pequeños RNA-seq debe seguir un más sensibles pequeños RNA-seq preparación protocolo, que se aprovecha de la estructura común a la mayoría de las moléculas de microARN conocido. MiRNAs más maduros tienen un 5'-fosfato y un grupo 3'-hidroxilo como resultado de su camino de la biogénesis. Debido a esto, los adaptadores de 3' y 5' en este kit se unen directamente a miRNAs.
Para analizar el impacto del IDH en células B mRNA y miRNA expresión en vivo, ratones pueden tratarse con VPA u otros IDH añadiendo este HDI para el agua potable y la inyección intraperitoneal de estos ratones con antígenos t-dependientes CGG NP o T-independiente el antígeno LPS NP se puede realizar. Las células B pueden ser purificadas del bazo 10 días después de la inmunización.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH 105813 AI y AI 079705 (para PC), la Alianza para la identificación de objetivos de investigación de Lupus en Lupus Grant ALR 295955 (para PC) y la investigación de la Fundación Nacional de investigación de la artritis otorga (en HZ). TS fue apoyado por el centro médico de Pediatría, Hospital de Xiangya segundo, Central South University, Changsha, China, en el marco del programa de visitas de Xiangya UT escuela de Medicina San Antonio estudiante de medicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
References
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