Summary
Detta manuskript ger protokoll som använder i livmodern elektroporering (IUE) för att beskriva den strukturella anslutning av nervceller vid encelliga nivå och retbarhet av fluorescerande nervceller. Histologi används för att karakterisera dendritiska och axonal prognoser. Hela-cell inspelning i akuta skivor används för att undersöka retbarhet.
Abstract
Nervsystemet består av ett enormt utbud av olika neuronala typer. Dessa neuronala subpopulationer kännetecknas av, bland andra funktioner, deras distinkta dendritiska morfologier, deras specifika mönster av axonal anslutning, och deras selektiva skjut svar. De molekylära och cellulära mekanismer som är ansvariga för dessa aspekter av differentiering under utveckling fortfarande dåligt kända.
Här beskriver vi kombinerade protokoll för märkning och karakterisera den strukturella anslutningsmöjligheter och retbarhet kortikala neuroner. Ändring av protokollet i livmodern elektroporering (IUE) kan märkningen av en gles befolkning av nervceller. Detta i sin tur gör det möjligt att identifiering och spårning av dendriter och axoner av enskilda nervceller, exakt karakterisering av den laminära lokaliseringen av axonal prognoser och morfometrisk analys. IUE kan också användas för att undersöka förändringar i retbarhet avvild-typ (WT) eller genetiskt modifierade nervceller genom att kombinera den med helcells-inspelning från akut skivor electroporated hjärnor. Dessa två tekniker bidra till en bättre förståelse för kopplingen av strukturell och funktionell uppkoppling och av de molekylära mekanismer som styr neuronal mångfald under utveckling. Dessa utvecklingsprocesser har viktiga konsekvenser för axonal ledningar, den funktionella mångfalden av nervceller, och biologi kognitiva störningar.
Introduction
Utvecklingen av dendritiska och axonal strukturer är en viktig aspekt av kretsreglering i nervsystemet, bland annat i hjärnbarken. Den spelar en avgörande roll under den selektiva ledningar av de olika neuronala subpopulationer. Ett antal nya rapporter har visat att förutom anslutning, är den molekylära mångfalden av nervceller som reflekteras av förvärvet av mycket specifika typer av bränning. Men de mekanismer som bestämmer retbarhet och anslutning av de distinkta neuronala subtyper under utveckling, liksom deras grad av samordning, fortfarande dåligt kända 1, 2.
In vivo förlust- och få-av-funktion analyser möjliggör studier av förhållandet mellan uttrycksnivån av specifika gener och deras inflytande i utvecklingen av kretsen. I livmodern elektroporering (IUE) är en teknik som används i stor utsträckning för att studerafunktionen av en gen av intresse i specifika neuronala populationer och att studera de övergripande mönster av deras anslutning. Men för att bestämma morfologiska egenskaperna hos axoner och dendriter i kortikala skikt i levande möss, är det viktigt att märka nervceller glest. En Cre rekombination kombinerat med IUE kan användas för att markera en gles befolkning av nervceller vid en tillräckligt låg densitet för att lösa de prognoser som avges av enskilda celler i de identifierade kortikala lamellerna. Denna metod etiketter ett tillräckligt antal neuroner per cortex att få kvantitativa data efter analys av rimliga mängder electroporated hjärnor (Figur 1). Detta manuskript presenterar en metod för sådan fin analys av anslutning. Den presenterar också en liknande strategi för att analysera, i separata experiment, de elektriska egenskaperna hos nervceller genom att utföra strömkläm inspelningar på grönt fluorescerande protein (GFP) -electroporated celler från akut kortikala skivor. dessa protokoler är mångsidiga och kan användas för att studera i retbarhet och anslutning av neuroner i WT och transgena djur, och även neuroner där vinster och förluster på funktion införs genom ytterligare plasmider under IUE.
Även om detta protokoll beskriver elektroporering av möss vid embryonal dag (E) 15,5, kan denna teknik utföras vid alla åldrar mellan E9.5 3 och postnatal dag (P) 2 4. Medan elektroporering i tidiga skeden riktar neuroner och förstadier i thalamus och djupa lagren av hjärnbarken, senare skede elektroporation märken mer ytliga skikt (t.ex. E15.5 IUE mål skikt II-III neuroner). Sammanfattningsvis är kombinationen av IUE med encelliga morfologisk analys och elektro ett användbart verktyg för att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom den enorma strukturella och funktionella mångfald av nervceller i nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av regionen Madrid Animal Care och användning kommittén, i enlighet med nationell och europeisk lagstiftning (PROEX 118/14, PROEX 331/15). Bibehålla sterila betingelser under förfarandet.
1. I livmodern elektroporering
OBS: Detta protokoll för IUE är anpassad från andra som har tidigare publicerats 5, 6, 7. Detta manuskript beskriver ett protokoll för IUE av E15.5 embryon, med ändringar i reportern strategi som gör det möjligt att studera morfologi av enskilda nervceller 8 och deras elektrofysiologiska egenskaper i ett separat experiment med användning av standard GFP reporter plasmider.
- Förbereda DNA
- Förbereda DNA-plasmider med användning av en endotoxinfritt isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner och späda ut dem i 1x phosphate-buffrad saltlösning (PBS).
- För encelliga märkning, förbereda 10 mikroliter av DNA-blandningen per kirurgi (1 mikroliter per embryo) med följande konstruktioner och slutkoncentrationer: plasmid som kodar för ett fluorescerande protein reporter (t.ex. CAG-DsRed2 9), ett mikrogram / mikroliter som en kontroll för elektroporering effektivitet; experimentell plasmid som skall testas, typiskt vid ett pg / pL; LoxP-stop-LoxP-fluorescerande protein plasmid (CALNL-GFP 10), ett mikrogram / mikroliter; och konstruera kodande Cre 10, 1-4 ng / mikroliter. Tillsätt 1 mikroliter av 0,1% Snabb Green i vatten (vikt / volym) för att visualisera den injicerade DNA.
OBS: Cre-rekombination av GFP-konstruktionen förekommer endast i ett fåtal neuroner, som möjliggör visualisering och rekonstruktion av enskilda axonala projektioner (Figur 1A). - För vanliga patch-clampundersökningar, förbereda 10 mikroliter av DNA-blandningen per operation (1 mikroliter per EMBRyo) av följande plasmid som kodar för ett fluorescerande protein (t.ex., CAG-GFP 11), 1 | ig / | il som reporter kontroll; experimentell plasmid, vanligtvis 1 mikrogram / mikroliter; och en mikroliter av 0,1% Snabb Grönt i vatten (vikt / volym).
OBS: Detta är standard elektroporering förhållanden som analyserar akuta skivor som innehåller ett stort antal märkta excitatoriska neuroner inom det önskade lamina. För att utföra patch-clamp studier på enstaka celler, förbereda DNA såsom beskrivs i steg 1.1.1.1.
- För encelliga märkning, förbereda 10 mikroliter av DNA-blandningen per kirurgi (1 mikroliter per embryo) med följande konstruktioner och slutkoncentrationer: plasmid som kodar för ett fluorescerande protein reporter (t.ex. CAG-DsRed2 9), ett mikrogram / mikroliter som en kontroll för elektroporering effektivitet; experimentell plasmid som skall testas, typiskt vid ett pg / pL; LoxP-stop-LoxP-fluorescerande protein plasmid (CALNL-GFP 10), ett mikrogram / mikroliter; och konstruera kodande Cre 10, 1-4 ng / mikroliter. Tillsätt 1 mikroliter av 0,1% Snabb Green i vatten (vikt / volym) för att visualisera den injicerade DNA.
- Förbereda DNA-plasmider med användning av en endotoxinfritt isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner och späda ut dem i 1x phosphate-buffrad saltlösning (PBS).
2. Förberedelse för kirurgi
- Utför en överlevnads kirurgi med hjälp av aseptisk teknik. Säkerställa sterila förhållanden, inklusive masker, handskar, instrument och kirurgiska området. Sterilisera kirurgiska instrument (skalpell, Adson tång, härdade fina sax, böjd sax, Dumont pincett, och nålhållaren).
- Välj borosilikatglas kapillärer av 1 / 0,58-mm ytter / innerdiameter. pull capillaries 3. Rikta för en optimal spets längd av 1 cm efter att ha dragit. Skär nålspetsen vid ungefär en 30 ° vinkel med fin pincett (Figur 1B).
- Förbereda 500 ml steril isoton lösning (1 x PBS eller Hank's balanserade saltlösning (HBSS)). Lägg penicillin-streptomycin 1: 100 och värma denna lösning till 37 ° C. Det kan lagras vid 4 ° C efter operationen.
- Subkutant injicera en preoperativ dos av smärtstillande medel (t.ex. karprofen, 5 mg / kg kroppsvikt).
- Hålla djuren varma för kirurgi genom att placera dem på en värmedyna. Värm en ren bur till 37 ° C för postoperativ återhämtning.
3. kirurgi
- Söva en C57BL / 6 E15.5 gravid mus med isofluran. Först ingjuta en sluten kammare med 3% isofluran på 0,8 l / min syre och lämna musen inne tills det sover. Överför musen till en värmedyna och placera näsa och mun i en mask för att levereray av isofluran. Gradvis minska anestesi under loppet av operationen till 1,5% isofluran via mask. Bekräfta korrekt anesthetization genom att observera en förlust av pedal reflex (toe nypa). Den optimala procedur tar ungefär 20 minuter och inte mer än 45 minuter.
- Applicera ögonsalva för att förhindra ögonen från att torka under förfarandet.
- Ta bort hår från en ~ 3-cm-regionen av buken (med användning av antingen en elektrisk rakapparat eller hårborttagningskräm). Tvätta det kirurgiska området med bomullspinnar infunderas med 70% etanol, följt av en jod-infunderas bomullspinne. Upprepa tre gånger.
- Täck operationsområdet med steril gasbinda för att förhindra infektioner.
- Använda skalpell för att göra en vertikal öppning genom huden 2 cm långt och parallellt med mittlinjen. Separera huden och musklerna i buken med trubbiga böjd sax. Håll muskeln med pincett och skär den genom linea alba att exponera bukhålan.
- Leta embryon med hjälp of tången. Fukta två våta bomullspinnar med den sterila saltlösningen som framställts i steg 2,3 och använda dem för att manipulera en tillgänglig embryo ut ur öppningen. Placera bomullspinnar runt embryot och försiktigt extrahera båda livmoderhornen från bukhålan. Hålla embryon och den öppnade bukhålan hydratiseras med varm koksaltlösning under hela förfarandet för att hindra dem från att torka ut.
4. Injektion av DNA och elektroporation
- Manipulera embryona försiktigt med fingrarna för att lokalisera telencephalon (klart kan visualiseras genom ögat som de två fler anteriora vesiklar av hjärnan). Placera en förberedd borosilikat kapillär i en mun pipett. Passera spetsen på nålen genom livmodern, undvika blodkärl, tills den når en laterala ventrikeln. Långsamt injicera cirka 1 mikroliter av Snabb grön-färgade DNA-lösningen till dess en stor blå fläck observeras.
- Placera 7 mm platinaelektroder i sidled på the chef för embryot (Figur 1C).
OBS: DNA är negativt laddad; därför, rör den sig mot den positiva elektroden, när spänning appliceras mellan platinaelektroder. Genom att variera placeringen av elektroderna kan olika områden i hjärnan riktas. - Applicera spänning via platinaelektroder (för E15.5 embryon. 5 pulser, 38 V, 50 ms intervall cykellängd, 950 ms intervall paus Dessa villkor varierar beroende på utvecklingsstadiet) 12.
OBS: Se Tabell 1 för spänningsförhållanden och elektroder för olika embryostadier. - Upprepa steg 4,1-4,3 för varje embryo.
5. Slutet av kirurgi och Postoperation
- Använd tops att manipulera livmodern tillbaka in i modern. Fylla bukhålan med det uppvärmda saltlösningen (tillsätt ca 2 ml).
- Sutur muskeln med enkla avbrutna stygn eller en kontinuerlig söm. Använd # 6-0 suturs.
- Använd häftklamrar att stänga yttre sår. Var noga med att separera huden från muskeln innan häftning. Ta bort näsmask.
- Tillåt musen för att återhämta sig under 30 min i den uppvärmda, ren bur innan den placeras i djuranläggningen rummet. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Placera inte ett djur som har genomgått kirurgi i sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
- Övervaka djuret under dagarna efter operationen. Applicera analgetika subkutant (carprofen, 5 mg / kg kroppsvikt) var 12 h för 2 dagar eller i enlighet med djurlagstiftning. Ingen ytterligare postoperativ vård krävs för valparna.
6. Beredning och analys av prov
- Tillval: På P2, kontrollera uttrycket av fluorescens i electroporated valpar med hjälp av en fluorescerande mikroskop; när IUE är framgångsrik, kan fluorescens tydligt ses in huvudet 13. Mark eller separera möss som är positivt elektro för användning i de följande stegen. Håll dammen och valpar i standarddjuranläggning förhållanden.
- Vid den önskade stadiet av studien, BEGJUTA mössen transcardially. Typiskt, den mest aktiva fasen av dendritiska och axonal tillväxt motsvarar de tre första postnatal veckor 2, 14, 15.
- Förbered 30 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS per mus och kyla den på is.
VARNING: PFA är ett känt allergen och cancerframkallande. Den är giftig. Bär lämplig personlig skyddsutrustning.
OBS: Den mängd PFA behövs beror på åldern hos musen (t.ex. för P16, 20 ml för perfusion och 10 ml för postfixation behövs). - Förbered en ketamin-xylazin mix att söva djuret med en 1: 1: 8 volymförhållande av 100 mikrogram / ml ketamin: 100 | j, g / ml xylazine: PBS (förbereda cirka 0,2 ml per mus).
- Söva musen genom intraperitoneal injicering av 0,2 ml av blandningen framställd i steg 6.2.2.
- Placera sövda musen på rygg. Gör ett horisontellt snitt ovanför thorax med hjälp av en skalpell. Skär muskeln och membranet med fin sax tills hjärtat kan observeras.
- Gör ett snitt i högra atrium med de fina saxar. Injicera långsamt 20 ml PBS i den vänstra ventrikeln med en 25-gauge nål för att avlägsna blodet. Injicera 20 ml PFA (steg 6.2.1) tills musen är stel och organen blir vita.
- Omedelbart ta bort huvudet och gör en mittlinje snitt i huden från halsen till skallen. Dra försiktigt bort skallen med böjda pincett och extrahera hjärnan. Var särskilt noga med att inte punktera eller skada hjärnan under avlägsnandet av skallen. Sätta hjärnan i 10 ml 4% PFA vid 4 ° C över natten med postfix den.
- Förbered 30 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS per mus och kyla den på is.
- Cryoprotect fasta hjärnor i 10 ml 30% sackaros i PBS vid 4 ° C under 1 - 2 dagar, tills de sjunker. Förbereda en cm 3 aluminiumfolie kuber. Fyll kuber 2/3 av vägen med oktober Sätt hjärnorna inuti och frysa dem genom att sätta kuberna på torris. Förvara frysta hjärnor vid -80 ° C.
- Placera droppe oktober på ytan av provet skivan skala aluminiumfolie från histologi kuben, och placera kuben i den önskade orienteringen till provskivan ovanpå vätskan oktober Applicera fast tryck tills den är fast. Sätt preparatskivan i preparathuvudet av kryostaten. Orientera preparatet (flytta den till ett gynnsamt läge i förhållande till kniven / bladet).
- Avsnittet hjärnan på kryostaten. Välj 50-100 um tjocka flyt kryosnitt 16 med hjälp av en fin pensel och placera dem i PBS.
- Färga om så önskas.
OBS: För studien av axonal morfologi, färgning med en GFP antikropp rekommenderas- Blockera sektionerna under 1 h vid rumstemperatur med 5% fetalt bovint serum i PBS innehållande 0,5% Triton-X 100 (blockeringslösning). Inkubera över natten vid 4 ° C med 1: 500 primära antikroppen (t.ex., kanin-anti-GFP) utspätt i blockeringslösning.
- Tvätta sektionerna tre gånger i PBS. Lägg 1: 500 sekundär antikropp (t.ex. get-anti-kanin-Alexa Fluor 488) utspätt i blockeringslösning och inkubera under 1 h vid rumstemperatur. Tvätta sektionerna tre gånger i PBS.
- Motfärga med DAPI (1: 10000) i PBS innehållande 0,5% Triton-X 100 under 10 min. Skölj delarna med PBS. Montera sektionerna i en vattenmonteringsmedium 16.
7. Imaging och analys
- Fluorescens eller konfokalmikroskopi
- Att rekonstruera hela neuroner, förvärva bilder med en hög förstoring (åtminstone 40X) och hög upplösning (minst 1024 x 1024). Välj "Tile scan "eller motsvarande alternativ i förvärvet programvara för att täcka området av intresse, som spänner över alla dendriter och axonal processer. Skaffa ett tillräckligt antal staplar på z-axeln för att undvika en förlust av information.
OBS: I allmänhet har mikroskopet programvara en "Optimerad stack" alternativet, men om så inte är fallet, testar manuellt för att bestämma hur många steg är nödvändiga för bilderna att överlappa för att korrekt definiera enskilda projektioner. Två viktiga parametrar är hål och målet; beakta "högre förstoring, högre upplösning, och mer nödvändigt z-steg."
- Att rekonstruera hela neuroner, förvärva bilder med en hög förstoring (åtminstone 40X) och hög upplösning (minst 1024 x 1024). Välj "Tile scan "eller motsvarande alternativ i förvärvet programvara för att täcka området av intresse, som spänner över alla dendriter och axonal processer. Skaffa ett tillräckligt antal staplar på z-axeln för att undvika en förlust av information.
- Analys
OBS: Trots att flera parametrar kan analyseras, steg 7.2.1 fokuserar på två: dendrit morfologi och Axon förgrening. Hämta Fiji ( http://fiji.sc/ ).- Öppna bilden, välj "segmenterad linje" alternativ från menyn. Rita en linje (rör sig upp och ner längs the z-axeln genom att rulla musen) enligt uppställningen av neuron. Gå till "Analysera, Verktyg, ROI Manager Add" (alternativt, tryck "t") för att spara linjen. Upprepa denna process för varje axon eller dendrit av det analyserade neuron 2.
- I ROI Manager-menyn genom att trycka på "Measure" för att få längden (eller ytterligare parametrar). Exportera mätningarna till en textfil eller ett kalkylblad för att analysera dem.
8. Elektrofysiologi
OBS: Målet med detta protokoll är att få helcells-ström clamp inspelningar från skikt II / III pyramidala cell nervceller identifieras visuellt genom GFP-uttryck i GFP-elektro mushjärnor (eller någon annan fluorescerande protein tidigare elektro). Det är en anpassning av tidigare publicerade metoder 17, 18. Användning av detta protokoll är det möjligt att studera effekten av en genetisk modifblue introducerades av IUE på de elektriska egenskaperna hos neuron. Förvärvet av specifika bränning lägen är en gradvis process av differentiering som innebär dynamiska uttryck för en bred repertoar av jonkanaler och som resulterar i uttrycket av övergående skjutlägen före slutet efter födseln. Till exempel är mogna elektriska svaren inte observerats i lager II / III i somatosensoriska mus cortex före P16 2, 19.
- Förutsättningar för akut skivor
- Förbered sterila kirurgi verktyg för att ta bort de hjärnorna från mössen: en giljotin, för att ta bort huvudet; en liten sax, för att skära genom skallen; pincett, för att separera skallen från vävnad; en spatel, för att försiktigt ta bort hjärnvävnad från dess hölje; en metallisk slicer, att dissekera cortex i två lika stora delar; och en pasteurpipett, att förflytta skivorna från vibratome (placera dem i en lösning innehållande artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för inspektion, och sedan överföra skivorna från ACSF till en inkubationstid uppehållsområdet).
- Förbereda ett L av ACSF med användning av vatten av hög renhet (dubbeldestillerat vatten) innehållande 119 mM NaCl, 26 mM NaHCOs 3, 11 mM glukos, 2,5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 och 1 mM NaH 2 PO 4. Titrera pH till 7,3-7,4 med HCl eller NaOH. Justera osmolaritet till 290 mOsm.
- Bubbla ACSF med karbogen (95% O2 / 5% CO2) under 15 - 20 min med användning av Teflon-rör (~ 1 mm), för att stabilisera pH till 7,3-7,4.
- Frysa 200 ml ACSF lösning mättad med karbogen vid -80 ° C under 10 - 15 min för att generera en slaskig dissektion lösning. Placera en 100- x 20 mm vävnadsodlingsskål på is för att skära hjärnan.
- Bereda 100 ml av 1% låg smältpunkt agaroslösningen strax före starten av experimentet. Kyl lösningen, skära ut en fyrkantig bit agaros (dimensioner: 1 x 1 x 0,5 mm), och superlim det tillbaksidan av plattformen, precis bakom där hjärnan skivas (agarosgel ger stöd för hjärnan under skärning). Göra den främre så platt som möjligt.
- Erhålla akut skivor
- Immobilisera musen och bedöva det med isofluran 2%. Placera huvudet i giljotinen öppningen och halshugga det snabbt. Ta bort dess skalle så snabbt som möjligt med hjälp av ben rangers eller fin pincett. Sätt hjärnan i kylda ACSF.
OBS: Det är viktigt att utföra detta steg snabbt. - Placera hjärnan i kylt odlingsskålen. Skär av lillhjärnan med en liten sax.
- Plocka upp hjärnan med en spatel och torka den torr på en pappershandduk.
- Limma ventrocaudal plan av hjärnan på en vibratome hållare. Placera hållaren på en vibratome fylld med iskallt ACSF.
- Skaffa akut skivor genom att skära 300-im koronala sektioner (säkerställa fortsatt carbogenation under hela förfarandet, till exempel, placera en bubbel (1 mmpolytetrafluoretylen rör) i vibratome kammaren) med följande Vibratome inställningar: 0,06 mm amplitud och 0,08 till 0,10 mm / s hastighet. Ställ förskottet till lägsta möjliga hastighet (~ 22 s per pass). Ändra dessa optimala inställningar och få optimala förutsättningar för varje maskin empiriskt vid behov.
- Inkubera akut skivor under minst 60 min i ACSF kompletterat med 3 mM myo-inositol, 0,4 mM askorbinsyra, och 2 mM natriumpyruvat under bubbling med 95% O2 / 5% CO2 gas. Hålla temperaturen vid 25 ° C.
- Utföra skivning förfarande på mindre än 15 min. Om så önskas, kan skivorna lagras för 1 - 7 h innan de överförs till inspelningen kammaren för användning.
- Immobilisera musen och bedöva det med isofluran 2%. Placera huvudet i giljotinen öppningen och halshugga det snabbt. Ta bort dess skalle så snabbt som möjligt med hjälp av ben rangers eller fin pincett. Sätt hjärnan i kylda ACSF.
- Förutsättningar för helcells-inspelning
- Kontrollera att elektro stationen är utrustad med en inspelning kammare, en perfusion system, ett mikroskop, elektroder (inspelning, stimulerande och jord), makro- och micromanipulators, en stel vibrationsbeständig bordsskiva och Faradays bur, en stimulator, en förstärkare och analog-till-digital (A / D) omvandlare, en dator med förvärv programvara, och en GFP (eller någon annan fluorokrom) filter för att analysera genetiskt modifierade neuroner 18 (Figur 2A).
- Förbereda den intracellulära lösning, innehållande 115 mM kalium glukonat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na 2 ATP och 0,3 mM Na 3 GTP, justerad till pH 7,2 med KOH och till 290 mOsm genom KCl.
- Gör patch pipetter genom att dra borosilikatglas kapillärer. Förbered lappelektroder med hjälp av en mikropipett avdragare. Använd borosilikat kapillärer (1,5 mm yttre diameter, 0,86 mm innerdiameter, 10 cm längd). Göra lappelektroder som visar resistanserna för 3-10 Mohm när den är fylld med intracellulär lösning.
- BEGJUTA inspelningen kammaren med ACSF med en hastighet av 2 ml / min. Bibehålla temperaturen hos kammaren vid approximbart 33 ° C.
- Helcells-inspelning
- Överför skivor i inspelningen kammaren med hjälp av en pasteurpipett (avbröt lång spets) eller en liten borste. Håll ned skiva med en harpa. Perfundera skivorna ständigt med ACSF med en hastighet av 2 ml / min.
- Lappa en GFP-positiva neuron.
- Sätta skiva i inspelningen kammaren och hitta det område av intresse genom mikroskopet vid låg förstoring (10X). Sedan hitta en GFP-positiva cellen till lappa använda 60x mål.
- Fyll inspelningen elektroden med intracellulär lösning. Använder sprutan kopplad till filtret (4-mm filter) och mikro-loader spets för att fylla inspelningen elektroden med intracellulär lösning.
- Placera glaspipett i pipetten hållaren. Placera pipettspetsen i badet och fokusera på spetsen. När pipetten är i badet, applicera positivt tryck genom den bakre tryckstyrsystem.
- Lappa en neuron som är fluorescerande (Figure 2B).
- Närma cellen av intresse under visuell vägledning under bibehållande mottryck i pipetten. Vid uppkomsten av en liten grop på cellytan, släpper trycket. Vid denna punkt, kan en tät förslutning (resistans större än 1 GΩ) bildas. Annars applicera en lätt undertryck (sug) för att underlätta den.
- Medan tätningen formas, bringa hållspänning klämman till -60 mV. När väl GΩ försegling bildas, applicera en puls av sug för att spräcka cellmembranet under pipetten och gå in helcells-läge. Se referens 20 för mer information.
- Registrera aktiviteten med hjälp strömklämförhållanden 21. En gång i helcells-läge, växlar från spänning-klämma till strömklämläge och starta inspelningen. Till exempel, för att spela in cell retbarhet, tillämpas 500 ms-lång depolariserande aktuella injektioner (100-400 Pa).
- Beräkna bränning priser by plottning av antal verkningspotentialer utmed tåget för att öka ingångsströmmar.
OBS: Vila membranpotential, input motstånd, och membran kapacitans kan också beräknas från inspelningarna 21.
- Beräkna bränning priser by plottning av antal verkningspotentialer utmed tåget för att öka ingångsströmmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att karakterisera de morfologiska förändringar av nervceller i detalj och hela utveckling, är det viktigt att märka nervceller glest. En Cre-rekombinas utspätt system möjliggör uttryck av en gen av intresse i en gles befolkning av nervceller, så att endast de nervceller som innehåller detta enzym uttrycka GFP (Figur 1A). Med hjälp av denna strategi är skiktet II-III riktade och märkt av IUE vid E15.5. CAG-DsRed2 vid 1 mikrogram / mikroliter, är co-elektro som en kontroll och att identifiera positiva electroporated hjärnor i levande djur. Viktigt, efter färgning med anti-GFP-antikropp, är tillräckligt stark för att möjliggöra tydlig visualisering av sina dendritiska morfologi och axoner (figur 1D och E) signalen.
Efter IUE och elektro är analysen av de parametrar som erhållits från helcells-inspelningar för att samarbetaMpare tänd svar och retbarhet elektroporerade celler under olika förhållanden. Flera parametrar kan erhållas. Parametrarna bör anpassas till de särskilda studie med specifik patch-clamp analysprogram. Figur 2C är ett exempel på tomten av aktionspotentialer mot inströmmen erhållits från inspelningar av en WT skiktet II-III neuron som elektro vid E15.5.
Figur 1. En Cre-rekombinas Utspädd strategi möjliggör Glesa märkning av kortikal nervceller. A. Schematisk översikt över strategin. I neuroner som bär både CALNL-GFP och CRE är LoxP-STOP-LoxP kassetten skars ut ur CALNL-GFP, och GFP uttrycks av den starka CAG-promotorn. B. Schematisk bild av en borsilikat kapillär drog med hjälp av en mikropipett avdragare. Spetsen skärs av forceps, vilket skapar en 30 ° vinkel. Mäta 1 cm från spetsen till början av den smalare delen av kapillären. C. Placering av elektroderna att rikta somatosensoriska cortex. De platinaelektroder är placerade ungefär över öronen av embryot. På grund av dess negativa laddning, går DNA mot den positiva elektroden, när spänningen appliceras. Variation i placeringen av elektroderna kan rikta olika områden i hjärnan. D. Bilder erhållna efter vektorer levererades till lager II-III neuroner genom i livmodern elektroporering vid embryonal dag 15,5; koronala sektioner gjordes vid postnatal dag 16. CAG-DsRed2 vektorn samtransfekterades som en kontroll (vänster). GFP (mitten) uttrycks endast i de nervceller som också införlivade Cre, vilket tillåter rekombinationen av de loxP-ställen i CALNL-GFP-vektorn. Den glesa märkning tillåter enskilda nervceller att särskilja (pilspetsar). E. hög förstoring konfokala bild av than dendritiska hållare av annan glest märkt GFP neuron. Skalstrecken = 100 ^ m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Elektrofysiologi inställningar och Exempel på en Firing Response. A. Fotografera visar elektro uppspänning för patch clamp-experiment i akuta skivor. Installationen är inkluderad i en Faraday-bur för att eliminera brus, och utrustningen är på toppen av en anti-vibrationsbord. Controllers av motordrivna micromanipulators för elektroderna observeras på vänster. B. pyramidala neuron av en mus electroporated med GFP, observerades under ljusa fält och grön fluorescens förhållanden. Inspelningen pipett fäst till en GFP + celler märks. Skala bar = 10 & #181; m. C. Firing mönster av en CAG-GFP elektrokontrollskikt II-III neuron visar den typiska ordinarie spiking svar. Fördelningen av aktionspotentialer approximerar till en vanlig fördelning längs längden på inströmmen (X-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skede | Spänning | elektroder | referenser |
| E9.5 | 7 V, 100 ms, 3 pulser | Stick platinaelektroder | Matsui et al. 2011 3 |
| E12.5 | 30 V, 50 ms, 3 - 5 pulser | Pincett-typ elektroder 3 mm | Saito, T., 2006 12 | </ Tr>
| E15.5 | 35-48 V, 50 ms, 5 pulser | Pincett-typ elektroder 5-7 mm | Rodriguez-Tornos et al. 2016 2, Saito, T., 2006 12 |
| P2 | 100 V, 50 ms, 5 pulser | Pincett-typ elektroder 5-7 mm | Sonego et al. 2013 4 |
Tabell 1: spänningsförhållanden och elektroder för elektroporering av embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver i detalj hur man märka neuroner i somatosensoriska cortex av C75BL / 6-möss för att analysera deras anslutning och deras retbarhet. När det gäller befintliga metoder, visualiserar det diskriminerande aspekter av anslutningsmöjligheter, till exempel antalet axonal förgreningar per neuron, deras exakta topografi, och deras anatomiska läge. Genom att ändra placeringen av elektroderna, är det möjligt att rikta andra neuron populationer, såsom cingulatecortexen (behålla samma vinkel mellan elektroderna och hjärnan, men ändra orienteringen av polerna) eller hippocampus 5, och utför liknande experiment märkning enskilda nervceller eller bredare populationer, beroende på den önskade strategin. Men det finns begränsningar för detta, eftersom inte alla populationer är lika tillgängliga eller lika selektivt märkt. Till exempel, i hippocampus, är det möjligt att selektivt rikta sena födda neuroner i CA1-regionen, men early elektroporering markerar heterogena populationer av inre och yttre pyramidala celler. I hjärnbarken, är nervceller föds på ett sekventiellt sätt, så dräktighets dag under IUE bestämmer vilken kortikala skikt påverkas. Utföra tidigare IUE mål djupare neuroner (t.ex. IUE på E14 etiketter skikt IV neuroner) 22.
För en lyckad IUE, det rekommenderas att ta hänsyn till vissa överväganden. För det första är det viktigt att göra operationen på mindre än 30 min för att minska påfrestningen på modern och för att öka chanserna till överlevnad hos avkomman. För det andra är den svåraste delen av förfarandet injektion av DNA-utföra injektionen via borsilikat kapillärerna så försiktigt som möjligt. Om trycks embryon för hårt, kan de skadas. När det gäller felsökning död embryon under DNA-injektioner, avfasning spetsen med en 30 ° vinkel kan öka effekten av detta proprocessen. Om en beveller är inte tillgängliga och kapillärerna skärs enbart med pincett, kan rätt vinkel bekräftas i dissekera mikroskop. Kasta otillräckliga kapillärer. Slutligen är viktig för att öka överlevnadsgraden anpassning av elektroporation förhållanden till det stadium av embryot (se tabell 1).
Vissa överväganden är nödvändiga med hänsyn till återuppbyggnaden av axoner och dendriter. För att märka enskilda nervceller, rätt koncentration av den Cre-plasmiden är väsentliga för att erhålla en god, gles expression och för att undvika confounding överlappning av neuronala projektioner som tillhör olika neuroner. Även om detta protokoll föreslås användning av 4 ng / mikroliter, kan det vara nödvändigt att justera plasmiden koncentrationen för varje experiment, beroende på den använda promotorn, kvaliteten på den DNA-beredningen, och metoden för DNA-kvantifiering (t.ex., reducera den till 2 ng / mikroliter om märkningen för många neuroner). i additividare, för axonal spårning, är det viktigt att skära med en lämplig vinkel för att få hela neuron i samma plan.
Kritiska steg för framgångsrika patch-clamp inspelningar är hälsan hos vävnaden av de akuta skivor och plats och överflöd av elektroporerade GFP-positiva neuroner. Om lapp steg misslyckas eller avvikande svar hittas under inspelningarna, minska tiden för bearbetning av akut skivor. Om GFP nervceller är svåra att identifiera och lokalisera på grund av deras minskade antalet i akut skiva, se till att det finns tillräckligt CAG-GFP plasmid ingår i elektroporering mixen. Med beaktande av de viktigaste begränsningarna hos de tillvägagångssätt som beskrivs häri, tillåter patch-clamp-tekniken inspelningen av många olika parametrar som beskriver retbarhet av neuron, men det behöver inte utvärdera aspekter som är beroende av hela kretsen. Även, och såsom anges ovan, inte alla neuronala subpopulationer är tillgängliga via IUE. Sammanfattningsvis, i the framtiden kan dessa tekniker bidra till att ytterligare analys av den strukturella och funktionella anslutnings olika neuronala subpopulationer i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för R. Gutiérrez och A. Morales för deras utmärkta tekniskt bistånd och till LA Weiss för redigering. CGB finansieras av den spanska Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från BBVA Foundation och SAF2014-58598-JIN (Mineco) M. Navarrete och genom ett bidrag från Ramón Areces Foundation och bidrag SAF2014-52119-R och BFU2014-55738-REDT (från Mineco) till M. Nieto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
