Summary
Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.
Abstract
sinir sistemi farklı nöron türlerinden büyük bir aralık oluşmaktadır. Bu nöronal alt popülasyonlar diğer özellikleri, onların farklı dendritik morfolojileri, aksonal bağlantı kendi özel desenler ve bunların seçici ateşleme yanıtları arasında, ile karakterize edilir. gelişimi sırasında farklılaşma bu yönleri sorumlu moleküler ve hücresel mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Burada, etiketleme için kombine protokolleri tanımlar ve kortikal nöronların yapısal bağlantı ve eksitabilite karakterize. Utero elektroporasyon (İEÜ) protokolünün Modifikasyon nöronların seyrek nüfus etiketleme sağlar. Bu da, dendritler ve bireysel nöronlar, aksonal projeksiyonlar laminer konumu hassas karakterizasyonu ve morfometrik analizi akson belirlenmesini ve izlenmesini sağlar. İEÜ ayrıca eksitabilite değişiklikleri araştırmak için kullanılabilirvahşi tip (WT) ya da elektroporasyon beyinleri akut kesitlerden bütün hücre kaydı ile birleştirerek genetik olarak modifiye edilmiş nöronlar. Bu iki teknik yapısal ve işlevsel bağlantı kuplajın daha iyi anlaşılmasına ve gelişme sırasında nöronal çeşitliliği kontrol eden moleküler mekanizmaların katkıda bulunur. Bu gelişimsel süreçler aksonal kablolama, nöronların fonksiyonel çeşitlilik ve bilişsel bozuklukların biyolojisi üzerinde önemli etkileri vardır.
Introduction
dendritik ve aksonal yapıların geliştirilmesi serebral korteks olmak üzere, sinir sisteminde devre düzenleme önemli bir yönüdür. Bu farklı nöronal alt popülasyonlar seçici kablolama sırasında kritik bir rol oynamaktadır. son raporlar bir dizi bağlantının yanı sıra, sinir hücrelerinin molekül çeşitliliği ateşleme oldukça spesifik modları satın tarafından yansıtılır, göstermiştir. Ancak, gelişim sırasında farklı nöron alt tipleri heyecanlanma ve bağlantı belirleyen mekanizmaları yanı sıra koordinasyon dereceleri, hala tam, 2 1 anlaşılmaktadır.
Vivo kaybı: ve kazanç fonksiyon-ifadesi spesifik genlerin düzeyi ve devrenin gelişimindeki etkisi arasındaki ilişkinin incelenmesi için izin analiz eder. Utero elektroporasyon (İEÜ) yaygın incelemek için kullanılan bir tekniktirspesifik sinir hücresi popülasyonlarını daki bir genin işlevi ve bunların bağlantı biçimin çalışma. Bununla birlikte, canlı farelerde kortikal katmanları aksonların ve dendritlerin morfolojik özelliklerini belirlemek için, seyrek nöronlar etiketlemek için gereklidir. İEÜ ile birleştirilmiş Cre rekombinasyon sistemi tespit kortikal laminaların tek tek hücreler tarafından yayılan projeksiyonları çözmek için yeterince düşük bir yoğunlukta nöronların seyrek popülasyonu işaretlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, elektroporasyona beyinleri (Şekil 1) arasında uygun sayılar analiz sonra niceliksel veri elde etmek için korteks başına nöronların yeterli sayıda etiket. Bu yazıda bağlantı, örneğin ince analizi için bir yöntem sunulur. Bu durum, ayrı deneylerde analiz etmek için benzer bir strateji sunulur, yeşil floresan proteini (GFP) üzerine akım kelepçe kayıtları gerçekleştirerek nöronların elektriksel özellikleri, akut korteks dilimlerinin hücreleri -electroporated. bu proprotokollere‖ kayıpları ve fonksiyon kazancı İEÜ sırasında ek plazmidlerle dahil edildikleri nöronların zamanda çok yönlü ve WT ve transjenik hayvanların nöronların uyarılabilirliğinin ve bağlantı çalışma uygulanabilir ve.
Bu protokol, embriyonik gün (E) 15.5 farelerin elektroporasyon açıklar, ancak bu teknik E9.5 3 ve doğum sonrası güne (P) 2 ile 4 arasındaki herhangi bir yaşta uygulanabilir. Erken dönemde elektroporasyon nöronlar ve talamus öncülerini ve korteksin derin katmanlannda daha sonra aşamalı elektroporasyon işaretleri daha yüzeysel tabakalar (örneğin, E15.5 IUE hedefleri tabaka II-III nöronlar) hedef ise. Özetle, tek hücreli morfolojik analiz ve elektrofizyoloji ile İEÜ kombinasyonu sinir sisteminde nöron muazzam yapısal ve işlevsel çeşitlilik altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, ulusal ve Avrupa mevzuatı ile uyumlu Madrid Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, Topluluk tarafından kabul edildi (PROEX 118/14; PROEX 331/15). prosedür esnasında steril koşulların muhafaza.
1. Giriş Utero Elektroporasyon
Not: İEÜ Bu protokol daha önce 5, 6, 7 yayınlanmış diğerlerinden uyarlanmıştır. Bu yazıda, standart GFP raportör plasmidleri ile tek nöronların 8 ve ayrı bir deneyde elektrofizyolojik özellikleri morfolojisi çalışması için izin raportör strateji değişikliklerle İEÜ E15.5 embriyosu için bir protokol açıklamaktadır.
- DNA'nın hazırlanması
- üreticinin talimatlarına göre bir endotoksin içermeyen izolasyon kiti kullanılarak DNA plazmaları hazırlayın ve 1x p onları sulandırmakhosphate tamponlu tuz (PBS).
- Plazmid, bir kontrol olarak, bir floresan protein bildirici (ör CAG-DsRed2 9), 1 ug / ml kodlayan tek hücre etiketlenmesi için, ameliyat başına DNA karışımı 10 uL (embriyo başına 1 uL) aşağıdaki yapılan ve nihai konsantrasyonlar kullanılarak hazırlanmıştır elektroporasyon verimliliği; Deneysel plazmid tipik olarak, test edilecek olan 1 ug / ml; Loxp-verici-loxP-floresan protein plasmidi (CALNL-GFP 10), 1 ug / ml; ve inşa kodlama Cre 10, 1-4 ng / uL. enjekte DNA görselleştirmek için su içinde (ağırlık / hacim)% 0.1 Hızlı Yeşil 1 uL ekleyin.
Not: GFP cDNA yapısı Cre rekombinasyon yalnızca görselleştirme ve bireysel aksonal çıkıntılar (Şekil 1A) yeniden sağlayan bir kaç nöronlar, meydana gelir. - Standart patch-clamp çalışmaları için, ameliyat başına DNA karışımı 10 uL (EMBR için 1 uL hazırlanmasıyaşında) floresan protein (örneğin, CAG-GFP 11), bir raportör kontrol olarak 1 ug / ml kodlayan aşağıdaki plazmid; Deneysel plazmid, genellikle 1 mikrogram / ml; ve su içinde% 0.1 Hızlı Yeşil 1 pL (ağırlık / hacim).
Not: Bu, istenen tabakanın olan etiketli uyarıcı nöronlardan çok sayıda içeren akut dilim analiz, standart elektroporasyon durumlardır. Adım 1.1.1.1 açıklandığı gibi tek hücrelerde yama-kelepçe çalışmalar yapmak, DNA hazırlamak.
- Plazmid, bir kontrol olarak, bir floresan protein bildirici (ör CAG-DsRed2 9), 1 ug / ml kodlayan tek hücre etiketlenmesi için, ameliyat başına DNA karışımı 10 uL (embriyo başına 1 uL) aşağıdaki yapılan ve nihai konsantrasyonlar kullanılarak hazırlanmıştır elektroporasyon verimliliği; Deneysel plazmid tipik olarak, test edilecek olan 1 ug / ml; Loxp-verici-loxP-floresan protein plasmidi (CALNL-GFP 10), 1 ug / ml; ve inşa kodlama Cre 10, 1-4 ng / uL. enjekte DNA görselleştirmek için su içinde (ağırlık / hacim)% 0.1 Hızlı Yeşil 1 uL ekleyin.
- üreticinin talimatlarına göre bir endotoksin içermeyen izolasyon kiti kullanılarak DNA plazmaları hazırlayın ve 1x p onları sulandırmakhosphate tamponlu tuz (PBS).
Cerrahi 2. Hazırlık
- aseptik prosedürler kullanılarak bir hayatta kalma ameliyat gerçekleştirin. maskeler, eldivenler, enstrümanlar ve cerrahi alan da dahil olmak üzere steril koşullar, emin olun. cerrahi aletler (neşter, Adson forseps, sertleştirilmiş ince makas, kavisli makas, Dumont forseps ve iğne tutucu) sterilize edin.
- 1 / 0.58 mm iç / dış çap seçin borosilikat cam kapilerleri. çekme kapağıillaries 3. çektikten sonra 1 cm optimal ucu uzunluğu hedefleyin. Ince forseps (Şekil 1B) kullanılarak yaklaşık 30 ° açıyla iğne ucu kesin.
- 500, steril izotonik çözeltinin mL (1 x PBS veya Hank's dengeli tuz solüsyonu (HBSS)) hazırlayın. 100 ve 37 ° C bu çözüm sıcak: penisilin-streptomisin 1 ekleyin. Ameliyat sonrası 4 ° C'de saklanabilir.
- Subkutan analjezik ameliyat öncesi doz (örn karprofen, 5 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edilir.
- bir ısıtma yastığı koyarak ameliyata sıcak hayvanları tutun. Postoperatif iyileşme 37 ° C'ye kadar temiz bir kafes ısıtın.
3. Cerrahi
- izofluran ile C57BL / 6 E15.5 hamile fare anestezisi. İlk olarak, 0.8 L / dk oksijen% 3 izofluran ile kapalı bir odasını demlenmeye ve uyuyana kadar içeride fareyi bırakın. bir ısıtma pedi fare aktarın ve teslim için bir maske içinde burun ve ağız koyunizofluran y. Yavaş yavaş maske ile% 1.5 izofluran ameliyat boyunca anestezi azaltın. Pedal refleks (ayak tutam) zarar görerek uygun anesthetization onaylayın. Optimum işlem yaklaşık 20 dakika ve en fazla 45 dakika sürer.
- İşlem sırasında kurumasını gözleri önlemek için göz merhemi sürün.
- (Elektrikli tıraş makinesi veya tüy dökücü krem kullanarak) karın ~ 3 cm bölgeden saç kaldırmak. iyot-infüzyon pamuklu çubukla ardından% 70 etanol ile aşılanmış pamuklu, cerrahi yıkayın. üç kez tekrarlayın.
- enfeksiyonları önlemek için steril gazlı bez ile cerrahi alanı kapsayacak.
- orta hatta dikey 2 cm uzunluğunda deri yoluyla açılmasını ve paralel hale getirmek için neşter kullanın. künt kavisli makas kullanarak karın cilt ve kas ayırın. forseps ile kas tutun ve karın boşluğuna maruz linea alba aracılığıyla kesti.
- yardım o ile embriyolar bulunforseps f. Adım 2.3 hazırlanan steril tuzlu su çözeltisi ile iki ıslak pamuklu çubuklarla ıslatın ve açıklığın dışında erişilebilir bir embriyo işlemek için bunları kullanın. Embriyonun etrafında pamuklu çubuklarla yerleştirin ve yavaşça karın boşluğundan hem rahim boynuzları ayıklayın. kurumasını önlemek için işlem boyunca sıcak tuzlu su çözeltisi ile sulu embriyolar ve açılan karın boşluğu tutun.
DNA ve elektroporasyon 4. Enjeksiyon
- telencephalon bulmak için parmakları ile hafifçe embriyolar işlemek (açıkça beynin iki ön veziküller gibi gözle görülebilmesi). ağız pipet hazırlanmış bir borosilikat kılcal yerleştirin. o bir yan ventrikül ulaşıncaya kadar, kan damarlarını kaçınarak, rahim yoluyla iğne ucu geçirin. Büyük bir mavi nokta görülünceye kadar yavaş yavaş Hızlı Yeşil renkli DNA çözüm yaklaşık 1 mcL enjekte edilir.
- th yanal 7 mm platin elektrotları yerleştirinembriyo (Şekil 1C) e başkanı.
NOT: DNA negatif yüklüdür; Gerilim platin elektrotlar arasında uygulandığında bu nedenle, pozitif elektrot doğru hareket eder. elektrot konumu değiştirilerek, beynin farklı alanlarının hedeflenebilir. - (E15.5 embriyolar için.: 38 V, 50 ms aralık döngüsü uzunluğu, 950 ms aralığı duraklama 5 bakliyat, Bu koşullar gelişimsel evresine göre değişir) platin elektrotlar aracılığıyla gerilim uygulanmalıdır 12.
NOT: Farklı embriyo evrelerinde gerilim koşulları ve elektrotlar için Tablo 1'e bakınız. - Her embriyo için 4.3 - Tekrar 4.1 adımları.
Cerrahi ve Postoperatif 5. sonu
- anne içine rahim geri işlemek için pamuklu çubuklarla kullanın. ısındı tuzlu su çözeltisi ile karın boşluğunu doldurmak (yaklaşık 2 mL ekleyin).
- Basit kesintiye dikiş veya sürekli dikiş ile kas dikin. Kullan # 6-0 sütürs.
- Dış yarayı kapatmak için zımba kullanın. zımbalama önce kas cilt ayırmak için dikkatli olun. burun maskesi çıkarın.
- Fare hayvan tesis odasında koymadan önce ısıtılmış, temiz bir kafes içinde 30 dakika boyunca kurtarmak için izin verin. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkette ameliyat geçirmiş bir hayvan koymayın.
- cerrahi sonrası günlerde hayvan denetlemek. subkutan analjezik uygulayın (karprofen, 5 mg / kg vücut ağırlığı) her 12 saatte bir 2 gün veya hayvan mevzuatına göre. Hiçbir ek postoperatif bakım yavruların için gereklidir.
Numunelerin 6. Hazırlama ve Analiz
- İsteğe bağlı: P2 üzerinde bir floresan mikroskop kullanılarak Electroporated yavruların floresan ifade edin; İEÜ başarılı olduğunda, floresan açıkça i görülebilirkafasını 13 n adet. Mark veya pozitif aşağıdaki adımlarda kullanılmak için elektroporasyona fareler ayırın. Standart hayvan tesis koşullarında baraj ve yavrular tutun.
- Çalışmanın istenen aşamada transkardiyal fareler serpmek. Tipik olarak, dendritik ve aksonal büyümenin en aktif faz ilk üç hafta içinde doğum sonrası 2, 14, 15 karşılık gelir.
- fare başına 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA), 30 mL hazırlayın ve buz üzerine soğuk.
DİKKAT: PFA bilinen bir alerjen ve kanserojendir. Bu zehirli. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
NOT: PFA miktarı gerekli fare (örneğin, P16 için, perfüzyon için 20 ml ve postfiksasyon için 10 ml gereklidir) yaşına bağlıdır. - 1: 100 ug / ml ketamin 8 hacim oranı: 1 ile hayvan anestetize bir ketamin-ksilazin karışımı hazırlama 100 ug / ml Xylazine: PBS (fare başına yaklaşık 0.2 mL hazırlamak).
- intraperitoneal aşama 6.2.2 hazırlanan karışımın 0.2 mL enjekte edilerek fare anestezisi.
- sırtında anestezi fare yerleştirin. Bir neşter kullanılarak göğüs üstünde yatay bir kesi yapmak. Kalp görülebilir kadar ince makasla kas ve diyaframı kesti.
- ince makasla sağ atrium bir kesi yapmak. Yavaş yavaş kanı akıtmak için bir 25 gauge iğne ile sol ventrikül PBS 20 mL enjekte edilir. Fare sert ve organları beyaz olana kadar 20 mL PFA (adım 6.2.1) enjekte edilir.
- Derhal baş kaldırmak ve kafatası boynundan deri bir orta hat kesi yapmak. Yavaşça kavisli bir forseps kullanarak kafatası soymaya beyin ayıklayın. delinme veya kafatası çıkarılması sırasında beyni zarar vermemeye özen gösterin. bu postfix için gece boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA 10 mL beyin koyun.
- fare başına 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA), 30 mL hazırlayın ve buz üzerine soğuk.
- CryoProtecbu lavabo kadar 2 gün - t, 1, 4 ° C de PBS içinde% 30 sukroz, 10 mL beyinleri sabit. 1 cm 3 alüminyum folyo küpleri hazırlayın. Cubes OCT ile yol 2/3 doldurun. içinde beyin koyun ve kuru buz küpleri koyarak onları dondurmak. -80 ° C'de dondurulmuş beyin saklayın.
- örnek Diskin yüzeyindeki OCT Yeri damla, histoloji küp alüminyum folyo soyma ve sıvı OCT üstünde örnek diske istenen yönde de küp yerleştirin. sabit kadar sıkı basınç uygulayın. kriyostat örnek kafasına numune diski takın. (Bıçak / bıçak olumlu bir pozisyonda içine taşımak) numune yönlendirmek.
- Bölüm kriyostat üzerinde beyinleri. Ince bir fırça kullanarak 100 mikron kalınlığında kayan cryosections 16 ve PBS koyun - 50 seçin.
- İstenirse Leke.
NOT: aksonal morfolojisi çalışma için, GFP antikor ile boyanma şiddetle tavsiye edilir- % 0.5 Triton-X 100 (bloke çözelti) ihtiva eden PBS içinde% 5 sığır fetus serumu ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümler bloke eder. 1 ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe: 500, birincil antikor (ör tavşan GFP anti) çözeltisi bloke seyreltilmiştir.
- PBS içinde bölümlerinin üç kez yıkayın. Ekleme 1: 500 ikincil antikoru (örneğin, keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488) çözeltisi bloke edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe içinde seyreltilmiştir. PBS içinde bölümlerinin üç kez yıkayın.
- PBS, Triton-X 100, 10 dakika boyunca% 0.5 ihtiva eden: DAPI (10.000 1) ile karşıt. PBS ile bölümleri durulayın. Orta 16 montaj sulu bölümleri monte edin.
7. Görüntüleme ve Analiz
- Floresan veya konfokal mikroskopi
- Tam nöronlar yeniden bir yüksek büyütme (en azından 40X) ve (x 1,024 1,024 az) yüksek çözünürlükte görüntüler elde etmek için. seç "Çini tarama "veya satın alma yazılımı eşdeğer bir seçenek. Tüm dendrit ve akson süreçleri kapsayan ilgi alanı kapsayacak bir bilgi kaybını önlemek için z ekseni üzerinde yığınlarının yeterli sayıda Satın Alıyor.
NOT: Genellikle mikroskop yazılımı "Optimize yığın" seçeneği vardır, ama bu durum böyle değil ise, deney el görüntüleri doğru bireysel projeksiyonları tanımlamak için üst üste için gerekli olan kaç adım belirlemek için. İki önemli parametreler iğne deliği ve objektif; dikkate almak "yüksek büyütme, daha çözünürlük ve daha gerekli z adımlar."
- Tam nöronlar yeniden bir yüksek büyütme (en azından 40X) ve (x 1,024 1,024 az) yüksek çözünürlükte görüntüler elde etmek için. seç "Çini tarama "veya satın alma yazılımı eşdeğer bir seçenek. Tüm dendrit ve akson süreçleri kapsayan ilgi alanı kapsayacak bir bilgi kaybını önlemek için z ekseni üzerinde yığınlarının yeterli sayıda Satın Alıyor.
- analiz
NOT: Birkaç parametreler analiz edilebilir olmasına rağmen, adım 7.2.1 iki odaklanmaktadır: dendrit morfolojisi ve akson dallanma. Fiji İndir ( http://fiji.sc/ ).- Görüntüyü açmak menüden "Segment çizgi" seçeneğini seçin. inci boyunca yukarı ve aşağı hareket (bir çizgi çizinnöron yapısı aşağıdaki) fare kaydırma e z ekseni. çizgi kaydetmek için "Ekle, Araçlar, ROI Yöneticisi Analiz" için (alternatif basın "t") gidin. Analiz nöron 2 her akson veya dendrit için bu işlemi tekrarlayın.
- ROI Yöneticisi Menü basında "Tedbir" butonuna uzunluğunu (veya ek parametreler) elde etmek için. bunları analiz etmek için bir metin dosyasına veya e-tabloya ölçümleri ihracat.
8. Elektrofizyoloji
NOT: Bu protokol amacı katmanından GFP elektropore Fare beyinleri (veya daha önce başka herhangi bir elektroporasyona floresan protein) GFP ile görsel olarak tespit II / III piramidal hücre nöronlar bütün hücre akım kelepçe kayıtları elde etmektir. Daha önce yayınlanmış yöntemler 17, 18 bir uyarlamasıdır. Bu protokolü kullanarak bir genetik MODIF etkisini incelemek mümkündürnöronun elektrik özelliklerine Üniversitemizde tarafından tanıtıldı ication. Belirli ateşleme modları edinimi iyon kanallarının geniş bir repertuar dinamik ifadesini içerir ve bu geç doğum sonrası aşamalarından önce geçici ateşleme modları ifadesi ile sonuçlanan farklılaşma aşamalı bir süreçtir. Örneğin, olgun elektrik yanıtları P16 2, 19 öncesi somatosensör fare korteksin II / III tabakada gözlenmez.
- Akut dilim önkoşulları
- farelerin beyinleri kaldırmak için steril cerrahi araçları hazırlayın: baş kaldırmak için bir giyotin; kafatası yoluyla kesmek için küçük makas; forseps, doku kafatası ayırmak için; spatula, ince kendi gövdesi beyin doku kaldırmak için; metalik dilimleme makinesi, iki eşit parçaya korteksi incelemek için; ve Pasteur pipeti (vibratome (yapay beyin omurilik sıvısı ihtiva eden bir çözelti içine yerden ac dilimleri taşımakmuayene için SF), ve daha sonra) bir kuluçka tutma alanına ACSF dilim aktarın.
- 119 mM NaCI, 26 mM NaHCO 3 ihtiva eden yüksek saflıkta (iki kez damıtılmış su) su ile ACSF 1 L 'nin Hazırlanması, 11 mM glukoz, 2.5 mM KCI, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2 ve 1 mM NaH 2 PO 4. 7.3 pH titre - HCI veya NaOH ile 7.4. 290 mOsm ozmolarite ayarlayın.
- Karbojen kabarcık ACSF (% 95 O 2/5% CO2) 15 - 7.4 - 7.3 pH stabilize teflon tüp (~ 1 mm) kullanılarak, 20 dakika.
- Bir sulu diseksiyon çözelti oluşturmak için 15 dakika için 10 - 80 ° C 'de karbojen ile doyurulmuş ACSF çözeltisi 200 mL dondurun. beyin dilimleme için buz üzerinde bir 100 X 20 mm doku kültürü tabağına yerleştirin.
- sadece bir deney başlamadan önce% 1 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi 100 mL hazırlayın. , Çözüm soğutun agaroz (boyutlar: 1 x 1 x 0.5 mm) bir kare parça kesip, ve supergluegeri platform, beyin dilimlenmiş nerede hemen arkasında (agaroz jel dilimleme sırasında beyin için destek sağlar). mümkün olduğunca ön kadar düz olun.
- Akut dilimleri elde edilmesi
- Fare hareketsiz ve izofluran% 2 ile uyutmak. giyotin ağzına kafasını yerleştirin ve hızla onu başını kesmek. Kemik korucular veya ince forseps kullanımı ile mümkün olduğunca hızlı kendi kafatası çıkarın. soğutulmuş ACSF halinde beyin koy.
NOT: hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir. - soğutulmuş kültür çanak beyin yerleştirin. küçük bir makas ile beyincik kesti.
- bir spatula ile beyin Pick up ve bir kağıt havlu üzerinde kurumaya kurulayın.
- vibratome tutucu beyin ventrocaudal düzlemi Tutkal. buz gibi soğuk ACSF ile dolu bir vibratome üzerinde tutucu yerleştirin.
- (1 mm 300 mikron koronal kesitler (bir bubbler koyun, örneğin, işlem boyunca devam carbogenation sağlamak keserek akut dilimler eldeAşağıdaki Vibratome ayarları kullanarak vibratome odasında politetrafloroetilen tüp)): 0,06 mm genlik ve 0,08-0,10 mm / s hız. mümkün olan en yavaş hızda (~ geçiş başına 22 lar) avans olarak ayarlayın. Bu optimum ayarlarını değiştirme ve ampirik gerekirse her makine için en uygun koşulları elde.
- % 95 O 2/5% CO2 gazı ile kabarcıklar ise 3 mM miyo -inositol ile takviye ACSF en az 60 dakika, 0.4 mM askorbik asit ve 2 mM sodyum piruvat akut dilimleri inkübe edin. 25 ° C'de sıcaklığı muhafaza edin.
- az 15 dakika içinde dilimleme işlemini gerçekleştirin. kullanım için kayıt odasına transfer edilmeden önce 7 saat - Arzu edildiği takdirde, dilimler 1 saklanabilir.
- Fare hareketsiz ve izofluran% 2 ile uyutmak. giyotin ağzına kafasını yerleştirin ve hızla onu başını kesmek. Kemik korucular veya ince forseps kullanımı ile mümkün olduğunca hızlı kendi kafatası çıkarın. soğutulmuş ACSF halinde beyin koy.
- tam hücreli kayıt için önkoşullar
- elektrofizyoloji istasyonu kayıt odasına, bir perfüzyon sistemi, bir mikroskop, elektrotlar (kayıt, uyarıcı ve toprak), makro ve MICR ile donatılmış olduğundan emin olunomanipulators, katı bir titreşime dayanıklı masa üstü ve Faraday kafesi, bir stimülatörü, bir amplifikatör ve bir analog-dijital analiz etmek için filtre (A / D) dönüştürücü, toplama yazılımı olan bir bilgisayar ve bir GFP (veya başka bir florokrom) genetik nöronlar 18 (Şekil 2A) güncellenmiştir.
- 115 mM potasyum glukonat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCI, 4 mM Na2 ATP, ve 0.3 mM Na-3 GTP, KOH ile ve KCl 290 mOsm pH 7.2 değerine getirilmiştir ihtiva eden hücre içi çözelti hazırlayın.
- borosilikat cam kılcal damarların çekerek yama pipetler olun. Mikropipet çektirmenin kullanarak yama elektrotlar hazırlayın. Kullanım borosilikat kılcal (1.5 mm, dış çapı, 0.86 mm iç çap, 10 cm uzunluğunda). hücre içi çözümü ile dolu olduğunda yama elektrotlar 3-10 MQ ve dirençleri gösteren olun.
- 2 mL / dk oranında ACSF kayıt odası serpmek. approxim bölmenin sıcaklığını muhafazaulaştırılması 33 ° C.
- Tüm hücre kayıt
- Pasteur pipeti (uzun ucu kesilmiş) ya da küçük bir fırça kullanarak kayıt odasına dilim aktarın. Bir harp ile dilim basılı tutun. 2 ml / dk'lık bir oranda sürekli olarak ACSF dilimleri serpmek.
- GFP pozitif nöron yama.
- Kayıt odasına dilim koyun ve düşük büyütme (10X) mikroskop aracılığıyla ilgi alanı bulmak. Ardından, 60x objektif kullanılarak yama bir GFP pozitif hücre bulmak.
- Hücre içi çözümü ile kayıt elektrodu doldurun. Hücre içi çözümü ile kayıt elektrodu doldurmak için filtre (4 mm filtre) bağlı şırınga ve mikro-yükleyici ucu kullanın.
- pipet tutucu cam pipet yerleştirin. banyoda pipet yerleştirin ve bahşiş odaklanmak. Pipet banyosunda sonra, geri basınç kontrol sistemi sayesinde pozitif basınç uygulayın.
- (Şek floresan bir nöron Patchure 2B).
- pipet geri basınç korurken görsel gözetiminde ilgi hücre yaklaşın. hücre yüzeyi üzerindeki küçük bir çukur görünümünü üzerine, basınç serbest bırakın. Bu noktada, bir sıkı conta (1 GΩ daha büyük direnç) oluşturulabilir. Aksi takdirde, kolaylaştırmak için bir ışık negatif basınç (emme) uygulanır.
- kapatmanın meydana edilirken, -60 mV tutma voltajı kelepçesi getir. GΩ conta oluşturulduktan sonra, pipet altındaki hücre zarı yırtılabilir ve bütün hücre moduna geçmek için bir emiş darbe uygulamak. Daha fazla bilgi için 20 başvuru bakın.
- Akım kelepçe koşulları 21 kullanılarak etkinliğini kaydedebilirsiniz. Bir kez tam hücreli modunda, akım kelepçe moduna gerilim-kelepçe geçiş ve kaydetmeye başlayın. Örneğin, hücre uyarılabilirliğini kayıt 500 ms süren mevcut enjeksiyonları depolarize uygulamak için (100-400 pA).
- ateşleme oranları b hesaplayıny giriş akımları artırmak için tren boyunca aksiyon potansiyelinin sayısını komplo.
Not: dinlenme membran potansiyelinin, giriş direnci ve membran kapasitans da kayıtların 21 hesaplanabilir.
- ateşleme oranları b hesaplayıny giriş akımları artırmak için tren boyunca aksiyon potansiyelinin sayısını komplo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
detaylı bir şekilde ve gelişimi boyunca nöronların morfolojik değişikliklerini karakterize etmek için, seyrek nöronlar etiketlemek için gereklidir. Bu enzim dahil yalnızca nöronlar GFP (Şekil 1A) ifade için bir Cre rekombinaz seyreltildi sistemi, nöronların seyrek popülasyonunda ilgi konusu bir genin sentezlenmesi için izin verir. Bu strateji kullanılarak, tabaka II-III hedefli ve E15.5 İEÜ tarafından etiketlenmiştir. CAG-DsRed2 / ml 1 ug, CO-elektroporasyona bir kontrol olarak ve canlı hayvan pozitif elektroporasyona beyinleri tanımlamaktır. Önemli bir şekilde, anti-GFP antikoru ile boyandıktan sonra, sinyal kendi dendritik morfoloji ve akson (Şekil 1D ve E) açıkça görüntülenmesini sağlamak için yeterince güçlüdür.
İEÜ ve elektrofizyoloji sonra tüm hücre kayıtları elde edilen parametrelerin analizi birlikte kullanılırFarklı koşullar altında ateş yanıtları ve elektroporasyona hücrelerinin uyarılabilirliğini mpare. Çeşitli parametreler elde edilebilir. Parametreler belirli patch-kelepçe analizi yazılımı kullanılarak belirli çalışmaya adapte edilmelidir. Şekil 2C E15.5 electroporated bir WT tabakası II-III nöronun kayıtları elde edilen giriş akımına karşı aksiyon potansiyelleri komplo bir örnek sağlar.
Strateji Seyreltilmiş Şekil 1. Cre-rekombinaz Kortikal nöronlar Seyrek Etiketi sağlar. Strateji A. şematik özeti. CALNL-GFP ve CRE hem taşıma nöronlarda, LoxP-STOP-LoxP kaset CALNL-GFP dışında eksize edilir ve GFP güçlü CAG organizatörü tarafından ifade edilmektedir. Bir borosilikat kılcal B. şematik çizim mikropipet çektirmenin kullanarak çekti. ucu Besin tarafından kesilirrceps, 30 ° açı oluşturarak. kılcal dar kısmının başına ucundan 1 cm ölçün. Elektrotların C. pozisyonu somatosensorial korteks hedef. platin elektrot yaklaşık embriyo kulak üzerine yerleştirilir. gerilim uygulandığında dolayı negatif yüke DNA pozitif elektrot doğru gidiyor. elektrotların konumunda Varyasyon farklı beyin bölgeleri hedef sağlar. Vektörleri sonra elde edilen D. Görüntüler embriyonik gün 15.5 de utero elektroporasyon ile katman II-III nöronlar teslim edildi; Koronal bölümler CAG-DsRed2 vektör, bir kontrol (sol) ve ko-transfekte edilmiştir doğum sonrası gün 16'da gerçekleştirilmiştir. GFP (orta) CALNL-GFP vektöründe LoxP siteleri rekombinasyona izin veren ancak, aynı zamanda Cre dahil bu nöronların olarak ifade edilir. seyrek etiketleme bireysel nöronlar (ok başları) ayırt edilmesini sağlar. T E. Yüksek büyütmeli konfokal görüntüo başka seyrek etiketli GFP nöronun milleri dendritik. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir Atış Tepki Şekil 2. Elektrofizyoloji Ayarlar ve örneği. A. Fotoğraf akut dilimler halinde yama kelepçe deneyleri için kullanılan elektrofizyoloji kurulumunu göstermektedir. Kurulum gürültüyü ortadan kaldırmak için bir Faraday kafesi dahil ve ekipman bir anti-vibrasyon tablosunun üstündeki olduğunu. elektrotlar için motorlu mikromanipülatörler Kontrolörleri solda görülmektedir. Parlak bir alan ve yeşil floresan koşullarında gözlenen GFP ile electroporated bir fare B. piramidal nöron. GFP + hücresine bağlı bir kayıt pipet belirgindir. Ölçek çubuğu = 10 & #181 m. CAG-GFP C. Ateşleme desenleri tipik düzenli spike tepki gösteren kontrol katmanı II-III nöron electroporated. aksiyon potansiyellerinin dağılımı giriş akımına (x-ekseni) süresi boyunca düzenli bir dağılım yakındır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| sahne | Voltaj | elektrotlar | Referanslar |
| E9.5 | 7 V, 100 ms, 3 bakliyat | platin elektrotları sopa | Matsui ve ark. 2011 3 |
| E12.5 | 30 V, 50 ms, 3-5 bakliyat | Forseps tipi elektrotlar 3mm | Saito, T., 2006 12 | </ Tr>
| E15.5 | 35-48 V, 50 ms, 5 bakliyat | Forseps tipi elektrotlar, 5-7 mm | Rodriguez-Tornos ve ark. , 2, Saito, T., 2006 12 2016 |
| P2 | 100 V, 50 ms, 5 bakliyat | Forseps tipi elektrotlar, 5-7 mm | Sonego ve ark. 2013 4 |
Tablo 1: Embriyolar Elektroporasyon için gerilim Koşulları ve Elektrotlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol onların bağlantı ve heyecanlanma analiz etmek amacıyla C75BL / 6 farelerinin somatosensoriyel korteks nöronları etiketlemek için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Mevcut yöntemlere göre, bu tür nöron başına aksonal şube sayısı, bunların kesin topografya ve anatomik konumu gibi bağlantı ayrımcı yönlerini görüntüler. Elektrotların pozisyonlarını değiştirerek, tür singulat korteks gibi diğer nöron popülasyonları, hedef (elektrotlar ve beyin arasındaki aynı açıyı tutmak, ancak kutupların yönünü değiştirmek) ya da hipokampus 5 ve benzeri gerçekleştirmek mümkündür istenilen stratejiye bağlı olarak bireysel nöronlar veya daha geniş nüfusu, etiketleme deneyleri. tüm popülasyonlar eşitlikle açık ya da eşit seçici etiketli Ancak, bu sınırlamalar vardır. Örneğin, hipokampus, seçici CA1 bölgesinde geç doğmuş nöronlar hedef mümkündür, ancak adetrly elektroporasyon, iç ve dış piramidal hücreleri heterojen popülasyonları işaretler. serebral korteks, nöronlar sıralı bir şekilde doğdu, bu yüzden İEÜ sırasında gebelik gün etkilenir, hangi kortikal tabaka belirler edilir. Daha önce İEÜ olası hedefler derin nöronlar Sahne 22 (örneğin, E14 İEÜ tabaka IV nöronlar etiketler).
Başarılı bir İEÜ için, hesap bazı hususlar dikkate alınması tavsiye edilir. Birincisi, anne üzerindeki baskıyı azaltmak için ve yavruların hayatta kalma şansını artırmak için en az 30 dakika içinde ameliyat yapmak önemlidir. İkinci olarak, prosedürün en zor kısmı enjekte edilmesidir yavaşça mümkün olduğu kadar borosilikat camdan yoluyla enjeksiyonu DNA-gerçekleştirin. Embriyolar çok sert basılırsa, bunlar zarar görebilir. Bu yanlısı etkinliğini artırabilir 30 ° açı ile ucu, DNA enjeksiyonlar sırasında embriyoların ölümü giderme pah açısındanyararlanma. Bir beveller mevcut değildir ve kılcal forseps ile sadece kesilir, doğru açı mikroskop teyit edilebilir. yetersiz kılcal atın. Son olarak, embriyo aşamasına elektroporasyon koşulları adapte hayatta kalma oranını artırmak için önemlidir (Tablo 1).
Bazı hususlar akson ve dendritler yeniden inşasına ilişkin gereklidir. bireysel nöronlar etiketlemek için, Cre plazmid uygun konsantrasyonu iyi, seyrek ifade elde etmek ve farklı nöronlar ait nöronal projeksiyonların karıştırıcı çakışmasını önlemek için gereklidir. Bu protokol, 4 ng / ml kullanılmasını önermektedir, ancak, kullanılan promotere bağlı olarak, her bir deney için plazmid konsantrasyonunu ayarlamak gerekebilir, DNA hazırlığı kalitesi ve DNA miktar gibi bir yöntem (örneğin, düşürün 2 ng / ml) etiketleme çok nöronlar eğer. Additi içindeilgili, aksonal izleme için, aynı düzlemde bütün nöron elde etmek için uygun bir açı ile kesmek için önemlidir.
Başarılı patch-kelepçe kayıtları için kritik adımlar akut dilim doku sağlığı ve konumu ve Electroporated GFP pozitif nöronların bolluğu vardır. yama adımlar başarısız veya anormal tepkiler kayıtları sırasında bulunursa, akut dilimleri işlemek için süresini azaltmak. GFP nöronlar akut dilim onların sayılarının çok azalmasına tanımlamak ve bulmak zor ise, yeterli CAG-GFP plazmid elektroporasyon karışımı dahil olduğundan emin olun. Burada tarif edilen yaklaşımların temel sınırlamalar ile ilgili olarak, patch-kelepçe tekniği nöron heyecanlanma açıklayan birçok farklı parametrelerin kayıt sağlar, ama bütün devre bağlı yönlerini değerlendirmek değil. Yukarıda belirtildiği gibi, ayrıca, tüm nöronal alt popülasyonlar İEÜ erişilebilir ve benzeri vardır. Özetle, thE gelecek, bu teknikler, beyinde, farklı nöron alt gruplarının yapısal ve işlevsel bağlantının daha fazla analiz katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Biz onların mükemmel teknik yardım ve düzenleme için LA Weiss R. Gutiérrez ve A. Morales minnettarız. CGB İspanyol Ministerio de Ciencia e INNOVACIÓN (MICINN), FPI-BES-2012-056011 tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma, M. Navarrete BBVA Vakfı ve SAF2014-58598-Jin (MINECO) bir hibe ile ve Ramón Areces Vakfı ve hibe SAF2014-52119-R ve (MINECO itibaren) BFU2014-55738-REDT için bir hibe ile finanse edildi M. Nieto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
