Summary
אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.
Abstract
תאים אנושיים המושרה גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) חייב להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים לפני הממשל, אך פרוטוקולים קונבנציונאלי להבחנה hiPSCs לתוך cardiomyocytes (hiPSC-CMS), תאי אנדותל (hiPSC-ECS), ותאי שריר חלק (SMCs) הם בדרך כלל מוגבל על ידי תשואה, טוהר נמוך, ו / או יציבות פנוטיפי עניה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי רומן להפקה hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs כי הם משמעותיים יותר יעילים מאשר שיטות קונבנציונליות, כמו גם שיטה משלבת הזרקת תא עם טלאי ציטוקינים המכילים נוצרו על האתר של ממשל. המדבקה משפר הן את שימור של התאים מוזרקים, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני סחט של שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה ארוכה. במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה בשריר הלב, קצב engraftment היה יותר משני-לקפל יותר כאשרתאים נוהלו עם המדבקה המכיל ציטוקינים בהשוואה לתאים ללא תיקון, וטיפול בשני התאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה קשור לשיפור בתפקוד לב וגודל אוטם.
Introduction
אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) הם בין סוכני המבטיחים ביותר עבור טיפול בתאי משובים כי הם יכולים להיות מובחנים לתוך מגוון בלתי מוגבל פוטנציאל וכמות התאים שאינם נדחה על ידי המערכת החיסונית של החולה. עם זאת, את יכולת שכפול עצמי והבחנה יכול גם להוביל להיווצרות גידולים, וכתוצאה מכך, hiPSCs צריך להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes (CMS), תאי האנדותל (EC), ותאי שריר חלק (SMCs ), לפני מתן. אחת השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר של ממשל תא הוא הזרקת intramyocardial ישירה, אך מספר תאים מושתלים כי הם engrafted ידי רקמת שריר לב הוא היליד נמוך באופן חריג. הרבה התשה זו ניתן לייחס לסביבה ציטוטוקסיות של הרקמה איסכמי; עם זאת, כאשר תאי גזע בעכברים עובריים (ESCs) מוזרקים היו ישירות לתוך שריר הלב של לב וללא כל פגע, only ~ 40% של 5 מיליון התאים נמסרים נשמרו במשך 3-5 שעות 1, אשר טוענת כי חלק ניכר של התאים המנוהלים יצא אתר הממשל, אולי משום שהם היו סחטו דרך מסלול המחט ידי בלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך התכווצות שריר הלב.
כאן, אנו מציגים שיטות חדשניות והרבה יותר יעילות להפקה cardiomyocytes hiPSC הנגזרת (hiPSC-CMS) 2, תאי אנדותל (hiPSC-ECS) 3, ותאי שריר חלק (SMCs) 4. יש לציין, פרוטוקול hiPSC-SMC זה הוא ראשון לחקות את המגוון הרחב של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים שנצפו סומטיים SMCs 5 על ידי הפניית התאים כלפי פנוטיפ SMC סינטטי או תנועתיים בעיקרה. כמו כן אנו מספקים שיטה של משלוח תא המשפר את קצב engraftment של התאים מוזרקים על ידי יצירת p הפיברין המכילים ציטוקיניםAtch על הזריקה. המדבקה מופיע כדי לשפר הן החזקת התא, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני היציאה שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה של שלושה ימים לפחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות מבוצעות בהתאם להנחיות בעלי חיים מאוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם.
1. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-CMS
- מעיל הבארות של צלחת 6-היטב עם תערובת חלבונים דביקות מראש מקורר צמיחה פקטור-מופחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. לשאוב את תערובת חלבונים הדביקה לפני השימוש. זרעי hiPSCs לצלחות מראש מצופה, ותרבות התאים (1 x 10 5 תאים לכל טוב) ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס mTeSR1 תוספת בינונית עם מעכב ROCK 10 מיקרומטר.
- רענן המדיום יומי עד התאים מגיעים 90 מפגש%; אז, להוסיף תערובת חלבונים דביקה-מופחת צמיחת פקטור אל (תערובת חלבונים דביקה 0.5 מ"ג לכל צלחת 6-היטב, 2 בינוני מיליליטר לכל טוב) הבינונית, ותרבות התאים למשך 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס ימים נוספים.
- כדי להחליף את המדיום, בעדינות למצוץ את מדיום מצלחת פטרי באמצעות ואקום עםנגיעת התאים החוצה, ולהוסיף מדיום חדש בעזרת פיפטה העברה.
- ליזום בידול על ידי החלפה הבינונית עם בינוני RPMI1640 בתוספת-גורם גדילה מופחת תערובת חלבונים דביקה, B27 ללא אינסולין, ו -100 ng / ml Activin A; תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 כי כבר השלימו עם B27 ללא אינסולין, 10 ng / morphogenic העצם מ"ל חלבון 4 (BMP-4), ו -10 גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי ng / ml (bFGF); תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 96 שעות.
- החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 בתוספת B27 ולהמשיך תרבות התאים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס; לרענן את בינונית כל 3 ימים.
- שימו לב אשכולות להידבקות התאים תחת המיקרוסקופ ~ 3 ימים ממועד קבלת בידול. אסוף את האשכולות ~ 7 ימים לאחר התבוננות התכווצויות ראשונה ולשטוף אותם הנקס מאוזן תמיסת מלח.
- לנתק את התאים-התקבצו את הצלחת על ידי דוגרים אותם במאגר הנקס המכיל 100 U / IV collagenase מ"ל במשך 10 דקות ב 37 ºC עם רעד עדין; אז, להוסיף טריפסין 0.25% בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות.
- לנטרל את פתרון האנזים עם בסרום שור עוברי 10% בטווח בינוני RPMI / B27 ואז resuspend תאים במדיום RPMI / B27.
- ספירת התאים על ידי hemocytometer. התרבות התאים על צלחות 10 ס"מ ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 3, אשר יאפשר את התאים הלא-cardiomyocyte לדבוק פני השטח של המנה תרבות.
- אסוף את ההשעיה תא, אשר מכיל את hiPSC-CMS, ולשמור על תאים (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל 10 ס"מ צלחת) על ידי culturing אותם על משטח מצופה תערובת חלבונים דביקות.
2. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-ECS
- לנתק את אוכלוסיית hiPSC לתוך תאים בודדים ידי דוגרי הem עם chelating סוכן ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעביר את תאי צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר המכיל בינוני mTeSR1 טרי.
- ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. Resuspend התאים בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר מעכב ROCK. לקבוע את צפיפות התאים עם hemocytometer.
- הוסף 250 μl של 20 יחידות NIH / פתרון תרומבין מ"ל אחד טוב של צלחת 24 גם.
- הוסף 1 x 10 6 hiPSCs 250 μl של פתרון פיברינוגן 12.5 מ"ג / מ"ל. ולהוסיף 250 μl של פתרון פיברינוגן התא המכיל את תרומבין טעון היטב. שים את התערובת לחזק להקים פיגום הפיברין המכיל hiPSC בתוך דקות.
- מעבירים את הקרושה, פיגומים התא המכיל לתוך הבארות של צלחת 6-היטב עם מלקחיים מכסה זכוכית, וליזום בידול על ידי culturing הפיגומים ב 2 מ"ל בינוני EBM2 בתוספת 2% B27 ללא אינסולין,-A Activin (50 ng / מ"ל), ו- BMP-4 (25 ng / ml) עבור 24 שעות ב 5% CO
- החלף את המדיום ידי ומוצץ את המדיום הישן בעדינות באמצעות ואקום בלי לגעת תאים. הוסף בינוני EBM2 חדש בתוספת B27 ללא אינסולין, גורם (vascular endothelial growth VEGF, 50 ng / ml), אריתרופואטין (EPO, 100 ng / ml), ו β1 גורם גדילה הפיכה (TGFβ1, 10 ng / ml), ותרבות פיגומים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- רענן המדיום ותרבות הפיגומים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 אחר שעה; אז, שחרר את התאים מן הפיגום על ידי הוספת 200 IV collagenase U (100 U / ml) למדיום.
- ספין למטה התאים לאחר פרסומם. החלף בינוני עם 2 מ"ל בינוני EGM2-MV בתוספת 2% של B27,-A VEGF (מ"ל / 50 נ"ג), ו SB-431,542 (10 מיקרומטר); לרענן את בינונית כל יומיים.
- כ -10 ימים לאחר מכן (כלומר, על ~ יום 14 לאחר בידול יזמה), לנתק את התאים עם 100 U / IV collagenase מ"ל, לבודד hiPSC-ECS מקרב אוכלוסיית תאים מובחנים באמצעות-cytometry זרימה מנתח עבור ביטוי של חלבונים סמן ספציפי EC (למשל, CD31, CD144) 3.
- הרחב את hiPSC-ECS המבודדת באמצעות פרוטוקול 3 הוקם.
3. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-SMCs
- זרעי hiPSCs לצלחות כי כבר מצופות תערובת חלבונים דביקה, ותרבות התאים הבינוני mTeSR1 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס, עם שינויים בינוניים יומיים, עד ומחוברות (~ 2 ימים).
- ליזום בידול לתאי השושלת mesodermal ידי culturing התאים עם CHIR99021 (5 מיקרומטר) ו- BMP-4 (10 ng / ml) במדיום RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין במשך 3 ימים.
- כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ סינתטי בעיקר:
- התרבות התאים עם-A VEGF (מ"ל / 25 נ"ג), β גורם גדילה פיברובלסטים (FGFβ, 5 ng / ml) ב RPMI1640 לי dium, ואינסולין מינוס 2% B27 ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
- התרבות התאים-A VEGF (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) במדיום RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO 2 ו -37 ° צלזיוס למשך 2 ימים.
- תרבות תאי β גורם גדילה הנגזרות טסיות (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ (3 ng / ml) ב RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO 2 ו -37 ° צלזיוס למשך 4 ימים.
- כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ התכווצות בעיקר:
- התרבות התאים במשך 4 ימים עם-A VEGF (25 ng / ml) ו FGFβ (5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 מינוס אינסולין.
- התרבות התאים למשך 7 ימים עם PDGFβ (5 ng / ml) ו TGFβ (2.5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין.
- לטהר את אוכלוסיות hiPSC-SMC הסופי על ידי culturing התאים לקטט (4 מ"מ) המכיל בינוני מטבולית RPMI1640 עבור ~ 6 ימים.
- זית מחממים שמן ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- מקצה 5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 10% ל -50 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים את הג'לטין אל שמן, מערבבים זית, ולאחר מכן לצנן במהירות עד 5 מעלות צלזיוס על ידי הוספת קרח על אמבט מים.
- עשרים וחמש דקות מאוחר יותר, להוסיף מצונן (4 ° C) אצטון על שמן זית כדי לגרום להיווצרות microsphere.
- לשמור על טמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס במשך שעה 1; אז, לאסוף את microspheres, לשטוף אותם 5 פעמים עם אצטון מראש מקורר כדי להסיר את שמן הזית, ולאפשר להם אוויר יבש על 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend את microspheres בתמיסה של אתנול 70% ו glutaraldehyde 0.25% לילה בשעה 4 ° C. כדי לגרום cross-linking, ולאחר מכן לנטרל את התערובת עם 100 גליצין מ"מ.
- IGF טען לתוך microspheres ידי ערבוב 5 microspheres מ"ג עם 15 μl מזוקקים H 2 O המכיל IGF 5 מיקרוגרם ו -0.1% אלבומין בסרום שור למשך 30 דקות.
5. יצירת הרטייה על האתר של פציעה ו הזרקת התאים
- להשעות את CMS הנגזרות hiPSC (2 מיליון), SMCs (1 מיליון), ו ECS (1 מיליון) יחד 1 מ"ל מינימום בינוני Essential (MEM).
- להשעות 5 מ"ג של microspheres בתמיסה 1 מ"ל פיברינוגן (25 מ"ג / מ"ל).
- מלאו מזרק אחד עם תמיסה המכילה תאים, מזרק אחר עם הפתרון פיברינוגן / microsphere, ומזרק השלישי עם 1 מ"ל של תמיסת תרומבין (80 יחידות NIH / מ"ל, בתוספת 2 μl 400 מ"מ CaCl 2 ו -200 מ"מ ε-aminocaproic חוּמצָה).
- בניתוח לגרום לאוטם שריר הלב בלב החזירים באמצעות קשירת השמאלי הקדמי היורד לב כלילית כפי שתואר קודם לכן 2.
הערה: בקיצור, החזירים יורקשייר נקבה (~ 13 ק"ג, 45 ימים של גיל) מורדמים עם זריקה תוך שרירית של Telazol / Xylazine (4.4 מ"ג / ק"ג), חובר לצינור בהרדמה כללית עם isoflurane (0.5-5%). A 4 th intercפתיחת בית החזה ostal מתבצע והשאיר הקדמי היורד לב כלילית חשופה. העורק הכלילי הוא occluded ידי ליגטורה למשך 60 דקות ולאחר מכן המיתר מוסר. דפיברילציה חשמל מיידית מבוצעת במקרה של פרפור חדרים. - מקם טבעת פלסטיק סטרילית (~ 2.5 סנטימטרים) על epicardium האזור האוטם של לבבות חזירים, ולאחר מכן בעת ובעונה אחת להזריק פתרונות microsphere / פיברינוגן תרומבין לזירה.
- אפשר תערובת כדי לחזק (~ 30 שניות), ולאחר מכן להכניס את המחט של המזרק המכיל תאים באמצעות תערובת הקרושה לתוך שריר הלב אוטם ולהזריק את התאים. סגור את שכבות השריר, הרקמה התת עורית, ואת בית החזה עם 3-0 או 2-0 תפר Monocryl בהתאם לגודל החיה. עצירות 0.01-0.02 מ"ג / זריקה תוך שרירית ק"ג כל 8 שעות ישמש לשלוט בכאב עבור 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח.
- הערכת תפקוד הלב באמצעות תהודה מגנטית של הלבהדמיה (MRI) לפני הליך כירורגי, שבוע אחד וארבעה שבועות לאחר ההליך הכירורגי 2, 3, 4. לאחר מחקרי MRI הסופיים, להקריב את החיה ולעבד לבם היסטולוגיה וניתוח מולקולרי 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיון של הבדיל hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs
קיבולת ההפרש של hiPSCs הוערכה 2, 3, 4. Cytometry זרימה ניתוח לב טרופונין T (cTnT) ביטוי מראים כי טוהר האוכלוסייה hiPSC-CM הסופי יכול יעלה על 90% (איור 1A, 1B, לוח B1). כמעט כל התאים הביע איטי שרשרת כבדה שרירן (איור 1B, A1 פאנל), α-sarcomeric אקטין (איור 1B, A2 פאנל), בעוד כ 25% הביעו איזופורם 2v של שרשרת אור שרירן (MLC2v) (איור 1 ב ', פאנל B2), אשר נמצא רק חדרית CMS 4. היעילות של פרוטוקול בידול hiPSC-EC (כלומר, אחוז CD31 + תאים) היה substantially גבוה כאשר היא מבוצעת עם hiPSCs מקו כידון (45.6%, תרשים 1C, C2 פאנל) מאשר עם תאים PCBC16iPS (31.3%, תרשים 1C, פאנל D2); אוכלוסיות של טוהר 95%> הושגו באמצעות מבחר לביטוי CD31, ו> 90% של התאים שנבחרו המשיך להביע CD31 או CD144 עד 4 שבועות כאשר בתרבית בינוני EGM2-MV (ללא FBS) השלימו עם B27, VEGF, ו SB431542 (איור 1D) 3. יותר מ -94% של hiPSC-SMCs המטוהר הביעו יקטינו שריר חלק (SMA), אבל סינתטי hiPSC-SMCs נטו יותר התכווצות hiPSC-SMCs להביע קולגן 1, connexin 43, או vimentin (איור 1E). יכולת ההגירה ושגשוגם של hiPSC-SMCs הוערכה 4. HiPSC-SMCs סינתטי היו גם יותר נודדות שגשוג מאשר התכווצות hiPSC-SMCs (איור 1F, לוחות I ו- II), תוך SMCs התכווצות נדבק חזק יותר אני n התגובה לטיפול carbachol (איור 1F, לוחות iii, IV ו- V).
שחרור צמיחה פקטור מן לטין מיקרוסכמות
מדידות ELISA של IGF-1 רמות בטווח הבינוני טלאים תרבותיים, תא ללא ציינו כי גורם הגדילה שוחרר מבית microspheres על פני תקופה של 3 ימים לפחות (איור 2 א) 2. הניתוחים בוצעו על ידי טעינת 5 מ"ג של microspheres המכיל IGF עם 5 מיקרוגרם IGF-1. כתם נוצר על ידי ערבוב של microspheres עם פתרון פיברינוגן 1 מ"ל ו 1 מ"ל תרומבין. המדבקה הייתה בתרבית MEM 2 מיליליטר. אחת מ"ל של המדיום נאסף והוחלפו 1 מ"ל של טרי MEM בכל יום (תרשים 2B). נתונים הוצגו כממוצע ± SEM.
תצפיות שבוצעו במודל IR-פציעה
EP-together.within-page = "1"> היעילות של פרוטוקול תא-השתלת תיקון בתיווך שלנו נחקרה במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה 2. סך של 6 מיליון hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs (2 מיליון של כל סוג תא) הוזרקו ישירות לתוך רקמות שריר הלב הפגוע. עבור בעלי החיים בקבוצה CELL + תיקון, תיקון מורכב של הפיברין ו- IGF-1-המכיל microspheres נוצר על האתר של פציעה לפני הזריקה, בעוד בעלי החיים בקבוצה CELL טופלו התא במינון זהה, אך ללא תיקון; שני הטיפולים היו הלנה מחיות בקבוצת MI. ארבעה שבועות לאחר פציעה וטיפול, 9% מכלל התאים נמסרו לבעלי חיים בקבוצת CELL + תיקון נשמרו והמשיכו לשרוד באתר של ממשל, לעומת רק 4% מכלל התאים מנוהלים על בעלי חיים בקבוצת CELL (איור 3A). טיפול בשני תאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה גם associated עם שיפורים משמעותיים מדידות של תפקוד הלב וגודל האוטם (איור 3 ב).
איור 1: בידול של hiPSCs לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק. בידול Cardiomyocyte וטוהר hiPSC-CMS הוערכו באמצעות cytometry זרימה (א) ו היסטולוגיה עם סמנים לבביים שונים (B). הבידול האנדותל של hiPSC נקבע עם cytometry זרימה (C). התחזוקה של פנוטיפ האנדותל של hiPSC-ECS הוערכה באמצעות ניתוח ביטוי CD31 ו CD144 ב 2, 3, ו -4 שבועות לאחר טיהור ידי cytometry זרימה (ד '). בידול תא שריר החלק של hiPSC נמדד על ידי סמנים שונים (E). ופוטנציאל הגירה ושגשוגם שלתאי שריר חלק סינטטיים לעומת תאי שריר חלק התכווצות נגזרים hiPSCs הוערכו (F). גרעינים היו counterstained עם DAPI ב מכתים immunofluorescence. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (ב) ו -200 מיקרומטר (E ו- F). יכולת ההגירה ושגשוגם של סינתטי hiPSC-SMCs הוערכה (F, פנל I ו- II). והתכווצות של SMCs התכווצות בתגובה לטיפול carbachol הוערכה (F, לוח III-V). * P <0.05, סינתטי hiPSC-SMCs לעומת התכווצות hiPSC-SMCs. A ו- B שונה מ יה L, et al. 2. C ו- D שונו מן ג'אנג S, et al. 3. E ו- F שונו מן יאנג L, et al. 4. נתונים הוצגו סטיית התקן ± הממוצע של הממוצע (SEM). השוואה בין שתי קבוצות הוערכה באמצעות מבחן T של סטודנט, והשוואה בין קבוצות מרובות הוערכה באמצעות בכיוון אחד ANOVA. p <0.05 נחשב מובהקצְבִיעוּת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: שחרור של גורמי גדילה מ microspheres. IGF-המכיל microspheres היה מסונתז (א). שחרור IGF-1 מ microspheres נמדדה ב 1, 3, 5 ו -7 ימים מיום נתינתם מסונתז (B). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לוח א 'היתה שונה מן יה ל', et al. 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הערכת היעילות של טיפול בתא עם cel trilineage הנגזרות hiPSCls. שיעור engraftment הכולל לאוכלוסייה שלושה התאים הוערך 4 שבועות לאחר השתלת תאי (א). תפקוד הלב (כפי שצוין על ידי מקטע פליטה) וגודל אוטם הוערכו באמצעות MRI של הלב ב 1 ו 4 שבועות לאחר השתלת תאי (B). * P <0.05 לעומת MI; #p <0.05 לעומת תיקון. A ו- B שונה מ יה ל ', et al. 2. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. השוואות בין קבוצות נותחו על משמעות עם ANOVA חד-כיווני. p <0.05 נחשב משמעותי. תוצאות מזוהות משמעותי באמצעות ANOVA היו reanalyzed עם תיקון Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תשואה / טוהר משופר של hiPSC-CMS
פרוטוקולים קונבנציונליים להבחנה תא גזע אנושי לתוך CMS מוגבלים לעתים קרובות על ידי תשואה נמוכה וטוהר; למשל, רק 35-66% של hESC-CMS שהושגו באמצעות הפרדת Percoll היווצרות גוף לב הביעו שרשרת כבדת שרירן איטית או cTnT 6. טוהר אוכלוסיות hiPSC-CM בדיל ניתן להגדיל באופן משמעותי על ידי בחירה עבור הביטוי של גן כתב כי נקשר האמרגן של CM-ספציפי חלבון 7, 8, 9, אבל הטכניקה הזו בהכרח מחייבת השימוש מהונדס גנטי תאים אשר פחות רצויים, במיוחד עבור חקירות קליניות. עם הפרוטוקול המובא כאן, 68% של hiPSC-CMS הביעו cTnT, ועל טוהר בהמשך הוגדלה> 90% באמצעות דיסקציה מיקרו preplating ללא מניפולציה גנטית או יחידמבחר דו תאים. התשואה הכוללת הייתה ~ 3-5 מיליון hiPSC-CMS לכל טוב.
תשואה משופרת / יציבות של hiPSC-ECS
שני הנפוצים ביותר פרוטוקולי בידול hiPSC-EC מבוססים על שיתוף culturing עם תאי סטרומה בעכברי 10, 11 ו-עובריים גוף היווצרות 12, 13. עם זאת, שיטת שיתוף culturing עלולה להוביל לזיהום xenogenic עם תאים בעכברי שושלת או חלבונים 10, ורק ~ 15% או פחות של התאים המיוצר באמצעות השיטה העוברי-הגוף להניח פנוטיפ EC 10, 12, 13. פרוטוקול בידול hiPSC-EC המוצג כאן מבטל את הסיכון לזיהום xenogenic ויכול להיות עד פי 3 יעילים יותר מאשר בשיטות המשתמשות גופים עובריים (תלוי באיזה קו hiPSC משמש). Furthermעפרות, לאחר טיהור באמצעות מבחר לביטוי CD31, ~ 90% של hiPSC-ECS שומרים על הפנוטיפ EC לפחות 4 שבועות במבחנה, לעומת רק שבועות כאשר hiPSC-ECS מיוצרים באמצעות פרוטוקולי בידול קונבנציונליים 12.
מפרט פנוטיפי של hiPSC-SMCs
פנוטיפ של SMC (או אוכלוסיה של SMCs) הוא אולי הכי טוב כפי שתואר איזון בין מאפיינים תנועתיים וסינתטיים בעיקר, אשר יכול להוביל להבדלים משמעותיים במורפולוגיה, ביטוי סמן, ופעילות. לפיכך, התועלת של hiPSC-SMCs עבור יישום מסוים עשויה להיות תלויה בו פנוטיפ ספציפי נוצר. פרוטוקולי בידול טיהור hiPSC-SMC המוצגים כאן הם הראשונים לייצר בעיקר התכווצות או סינטטי אוכלוסיות SMC כי הם ~ 95% טהורים רק 2-3 שבועות, ואת הסיכון של זיהום xenogenic הוא מינימאלי, מכיוון שהתהליך לא requIRE שימוש בתאי מזין.
שיפור engraftment שערי התאים המושתלים
אחד המכשולים העיקריים לטיפול תא יעיל הוא האמין להיות המספר הנמוך מאוד של תאים מנוהלים שאינם engrafted ידי שריר הלב 14, 15, 16, 17. ציטוקינים כגון IGF-1 עשויים לשפר engraftment על ידי הפעלת התאים לעמוד במייקרו-הסביבה הרעילה יותר ברקמות איסכמי 18, 19, 20, אך בלחץ הגבוה המושרה במהלך ההתכווצות יכול לסחוט את התאים החוצה דרך מסלול המחט לתוך מחזור הפריפריה. לפיכך, השיעור הגבוה באופן משמעותי של engraftment מושג על ידי הזרקת התאים באמצעות רטיית הפיברין IGF-1-המכיל, שהייתה יותר מ -2 פי יותר משיעור נצפה כאשר סםמנת תא הדואר הייתה מנוהלת ללא התיקון, ניתן לייחס הן סביר להשפעות cytoprotective של IGF-1 וכדי התיקון עצמו, שהיווה מכשול פיזי שמנע את התאים מן שייפלט לחלל epicardial.
קריטי שלבים
כדי להבטיח את pluripotency של תאים הירכיים, יש צורך לבדוק את קריוטיפ של קו hiPSC לפני בידול, קבע את הביטוי של סמנים pluripotency (Nanog, SSEA1, ו Oct4, et al.), ולאשר את יכולתם של היווצרות תפלצת רוחנית . הוא הציע לבדוק מחדש pluripotency שלהם כאשר קווי hiPSC כבר passaged במשך יותר מ -10 דורות. מעמדו של hiPSC המובחן הוא קריטי גם עבור הבידול הנכון. ביצור מעמדה של hiPSC לפני תחילתו של בידול, מומלץ: 1) להשתמש בינוני טרי (פחות משבועיים), ולרענן את המדיום יומי לפני תחילת hiPSC differentiatיוֹן; 2) להפחית את זמן עיכול אנזימטי (פחות מ -5 דקות), ו פיפטה בעדינות מעלה ומטה התאים כדי למנוע את הפגיעה המיותרת על התאים; 3) replate התאים בצפיפות 1 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6-היטב; 4) תמיד לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור, ולהימנע שמירה על התאים מתוך האינקובטור למשך זמן ארוך יותר מ -15 דקות.
מגבלות של הטכניקה
החסרון העיקרי של השיטה שלנו לשילוב תא לב hiPSC נגזרת מוזרק ומנהל תיקון הוא הדרישה לניתוח פתוח חזה; וכך, גישה זו לא סביר שיהיה לתרגום ישירות ליישומים קליניים למעט כטיפול משלים עבור חולים אשר עוברים ניתוח וסקולריזציה כלילית במקביל. התפשטותה הרחב יותר לשימוש קליני ידרוש פיתוח של שיטת הצגה מעשית פולשנית, כגון גישת endoscope- ו קטטר מבוסס היכול לגשתבלב דרך הבטן והסרעפת. יתר על כן, אחת דאגות בטיחות הקריטיות ביותר הקשורים טיפול בתאי לב היא התפתחות סיבוכי arrhythmogenic, וכאשר הקופים טופלו בזריקות intramyocardial של 1 מיליארדים CMS נגזר hESC, כל הארבעה החיות פתחו הפרעות קצב ספונטניים 21. עם זאת, צפינו שום עדות לסיבוכי arrhythmogenic כאשר 10 מיליון CMS נגזר hiPSC הוזרקו לבם של חזירים עם IR פגיע 2, אולי משום מנת התא הייתה פי 100 יותר.
יישומים או כיוונים עתידיים
דחייה חיסונית סבירה ממלא תפקיד חשוב עבור שיעור engraftment הנמוך. מערכת עריכת גן CRISPR / קאש עשויה לאפשר לחוקרים ליצור קו של hiPSCs "תורם אוניוורסלי" על ידי לדפוק (KO) מורכב histocompatibility הגדולה (MHC) בכיתה אני ומעמד שני. MHC hiPSC KO הנגזרות תאים ורקמות רשאי hתרוויח מזה באופן משמעותי את שיעור גבוה יותר של engraftment. כמו טכניקות לשיפור, שיעורי engraftment צפויים להגדיל. בשלב מסוים של הגידול בגודל השתל, השתל הגדול צפוי להגדיל את arrhythmogenicity של לב הנמען. צמצום arrhythmogenicity שתלים קשורים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בתאים עם עלייה של ביטוי חלבוני צומת פער על ידי עריכת טכנולוגית הגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
