Summary
Vi presenterer tre nye og mer effektive protokoller for å differensiere menneskeskapte pluripotent stamceller til kardiomyocytter, endotelceller og glatte muskelceller og en leveringsmåte som bedrer innpoding av transplanterte celler ved å kombinere celleinjeksjon med patch-mediert cytokin levering.
Abstract
Menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) må være fullt differensiert i spesifikke celletyper før administrering, men konvensjonelle protokoller for å differensiere hiPSCs inn cardiomyocytes (hiPSC-CMS), endotelceller (hiPSC-ECS), og glatte muskelceller (SMC) er ofte begrenset av lavt utbytte, renhet og / eller dårlig fenotypisk stabilitet. Her presenterer vi nye protokoller for generering hiPSC-CMs, -ECs og -SMCs som er vesentlig mer effektiv enn konvensjonelle metoder, så vel som en fremgangsmåte for å kombinere celleinjeksjon med et cytokin holdig lapp skapt over administreringsstedet. Plasteret forbedrer både retensjonen av de injiserte cellene, ved å tette kanylen spor for å hindre at cellene fra å bli presset ut av myokard, og celleoverlevelse, ved å frigjøre insulin-lignende vekstfaktor (IGF) over en lengre periode. I et svin modell av myokardiskemi-reperfusjonsskade, frekvensen av engraftment var mer enn to ganger større nårceller ble administrert med cytokin-holdige patch sammenligne til cellene uten lappen, og behandling med både celler og lappen, men ikke med cellene alene, var forbundet med betydelige forbedringer i hjertefunksjon og infarktstørrelsen.
Introduction
Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) er blant de mest lovende agenter for regenerativ celleterapi fordi de kan bli differensiert i et potensielt ubegrenset utvalg og mengde av celler som ikke er avvist av pasientens immunsystem. Imidlertid kan deres evne til selv-replikasjon og differensiering også føre til tumordannelse og følgelig hiPSCs må være fullt differensiert i spesifikke celletyper, slik som kardiomyocytter (CMS), endotelceller (ECS) og glatte muskelceller (SMC ), før administrasjon. En av de enkleste og mest vanlige fremgangsmåter for administrering celle er direkte intramyocardial injeksjon, men antallet av transplanterte celler som er innpodet med den native myokardialt vev er usedvanlig lav. Mye av denne slitasje kan tilskrives den cytotoksiske miljøet i ischemisk vev; imidlertid, når muse-embryonale stamceller (ESCS) ble injisert direkte inn i hjertemuskelen av uskadde hjerter, oare ~ 40% av de 5 millioner celler som leveres ble opprettholdt i 3-5 timer 1, noe som antyder at en betydelig del av den administrerte cellene kommet ut av administrasjonsstedet, kanskje fordi de ble presset ut gjennom nålen sporet ved de høye trykk som produseres i løpet av hjerteinfarkt sammentrekning.
Her presenterer vi nye og vesentlig mer effektive metoder for å generere hiPSC-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMS) 2, endotelceller (hiPSC-ECS) 3, og glatte muskelceller (SMC) 4. Spesielt er dette hiPSC-SMC protokollen den første til å etterligne det brede spekter av morfologiske og funksjonelle egenskaper observert i somatisk SMC 5 ved å rette cellene mot en overveiende syntetisk eller kontraktile SMC fenotype. Vi gir også en fremgangsmåte for celle-levering som forbedrer innpoding frekvensen av injiserte celler ved å skape en cytokin-inneholdende fibrin patch over injeksjonsstedet. Plasteret ser ut til å forbedre både celleansamlinger, ved å tette kanylen spor for å hindre at celler fra å gå ut av hjertemuskelen, og celleoverlevelse, ved å frigjøre insulin-lignende vekstfaktor (IGF) over en periode på minst tre dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer er utført i samsvar med Animal retningslinjer ved University of Alabama i Birmingham.
1. Skille hiPSCs inn hiPSC-CMS
- Belegge brønnene i en 6-brønns plate med på forhånd avkjølt vekstfaktor-redusert gelatinøse proteinblanding ved 4 ° C til over natten. Aspirer geléaktige proteinblandingen før bruk. Seed de hiPSCs på de på forhånd belagte plater, og kulturen cellene (1 x 10 5 celler per brønn) i 5% CO2 og 37 ° C i mTeSR1 medium supplement med 10 pM ROCK inhibitor.
- Oppdater medium daglig til cellene når 90% samløpet; deretter, tilsett vekstfaktor-redusert gelatinøse proteinblandingen til mediet (0,5 mg geléaktige proteinblanding per seks-brønns plate, 2 ml medium pr brønn), og kulturen cellene i 5% CO2 og 37 ° C to dager.
- For å erstatte mediet forsiktig suge ut mediet fra petriskål via vakuum medut berøre cellene, og legge til nye medium med en overføring pipette.
- Initiere differensiering ved å erstatte mediet med RPMI1640 medium supplert med vekstfaktor-redusert gelatinøse proteinblandingen, B27 uten insulin, og 100 ng / ml aktivin A; kulturen av cellene ved 5% CO2 og 37 ° C i 24 timer.
- Erstatte mediet med RPMI1640 medium som er supplert med B27 uten insulin, 10 ng / ml benmorfogent protein 4 (BMP-4), og 10 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF); kulturen av cellene ved 5% CO2 og 37 ° C i 96 timer.
- Erstatte mediet med RPMI1640 medium supplementert med B27 og fortsette kultur cellene ved 5% CO2 og 37 ° C; oppdatere medium hver 3. dag.
- Observer klynger av entreprenør celler under mikroskop ~ 3 dager etter oppstart av differensiering. Samle klynger ~ 7 dager etter først å observere sammentrekninger og vaske dem i Hanks Balanced Salt Solution.
- Dissosiere de grupperte-cellene i platen ved å inkubere dem i Hanks buffer inneholdende 100 U / ml kollagenase IV i 10 minutter ved 37 ° C med forsiktig risting; deretter, tilsett 0,25% trypsin i etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 5 min.
- Nøytralisere enzymoppløsning med 10% føtalt bovint serum i RPMI / B27 medium og deretter resuspender cellene i RPMI / B27 medium.
- Telle antall celler ved hemocytometer. Culture cellene på 10 cm skåler med 5% CO2 og 37 ° C i minst 3 timer, noe som gjør at de ikke-cardiomyocyte celler til å holde fast på overflaten av kulturskålen.
- Samle cellesuspensjonen, som inneholder hiPSC-CMs, og opprettholde cellene (ca. 1 x 10 6 celler pr 10 cm skål) ved å dyrke dem på en gelatinaktig blanding protein-belagte overflate.
2. Skille hiPSCs inn hiPSC-egenkapitalbevis
- Distansere den hiPSC befolkningen i enkeltceller ved å inkubere them med chelaterende middel ved 5% CO2 og 37 ° C i 5 minutter. Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør inneholdende friskt mTeSR1 medium.
- Spinne ned cellene ved 200 xg i 5 minutter. Resuspender cellene i mTeSR1 medium supplert med 10 uM ROCK inhibitor. Bestemme celletettheten med et hemocytometer.
- Tilsett 250 ul 20 NIH enheter / ml trombin-oppløsning til en brønn av en 24-brønns plate.
- Tilsett 1 x 10 6 hiPSCs til 250 pl av en 12,5 mg / ml fibrinogen-oppløsning. Og tilsett 250 ul celle-inneholdende fibrinogen løsning på trombin-lastet brønnen. Observer blandingen stivner for å danne en hiPSC holdig fibrin stillas innenfor min.
- Overfør den størknede, celleholdig stillasene inn i brønnene i en 6-brønns plate med dekkglasset tang, og initiere differensiering ved dyrking av stillasene i 2 ml EBM2 medium supplert med 2% B27 uten insulin, aktivin-A (50 ng / ml), og BMP-4 (25 ng / ml) i 24 timer ved 5% CO
- Erstatt mediet forsiktig suge ut det gamle mediet via vakuum uten å berøre cellene. Legg til ny EBM2 medium tilsatt B27 uten insulin, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF, 50 ng / ml), erytropoietin (EPO, 100 ng / ml), og transformerende vekstfaktor β1 (TGFβ1, 10 ng / ml), og kultur stillasene ved 5% CO 2 og 37 ° C i 48 timer.
- Oppdater medium og kultur stillasene ved 5% CO 2 og 37 ° C for en annen 48 timer; deretter, slipper cellene fra stillaset ved tilsetning av 200 U kollagenase IV (100 U / ml) til mediet.
- Spinn ned cellene etter at de er utgitt. Erstatte mediet med 2 ml EGM2-MV-medium supplert med 2% av B27, VEGF-A (50 ng / ml), og SB-431542 (10 uM); oppdatere medium annenhver dag.
- Omtrent 10 dager senere (dvs. på ~ Dag 14 etter differensiering ble initiert), distansere cellene med 100 U / ml kollagenase IV, isolere hIPSC-egenkapitalbevis fra populasjonen av differensierte celler via flow-cytometri analyser for uttrykket av EF-spesifikke markørproteiner (f.eks CD31, CD144) 3.
- Utvid isolert hiPSC-egenkapitalbevis via en etablert protokoll 3.
3. Skille hiPSCs inn hiPSC-SMC
- Seed de hiPSCs på plater som er blitt belagt med gelatinaktig proteinblandingen, og kulturen cellene i mTeSR1 medium ved 5% CO2 og 37 ° C, med daglige medium endres, inntil sammenflytende (~ 2 dager).
- Initiere differensiering til mesodermal-avstamning celler ved dyrking av cellene med CHIR99021 (5 uM) og BMP-4 (10 ng / ml) i RPMI 1640 medium og 2% B27 pluss insulin i 3 dager.
- Å produsere hiPSC-SMC med en overveiende syntetisk fenotype:
- Culture cellene med VEGF-A (25 ng / ml), fibroblast vekstfaktor (β FGFβ, 5 ng / ml) i RPMI 1640 meg dium, og 2% B27 minus insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 4 dager.
- Kultur ble cellene i VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) i RPMI 1640 medium, og 2% B27 pluss insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 2 dager.
- Kultur ble cellene i blodplateavledet vekstfaktor (β PDGFβ, 10 ng / ml), TGFp (3 ng / ml) i RPMI 1640, og 2% B27 pluss insulin ved 5% CO2 og 37 ° C i 4 dager.
- Å produsere hiPSC-SMC med en overveiende kontraktile fenotype:
- Kultur i cellene for 4 dager med VEGF-A (25 ng / ml) og FGFβ (5 ng / ml) i RPMI 1640 og 2% B27 minus insulin.
- Kultur av cellene i 7 dager med PDGFβ (5 ng / ml) og TGFp (2,5 ng / ml) i RPMI 1640 og 2% B27 pluss insulin.
- Rense den endelige hiPSC-SMC populasjoner ved dyrking av cellene i laktat (4 mM) inneholdende RPMI 1640 medium for metabolsk ~ 6 dager.
- Varme olivenolje til 45 ° C i et vannbad.
- Varme 5 ml 10% gelatin-oppløsning til 50 ° C.
- Tilsett gelatin til den olivenolje, rør, og deretter raskt avkjøles til 5 ° C ved tilsetning av is til vannbadet.
- Tjuefem minutter senere, tilsett avkjølt (4 ° C) aceton til olivenolje for å indusere mikrosfære formasjon.
- Holde temperaturen ved 5 ° C i 1 time; deretter, samle mikrokulene, vaske dem 5 ganger med på forhånd avkjølt aceton for å fjerne olje, og tillate dem å lufttørke ved 4 ° C.
- Resuspendere mikrokulene i en oppløsning av 70% etanol og 0,25% glutaraldehyd over natten ved 4 ° C for å indusere tverrbinding, og deretter nøytralisere blandingen med 100 mM glycin.
- Belastning IGF i mikrosfærene ved å blande 5 mg mikrokuler med 15 ul destillert H2O inneholdende 5 ug IGF og 0,1% bovint serumalbumin i 30 min.
5. Opprette Patch over skadestedet og injisering av celler
- Heng hiPSC-avledet CMS (2.000.000), SMC (1 million), og egenkapitalbevis (1 million) sammen i 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Suspendere 5 mg mikrokuler i 1 ml fibrinogen-oppløsning (25 mg / ml).
- Fylle en sprøyte med den celle-inneholdende oppløsning, en annen sprøyte med fibrinogen / mikrosfære-løsning, og en tredje sprøyte med 1 ml trombin-oppløsning (80 NIH-enheter / ml, supplert med 2 pl 400 mM CaCl2 og 200 mM ε-aminokapronsyre syre).
- Kirurgisk indusere hjerteinfarkt hos svin hjertet via ligation av venstre fremre nedstigende koronar som beskrevet før to.
MERK: I korte trekk, kvinnelig Yorkshire svin (~ 13 kg, 45 dager gammel) blir bedøvet med intramuskulær injeksjon av Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), og intubert under generell anestesi med isofluran (0,5-5%). En 4 th intercOstal torakotomi utføres og venstre fremre nedstigende koronar er utsatt. Koronar er okkludert med en ligatur i 60 minutter og deretter ligaturen er fjernet. Umiddelbar elektrisk defibrillering er utført i tilfelle av ventrikkelflimmer. - Plasser en steril plastringen (~ 2,5 cm) på epikardet av infarkt regionen svin hjerter, og deretter samtidig injisere mikrosfære / fibrinogen og trombin løsninger inn i ringen.
- La blandingen stivne (~ 30 sek), og deretter sette inn nålen av cellen som inneholder sprøyte gjennom størknet blandingen i infarkthjertemuskelen og injisere cellene. Lukk muskel lag, underhud, og brystveggen med 3-0 eller 2-0 monocryl sutur avhengig dyr størrelse. Buprenorfin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulær injeksjon hver 8. time blir brukt for å kontrollere smerte i de første 3 dager etter operasjonen.
- Vurdere hjertefunksjon ved hjelp av en hjerte magnetisk resonansimaging (MRI) før kirurgisk inngrep, en uke og fire uker etter den kirurgiske prosedyren 2, 3, 4. Etter den endelige MRI undersøkelser, ofrer dyret og behandle deres hjerter for histologi og molekylær analyse 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av Differensiert hiPSC-CMS, -ECs, og -SMCs
Differensial kapasitet på hiPSCs ble evaluert to, tre, fire. Flowcytometri analyser av hjerte troponin T (cTnT) ekspresjon tyder på at renheten av slutt hiPSC-CM befolkning kan overstige 90% (figur 1A, 1B, panel B1). Nesten alle cellene uttrykte langsom myosin tung kjede (figur 1B, panel A1), α-sarcomeric aktin (figur 1B, panel A2), mens ca. 25% uttrykt 2v isoform av myosin lettkjede (MLC2v) (figur 1 B, panel B2), som ble funnet bare i ventrikkel CMS 4. Effektiviteten av hiPSC-EC differensiering protokollen (dvs. den prosent av CD31 + celler) var substantially høyere når utført med hiPSCs fra tak linjen (45,6%, figur 1C, panel C2) enn med PCBC16iPS celler (31,3%, figur 1C, panel D2); populasjoner av> 95% renhet ble oppnådd via utvalg for CD31 ekspresjon, og> 90% av de valgte cellene fortsatte å uttrykke CD31 eller CD144 i opptil 4 uker når de dyrkes i EGM2-MV medium (uten FBS) supplert med B27, VEGF, og SB431542 (figur 1D) 3. Mer enn 94% av den rensede hiPSC-SMC uttrykt glattmuskel aktin (SMA), men syntetiske hiPSC-SMC var mer sannsynlig enn kontraktile hiPSC-SMC for å uttrykke en kollagen, connexin 43, eller vimentin (figur 1E). Migrasjon og spredning evnen til hiPSC-SMC ble evaluert fire. Syntetisk hiPSC-SMC var også mer trekkende og proliferativ enn kontraktile hiPSC-SMC (figur 1F, paneler I og II), mens kontraktile SMC kontrahert sterkere in respons til karbakol behandling (figur 1F, paneler iii, iv og v).
Vekst-faktor versjonen fra Gelatin mikrosfære
ELISA-målinger av IGF-1 nivåene i medium fra dyrkede, cellefrie flekker indikerte at vekstfaktoren ble frigitt fra mikrokulene i løpet av en periode på minst 3 dager (figur 2A) 2. Analysene ble utført ved å laste 5 mg av IGF-inneholdende mikrosfærer med 5 ug IGF-1. En lapp ble generert ved å blande mikrokulene med 1 ml fibrinogen-oppløsning, og 1 ml trombin. Lappen var dyrket i 2 ml MEM. En ml av mediet ble samlet opp og erstattet med 1 ml friskt MEM hver dag (figur 2B). Data ble presentert som gjennomsnitt ± SEM.
Observasjoner fra en IR-skade Model
2. En total på 6 millioner hiPSC-CMs, -ECs, og -SMCs (2 millioner av hver celletype) ble injisert direkte inn i det skadede myokardiale vevet. For dyr i CELL + Patch gruppe, en lapp bestående av fibrin, og IGF-1-holdige mikrokuler ble laget over skadestedet før injeksjon, mens dyrene i CELL gruppe ble behandlet med den samme celle dose, men uten at lappen; begge behandlingene ble holdt tilbake fra dyr i MI-gruppen. Fire uker etter skaden og behandling, 9% av cellene levert til dyr i CELL + Patch gruppe ble beholdt og fortsatte å overleve på administreringsstedet, sammenlignet med bare 4% av cellene administreres til dyr i cellegruppen (figur 3A). Behandling med både celler og lappen, men ikke med cellene alene, var associ ogsårerte med betydelige forbedringer i målinger av hjertefunksjon og infarktstørrelse (figur 3B).
Figur 1: Differensiering av hiPSCs til kardiomyocytter, endotelceller og glatte muskelceller. Kardiomyocytt differensiering og renheten av hiPSC-CMs ble evaluert via flowcytometri (A) og histologi med forskjellige hjertemarkører (B). Endotelial differensiering av hiPSC ble bestemt ved flowcytometri (C). Vedlikeholdet av endotelial fenotypen til hiPSC-ECS ble vurdert gjennom å analysere ekspresjon av CD31 og CD144 ved 2, 3 og 4 uker etter rensing ved flowcytometri (D). Den glatte muskelcelledifferensiering av hiPSC ble målt ved hjelp av forskjellige markører (E). Og migrering og proliferasjon av potensiellsyntetiske glatte muskelceller som kontra kontraktile glatte muskelceller avledet fra hiPSCs ble vurdert (F). Kjerner ble kontra med DAPI i immunfluorescens farging. Målestokk = 100 mikrometer i (B) og 200 nm (E og F). Migrasjon og proliferasjon evne av syntetisk hiPSC-SMC ble evaluert (F, panel I og II). Og sammentrekning av kontraktile SMC i respons til karbakol behandling ble vurdert (F, panel iii-v). * P <0,05, syntetisk hiPSC-SMC vs. kontraktile hiPSC-SMC. A og B ble modifisert fra Ye L, et al. 2. C og D som ble modifisert fra Zhang S, et al. 3. E og F ble modifisert fra Yang L, et al. 4. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Sammenligning mellom to grupper ble evaluert via Students T-test og sammenligning mellom flere grupper ble vurdert gjennom enveis ANOVA. p <0,05 ble ansett signifiskrånende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Utslipp av vekstfaktorer fra sfærer. IGF-holdige mikrokuler ble syntetisert i (A). IGF-1-frigjøring fra mikrokuler ble målt ved 1, 3, 5 og 7 dager etter at de var syntetisert i (B). Scale bar = 200 mikrometer. Panel A ble modifisert fra Ye L., et al. 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vurdering av effektiviteten av celleterapi med hiPSC-avledet trelinjet cells. Den samlede innpoding hastighet for de tre cellepopulasjon ble bedømt 4 uker etter celletransplantasjon (A). Hjertefunksjon (som indikert ved ejeksjonsfraksjon) og infarktstørrelse ble evaluert via hjerte MR 1 og 4 uker etter celletransplantasjon (B). * P <0,05 versus MI; #p <0,05 versus Patch. A og B ble modifisert fra Ye L., et al. 2. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SEM. Sammenligninger mellom grupper ble analysert for signifikans med enveis ANOVA. p <0,05 ble betraktet som signifikant. Resultater identifisert som betydelige via ANOVA ble reanalysert med Tukey korreksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbedret Yield / Purity av hiPSC-CMS
Konvensjonelle protokoller for differensiering menneskelige stamceller til CMS er ofte begrenset av lav rente og renhet; for eksempel, fikk bare 35-66% av hESC-CMS via Percoll separasjon og hjerte kroppen dannelsen uttrykt treg myosin tung kjede eller cTnT 6. Renheten av differensierte hiPSC-CM populasjoner kan økes vesentlig ved å velge for ekspresjon av et reportergen som har vært knyttet til promoteren til en CM-spesifikt protein 7, 8, 9, men denne teknikk nødvendigvis krever bruk av genetisk modifiserte celler, som er mindre ønskelige, spesielt for klinisk utprøving. Med protokollen presenteres her, 68% av hiPSC-CMS uttrykt cTnT, og renheten ble senere økt til> 90% via micro-disseksjon og forhåndspålegg uten genetisk manipulering eller singel-celle utvalg. Det totale utbytte var ~ 3-5 millioner hiPSC-CMs per brønn.
Forbedret Yield / Stabilitet av hiPSC-egenkapitalbevis
De to mest brukte hiPSC-EC differensiering protokoller er basert på co-dyrking med murine stromale celler 10, 11 og embryonale-kropp formasjon 12, 13. Imidlertid kan det ko-dyrkning metode fører til xenogen forurensning med murin-avstamning celler eller proteiner 10, og bare ~ 15% eller mindre av cellene produseres via den embryoniske-legemet metode går ut fra en EC fenotype 10, 12, 13. Den hiPSC-EC differensiering protokollen presenteres her eliminerer risikoen for xenogen forurensning og kan være opp til tre ganger mer effektiv enn metodene som bruker embryonale organer (avhengig av hvilken hiPSC linjen brukes). Furthermmalm, etter rensing via utvalg for CD31 uttrykk, ~ 90% av hiPSC-egenkapitalbevis opprettholdt EF fenotype i minst 4 uker i vitro, sammenlignet med bare to uker når hiPSC-egenkapitalbevis er produsert via vanlige differensieringsprotokoller 12.
Fenotypisk Spesifikasjon av hiPSC-SMC
Fenotypen av en SMC (eller en populasjon av SMC) er kanskje best beskrives som en balanse mellom overveiende kontraktile og syntetiske egenskaper, noe som kan føre til betydelige forskjeller i morfologi, men da ekspresjon og aktivitet. Således kan nytten av hiPSC-SMC for en spesiell anvendelse avhenger av hvilken spesifikk fenotype blir generert. De hiPSC-SMC differensiering og rensing protokollene som presenteres her er de første til å produsere hovedsakelig kontraktile eller syntetiske SMC bestander som er ~ 95% ren på bare 2-3 uker, og risikoen for xenogen forurensning er minimal, fordi prosedyrene ikke requIRE bruk av feeder-celler.
Forbedret engraftment Valuta transplanterte cellene
En av de viktigste hindringer for effektiv celleterapi er antatt å være den ekstremt lavt antall administrerte celler som er innpodet med myokard 14, 15, 16, 17. Cytokiner så som IGF-1 kan forbedre innpoding ved at cellene til å bedre motstå den toksiske mikromiljøet i ischemiske vev 18, 19, 20, men de høye trykk som induseres i løpet av sammentrekning kan klemme cellene ut gjennom nålen sporet og inn i den perifere sirkulasjon. Dermed blir betydelig høyere rate av innpoding oppnås ved å injisere cellene gjennom en IGF-1-inneholdende fibrin lapp, som var mer enn 2 ganger høyere enn hastigheten observert når same celle dose ble administrert uten lappen, kan sannsynligvis tilskrives både til cellebeskyttende virkningene av IGF-1 og til plasteret selv, som dannet en fysisk barriere som hindret cellene fra å bli matet ut i epikardiell plass.
kritiske Steps
For å sikre pluripotency av hoftene celler, er det nødvendig å kontrollere karyotype av hiPSC linjen før differensiering, bestemme uttrykket av pluripotency markører (Nanog, SSEA1, og Oct4, et al.), Og bekrefte sin evne til teratom formasjon . Det er foreslått å re-sjekk deres pluripotency når hiPSC linjene har blitt dyrket i mer enn 10 generasjoner. Statusen til udifferensierte hiPSC er også avgjørende for riktig differensiering. For å sikre status for hiPSC før initiering av differensiering, er det anbefalt å: 1) bruke fersk medium (mindre enn to uker gamle), og oppdatere medium daglig før oppstart av hiPSC differentiation; 2) redusere den enzymatiske fordøyelse tid (mindre enn 5 min), og forsiktig pipettere opp og ned cellene for å hindre unødvendig skade på cellene; 3) replate cellene ved en tetthet på 1 x 10 5 celler per brønn på 6-brønners plate; 4) alltid holde cellene i 37 ° C og 5% CO2 inkubator, og unngå å holde cellene ut av inkubatoren i lengre tid enn 15 min.
Begrensninger av teknikken
Den primære ulempe ved vår metode for kombinering av injiserte hiPSC-avledede hjerteceller og lapp administrering er kravet til åpen bryst kirurgi; derfor er usannsynlig å være direkte oversettes til kliniske anvendelser unntatt som tilleggsbehandling for pasienter som gjennomgår samtidig koronar revaskularisering kirurgi denne tilnærmingen. Mer utbredt klinisk anvendelse vil kreve utvikling av en praktisk og minimalt invasiv leveringsmetode, for eksempel en endoscope- og kateterbasert tilnærming som kan få tilganghjertet gjennom magen og membranen. Videre er et av de mest kritiske sikkerhetsproblemer i forbindelse med hjertecelleterapi er utvikling av arytmogene komplikasjoner, og når aper ble behandlet med intramyocardial injeksjoner av 1 milliard hESC-avledede CMs, alle fire av dyrene utviklet spontane arytmier 21. Men observerte vi ingen bevis for arytmogene komplikasjoner når 10 millioner hiPSC-avledet CMS ble injisert inn i hjertene til svin med IR skade to, kanskje fordi cellen dose var 100 ganger mindre.
Fremtidige applikasjoner eller Veibeskrivelse
Immunavstøtning spiller sannsynligvis en viktig rolle for den lave engraftment hastighet. Den CRISPR / Cas genet redigering systemet kan muliggjøre forskere å lage en linje av "universell donor" hiPSCs etter knock out (KO) store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I og klasse II. De hiPSC MHC KO-avledet celler og vev kan have betydelig høyere forekomst av engraftment. Som teknikker bedre, engraftment priser vil trolig øke. På visst punkt av økningen pode størrelse, er den store pode forventes å øke arrhythmogenicity til mottakeren hjerte. Reduksjonen av transplantater i forbindelse arrhythmogenicity kunne oppnås ved anvendelse av celler med økning av gap junction proteiner ekspresjon av genet redigering teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
