Summary
نقدم ثلاثة بروتوكولات جديدة وأكثر كفاءة للتمييز الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان إلى العضلية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء وطريقة التسليم أن يحسن engraftment من الخلايا المزروعة عن طريق الجمع بين حقن الخلايا مع بوساطة التصحيح تسليم خلوى.
Abstract
الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) يجب أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا قبل الإدارة، ولكن البروتوكولات التقليدية للتمييز hiPSCs إلى العضلية (hiPSC-CMS)، والخلايا البطانية (hiPSC-ECS)، وخلايا العضلات الملساء (SMCS) غالبا ما تكون محدودة بسبب العائد المنخفض، والنقاء، و / أو ضعف الاستقرار المظهرية. هنا، نقدم بروتوكولات جديدة لتوليد hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs التي هي إلى حد كبير أكثر كفاءة من الطرق التقليدية، فضلا عن طريقة للجمع بين حقن الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى تم إنشاؤها على موقع الإدارة. التصحيح يحسن كلا من الإبقاء على حقن الخلايا، بإغلاق الطريق إبرة لمنع الخلايا من طرده من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى فترة ممتدة. في نموذج الخنازير من عضلة القلب إصابة نقص التروية، ضخه، كان معدل engraftment أكثر من شقين أكبر عندماكانت تدار الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى مقارنة مع الخلايا دون التصحيح، والمعاملة مع كل من الخلايا والتصحيح، ولكن ليس مع الخلايا وحدها، كان مرتبطا مع تحسينات كبيرة في وظيفة القلب وحجم احتشاء.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي من بين العوامل الواعدة لعلاج الخلايا على التجدد لأنها يمكن أن تكون متباينة في مجموعة ويحتمل أن تكون غير محدودة وكمية من الخلايا التي لا يرفضها الجهاز المناعي للمريض. ومع ذلك، قدرتها على النسخ المتماثل الذات والتمايز يمكن أن يؤدي أيضا إلى تشكيل الورم، وبالتالي تحتاج إلى أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا، مثل العضلية (CMS)، والخلايا البطانية (ECS)، وخلايا العضلات الملساء hiPSCs (SMCS )، قبل الإدارة. واحد من أبسط والأكثر شيوعا أساليب إدارة الخلية هو حقن داخل عضلة القلب مباشرة، ولكن عدد الخلايا المزروعة التي المغروسة من قبل الأنسجة القلبية المحلية منخفضة بشكل استثنائي. الكثير من هذا الاستنزاف يمكن أن يعزى إلى البيئة السامة للخلايا الأنسجة الدماغية. ومع ذلك، عندما كانت الفئران الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) حقنها مباشرة في عضلة القلب من قلوب لم يصب، سنلي ~ 40٪ من 5 ملايين الخلايا تسليمها تم الاحتفاظ لمدة 3-5 ساعة 1، مما يشير إلى أن نسبة كبيرة من الخلايا تدار خرجت موقع الإدارة، ربما لأنهم يحرمونهم من خلال المسار الإبرة من الضغوط العالية التي تنتج أثناء تقلص عضلة القلب.
هنا، فإننا نقدم طرق جديدة وإلى حد كبير أكثر كفاءة لتوليد العضلية المستمدة hiPSC (hiPSC-CMS) 2، والخلايا البطانية (hiPSC-ECS) 3، وخلايا العضلات الملساء (SMCS) 4. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول hiPSC-SMC هو اول محاولة لتقليد مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والوظيفية لوحظ في الجسدية SMCS 5 عن طريق توجيه الخلايا نحو SMC النمط الظاهري في الغالب الاصطناعية أو مقلص. ونحن نقدم أيضا وسيلة لتسليم خلية التي تعمل على تحسين معدل engraftment من حقن الخلايا عن طريق إنشاء التي تحتوي على خلوى الفيبرين صatch على موقع الحقن. ويبدو أن التصحيح لتحسين كل من الاحتفاظ خلية عن طريق ختم المسار إبرة لمنع الخلايا من الخروج من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى ثلاثة أيام على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ كافة الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الحيوان من جامعة ألاباما في برمنغهام.
1. التفريق hiPSCs إلى hiPSC-مضادة
- معطف الآبار من لوحة 6 جيدا مع انخفاض النمو عامل تبريد قبل خليط من البروتين هلامي عند 4 درجة مئوية لمدة ليلة وضحاها. نضح خليط من البروتين هلامي قبل الاستخدام. البذور وhiPSCs على لوحات مطلية مسبقا، والثقافة الخلايا (1 × 10 5 خلية لكل بئر) في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية في mTeSR1 ملحق المتوسط مع 10 ميكرومتر ROCK المانع.
- تحديث المتوسطة يوميا حتى الخلايا تصل إلى 90٪ التقاء. ثم، إضافة خفض النمو عامل خليط من البروتين هلامي إلى متوسطة (0.5 ملغ هلامي خليط من البروتين لكل لوحة 6 جيدا، 2 مل المتوسطة لكل بئر)، وثقافة الخلايا لمدة 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية يومين آخرين.
- لتحل محل المتوسطة، وتمتص بلطف من المتوسط من طبق بتري عبر فراغ معمن لمس الخلايا، وإضافة وسيلة جديدة باستخدام ماصة نقل.
- بدء المفاضلة عن طريق استبدال المتوسطة مع RPMI1640 تستكمل مع نمو عامل تخفيض خليط من البروتين هلامي، B27 دون الانسولين، و 100 نانوغرام / مل Activin A؛ ثقافة الخلايا في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- استبدال المتوسطة مع RPMI1640 التي تم تستكمل مع B27 دون الانسولين، 10 نانوغرام / مل بروتين morphogenic العظام 4 (BMP-4)، و 10 مل عامل نانوغرام / الأساسي نمو الخلايا الليفية (bFGF)؛ ثقافة الخلايا في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 96 ساعة.
- استبدال المتوسطة مع RPMI1640 تستكمل مع B27 ومواصلة ثقافة الخلايا في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. تحديث المتوسط كل 3 أيام.
- مراقبة مجموعات من التعاقد الخلايا تحت المجهر ~ 3 أيام بعد بدء التمايز. جمع الكتل ~ 7 أيام بعد أن لاحظت أولا تقلصات وغسلها في هانكس محلول ملحي متوازن.
- فصل من خلايا عنقودية في لوحة التي يحتضنها منهم في المخزن هانكس تحتوي على 100 وحدة / مل كولاجيناز الرابع لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع طيف تهتز. ثم، تضاف 0.25٪ التربسين في ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لمدة 5 دقائق.
- تحييد الحل الانزيم مع 10٪ مصل بقري جنيني في RPMI / متوسطة B27 ثم resuspend الخلايا في RPMI / B27 المتوسطة.
- حساب عدد الخلايا عدادة الكريات. ثقافة الخلايا على أطباق 10 سم في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة، والتي سوف تسمح للخلايا غير cardiomyocyte التمسك سطح الطبق الثقافة.
- جمع تعليق خلية، والذي يحتوي على hiPSC-مضادة، والحفاظ على الخلايا (حوالي 1 × 10 6 خلايا في صحن 10 سم) من خلال زرع لهم على سطح المغلفة بروتين خليط هلامي.
2. التفريق hiPSCs إلى hiPSC-ECS
- فصل السكان hiPSC إلى الخلايا وحيدة التي يحتضنها عشرم مع مخلبية وكيل في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على المتوسط mTeSR1 جديدة.
- تدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend الخلايا في mTeSR1 المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر ROCK المانع. تحديد كثافة الخلايا مع عدادة الكريات.
- إضافة 250 ميكرولتر من 20 وحدة المعاهد الوطنية للصحة / حل الثرومبين مل إلى جانب واحد من 24 لوحة جيدا.
- إضافة 1 × 10 6 hiPSCs إلى 250 ميكرولتر من 12.5 ملغ / مل حل الفيبرينوجين. وإضافة 250 ميكرولتر من حل الفيبرينوجين التي تحتوي على الخلية إلى الثرومبين محملة جيدا. مراقبة خليط يصلب لتشكيل سقالة الفيبرين التي تحتوي على hiPSC داخل دقيقة.
- نقل عزز، السقالات التي تحتوي على خلية في الآبار لوحة 6 جيدا مع ملقط غطاء زجاجي، والشروع في التمايز عن طريق زراعة السقالات في 2 مل EBM2 المتوسطة تستكمل مع 2٪ B27 دون الانسولين، activin-A (50 نانوغرام / مل)، و BMP-4 (25 نانوغرام / مل) لمدة 24 ساعة على 5٪ CO
- استبدال المتوسطة عن طريق مص بلطف من المتوسط القديم عبر فراغ دون لمس الخلايا. إضافة الوسيلة الجديدة EBM2 تستكمل مع B27 دون الانسولين، وعامل النمو البطاني الوعائي (VEGF، 50 نانوغرام / مل)، الإريثروبويتين (EPO، 100 نانوغرام / مل)، وتحويل β1 عامل النمو (TGFβ1، 10 نانوغرام / مل)، وثقافة السقالات في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- تحديث السقالات في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى متوسطة والثقافة؛ ثم، والإفراج عن الخلايا من سقالة بإضافة 200 U كولاجيناز الرابع (100 U / مل) إلى المتوسطة.
- تدور باستمرار الخلايا بعد إطلاق سراحهم. استبدال المتوسطة مع 2 مل EGM2-MV المتوسطة تستكمل مع 2٪ من B27، VEGF-A (50 نانوغرام / مل)، وSB-431542 (10 ميكرومتر). تحديث المتوسطة كل يومين.
- وبعد حوالي 10 أيام (أي في يوم 14 ~ بعد بدء التمايز)، فصل الخلايا مع 100 U / مل كولاجيناز الرابع، عزل حIPSC-ECS من السكان من الخلايا المتمايزة عن طريق التدفق الخلوي تحليل للتعبير عن البروتينات علامة EC-محددة (على سبيل المثال، CD31، CD144) 3.
- توسيع معزولة hiPSC-ECS عبر بروتوكول المعمول 3.
3. التفريق hiPSCs إلى hiPSC-SMCS
- البذور وhiPSCs على لوحات التي تم المغلفة مع خليط من البروتين هلامي، والثقافة الخلايا في mTeSR1 المتوسطة بنسبة 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية، مع تغييرات المتوسطة اليومية، حتى متموجة (~ 2 أيام).
- بدء التمايز إلى خلايا أرومية متوسطة-النسب عن طريق زراعة الخلايا مع CHIR99021 (5 ميكرومتر) وBMP-4 (10 نانوغرام / مل) في RPMI1640 متوسطة و 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين لمدة 3 أيام.
- لإنتاج hiPSC-SMCS مع النمط الظاهري في الغالب الاصطناعية:
- ثقافة الخلايا مع VEGF-A (25 نانوغرام / مل)، β عامل نمو الخلايا الليفية (FGFβ، 5 نانوغرام / مل) في RPMI1640 لي dium، و 2٪ B27 ناقص الأنسولين في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
- ثقافة الخلايا في VEGF-A (25 نانوغرام / مل)، FGFβ (5 نانوغرام / مل) في المتوسط RPMI1640، و 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين في 5٪ CO 2 و 37 ° مئوية لمدة 2 أيام.
- ثقافة الخلايا في β عامل النمو المشتق من الصفيحات (PDGFβ، 10 نانوغرام / مل)، TGFβ (3 نانوغرام / مل) في RPMI1640، و 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين في 5٪ CO 2 و 37 ° مئوية لمدة 4 أيام.
- لإنتاج hiPSC-SMCS مع النمط الظاهري في الغالب مقلص:
- ثقافة الخلايا لمدة 4 أيام مع VEGF-A (25 نانوغرام / مل)، وFGFβ (5 نانوغرام / مل) في RPMI1640 و 2٪ B27 ناقص الأنسولين.
- ثقافة الخلايا لمدة 7 أيام مع PDGFβ (5 نانوغرام / مل)، وTGFβ (2.5 نانوغرام / مل) في RPMI1640 و 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين.
- تنقية النهائي السكان hiPSC-SMC بواسطة زراعة الخلايا في اللاكتات (4 مم) التي تحتوي على RPMI1640 المتوسطة الأيض الخاصة ب ~ 6 أيام.
- نسخن زيت الزيتون إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي.
- الحرارة 5 مل من 10٪ من محلول الجيلاتين إلى 50 درجة مئوية.
- إضافة الجيلاتين إلى زيت الزيتون، وإثارة، ثم تبرد بسرعة إلى 5 درجات مئوية وذلك بإضافة الثلج إلى ماء الحمام.
- بعد خمسة وعشرين دقيقة، إضافة المبردة (4 درجة مئوية) الأسيتون لزيت الزيتون للحث على تشكيل microsphere.
- الحفاظ على درجة حرارة 5 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم، وجمع المجهرية، غسلها 5 مرات مع الأسيتون تبرد قبل لإزالة زيت الزيتون، والسماح لهم الهواء الجاف في 4 درجات مئوية.
- Resuspend والمجهرية في حل 70٪ من الإيثانول و 0.25٪ غلوتارالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للحث عبر ربط، ثم تحييد الخليط مع 100 ملي الجلايسين.
- تحميل IGF في المجهرية عن طريق خلط 5 ملغ المجهرية مع 15 ميكرولتر المقطر H 2 O تحتوي على 5 ميكروغرام IGF و 0.1٪ زلال المصل البقري لمدة 30 دقيقة.
5. إنشاء تصحيح على الموقع من الإصابات وحقن خلايا
- تعليق المستمدة hiPSC-مضادة (2000000)، SMCS (1000000)، وECS (1000000) معا في 1 مل الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM).
- تعليق 5 ملغ من المجهرية في 1 مل من محلول الفيبرينوجين (25 ملغ / مل).
- ملء حقنة واحدة مع الحل التي تحتوي على الخلية، حقنة أخرى مع الحل الفيبرينوجين / microsphere، وحقنة ثالثة مع 1 مل من محلول الثرومبين (80 وحدة المعاهد الوطنية للصحة / مل، تستكمل مع 2 ميكرولتر 400 ملم CaCl 2 و 200 ملي ε أمينوكابرويك حامض).
- جراحيا لحث احتشاء عضلة القلب في القلب الخنازير عن طريق ربط الأمامي الأيسر الشريان التاجي النازل كما هو موضح قبل 2.
ملاحظة: في وجيزة، والخنازير يوركشاير الإناث (~ 13 كجم، 45 يوما من العمر) ومخدرا مع الحقن العضلي من Telazol / زيلازين (4.4 ملغ / كلغ)، ومدخل أنبوب تحت التخدير العام مع isoflurane (0،5-5٪). وinterc 4 تشرينيتم تنفيذ بضع الصدر ostal وترك الأمامي تنازلي الشريان التاجي هو عرضة للخطر. والمغطي الشريان التاجي عن طريق رباط لمدة 60 دقيقة ثم يتم إزالة ربطة. يتم تنفيذ إزالة الرجفان الكهربائية الفورية في حالة الرجفان البطيني. - وضع حلقة بلاستيكية معقمة (~ 2.5 سم) على النخاب المنطقة محتشية من قلوب الخنازير، ومن ثم حقن في وقت واحد الحلول microsphere / الفيبرينوجين والثرومبين إلى الحلبة.
- السماح للخليط ليصلب (~ 30 ثانية)، ثم أدخل إبرة الحقنة التي تحتوي على الخلية من خلال خليط طدت في عضلة القلب محتشية وحقن الخلايا. إغلاق طبقات العضلات والأنسجة تحت الجلد، وجدار الصدر مع 3-0 أو 2-0 Monocryl خياطة اعتمادا على حجم الحيوان. البوبرينورفين 0،01-0،02 ملغ / كغ الحقن العضلي كل 8 ساعات سيتم استخدامها للسيطرة على الألم لمدة 3 أيام الأولى بعد الجراحة.
- تقييم وظيفة القلب باستخدام الرنين المغناطيسي القلبالتصوير (MRI) قبل إجراء العمليات الجراحية، أسبوع واحد وأربعة أسابيع بعد العملية الجراحية 2، 3، 4. بعد دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي النهائية، التضحية الحيوانية ومعالجة قلوبهم للعلم الأنسجة والتحليل الجزيئي 2، 3، 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توصيف متباينة hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs
القدرة التفاضلية للhiPSCs قيمت 2، 3، 4. تدفق تحليل الخلوي من التروبونين القلبي T التعبير (cTnT) تشير الى ان نقاوة السكان hiPSC-CM النهائي يمكن أن يتجاوز 90٪ (الشكل 1A، 1B، لوحة B1). ما يقرب أعرب عن الخلايا بطيئة الميوسين السلسلة الثقيلة (1B الشكل، لوحة A1)،-α الساركومير الأكتين (1B الشكل، لوحة A2)، في حين أعرب نحو 25٪ من الإسوي 2V سلسلة ضوء الميوسين (MLC2v) (1B الشكل، لوحة B2)، الذي عثر عليه فقط في البطين مضادة 4. وكانت كفاءة بروتوكول التمايز hiPSC-EC (أي نسبة CD31 + الخلايا) substantiaأعلى LLY عندما يؤديها مع hiPSCs من خط السيطرة (45.6٪، الشكل 1C، لوحة C2) من بخلايا PCBC16iPS (31.3٪، الشكل 1C، لوحة D2)؛ تحققت السكان من> 95٪ النقاء عبر اختيار التعبير CD31، واصل> 90٪ من الخلايا المحددة للتعبير عن CD31 أو CD144 لمدة تصل إلى 4 أسابيع عند المثقف في EGM2-MV المتوسطة (بدون FBS) تستكمل مع B27، VEGF، وSB431542 (1D الشكل) 3. وأعرب أكثر من 94٪ من المطهرون hiPSC-SMCS الأكتين العضلات الملساء (SMA)، ولكن كانت أكثر عرضة من مقلص hiPSC-SMCS للتعبير عن الكولاجين 1، connexin 43، أو فيمنتين (الشكل 1E) الاصطناعية hiPSC-SMCS. تم تقييم قدرة الهجرة وانتشار hiPSC-SMCS 4. كانت الاصطناعية hiPSC-SMCS أيضا أكثر المهاجرة والتكاثري من مقلص hiPSC-SMCS (الشكل 1F، والألواح الأول والثاني)، في حين تعاقدت SMCS مقلص بقوة أكبر ط ن الاستجابة للعلاج كرباكول (الشكل 1F، لوحات الثالث والرابع والخامس).
عامل النمو، بيان من الجيلاتين الجزئي
وأشارت القياسات ELISA من IGF-1 مستويات في المتوسط من بقع مثقف، خالية من الخلايا أن عامل النمو أطلق سراحه من المجهرية على مدى 3 أيام على الأقل (الشكل 2A) 2. أجريت التحاليل عن طريق تحميل 5 ملغ من المجهرية التي تحتوي على IGF مع 5 ميكروغرام IGF-1. ولدت والتصحيح عن طريق خلط المجهرية مع 1 مل من محلول الفيبرينوجين و 1 مل الثرومبين. كان التصحيح مثقف في MEM 2 مل. واحد مل من المتوسط، تم جمعها واستبدالها مع 1 مل من MEM جديدة كل يوم (الشكل 2B). قدمت البيانات كما يعني ± SEM.
ملاحظات من نموذج IR-إصابة
EP-together.within الصفحات = "1"> وقد تم التحقيق فعالية لدينا بوساطة التصحيح بروتوكول خلية زرع في نموذج الخنازير من إصابة نقص التروية ضخه 2. تم حقن ما مجموعه 6000000 hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs (2000000 من كل نوع من الخلايا) مباشرة في الأنسجة عضلة القلب المصابة. للحيوانات في المجموعة CELL + التصحيح، والتصحيح تتكون من الفيبرين وIGF-1 التي تحتوي على المجهرية تم إنشاؤها على موقع الإصابة قبل الحقن، بينما تم علاج الحيوانات في المجموعة CELL مع جرعة الخلايا نفسها ولكن دون التصحيح. تم حجب العلاج على حد سواء من الحيوانات في المجموعة MI. أربعة أسابيع بعد الإصابة والعلاج، تم الإبقاء على 9٪ من الخلايا تسليمها للحيوانات في المجموعة CELL + التصحيح واستمر في البقاء على قيد الحياة في موقع الإدارة، مقارنة مع 4٪ فقط من الخلايا التي تعطى للحيوانات في المجموعة CELL (الشكل 3A). العلاج مع كل من الخلايا والتصحيح، ولكن ليس مع الخلايا وحدها، كان associ أيضاATED مع تحسينات كبيرة في قياس وظيفة القلب وحجم احتشاء (الشكل 3B).
الشكل 1: تمايز hiPSCs إلى العضلية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء. تم تقييم التمايز Cardiomyocyte ونقاء hiPSC-مضادة عن طريق التدفق الخلوي (A) والأنسجة مع علامات القلب المختلفة (B). تم تحديد التمايز البطانية من hiPSC مع التدفق الخلوي (C). تم تقييم الحفاظ على النمط الظاهري البطانية من hiPSC-ECS عن طريق تحليل التعبير عن CD31 وCD144 في 2 و 3 و 4 أسابيع بعد تنقية بواسطة التدفق الخلوي (D). تم قياس سلس تمايز الخلايا العضلية hiPSC من قبل مختلف علامات (E). والهجرة وانتشار إمكاناتالاصطناعية خلايا العضلات الملساء مقابل خلايا العضلات الملساء مقلص المستمدة من hiPSCs تم تقييم (F). تم counterstained نوى مع دابي في تلطيخ المناعي. شريط مقياس = 100 ميكرون في الفقرة (ب) و 200 ميكرون (E و F). تم تقييم قدرة الهجرة وانتشار الاصطناعية hiPSC-SMCS (F، لوحة الأول والثاني). وتقلص SMCS مقلص في الاستجابة للعلاج كرباكول تم تقييم (F، لوحة من الثالث الى الخامس). * ف <0.05، الاصطناعية hiPSC-SMCS مقابل مقلص hiPSC-SMCS. ألف وباء تم تعديلها من يي L، وآخرون. 2. تم تعديل C و D من تشانغ S، وآخرون. 3. تم تعديل E و F من يانغ L، وآخرون. 4. وقدمت البيانات كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). تم تقييم المقارنة بين مجموعتين عن طريق اختبار T للتلاميذ، وجرى تقييم المقارنة بين مجموعات متعددة عن طريق باتجاه واحد ANOVA. ف <اعتبر 0.05 signifiغير قادر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإفراج عن عوامل النمو من المجهرية. تم توليفها IGF-تحتوي على المجهرية (A). وقد تم قياس IGF-1 الإفراج عن المجهرية في 1 و 3 و 5 و 7 أيام بعد أن تم توليفها (B). شريط مقياس = 200 ميكرون. لوحة وتم تعديل من يي لام، وآخرون. 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تقييم كفاءة العلاج بالخلايا مع سل trilineage المستمدة hiPSC-ليرة سورية. تم تقييم معدل engraftment العام للسكان ثلاثة الخلية بعد 4 أسابيع زرع الخلايا (A). تم تقييم وظيفة القلب (كما هو مبين من قبل جزء طرد) وحجم احتشاء عبر التصوير بالرنين المغناطيسي القلب في 1 و 4 أسابيع بعد زرع الخلايا (B). * ف <0.05 مقابل MI. #P <0.05 مقابل التصحيح. ألف وباء تم تعديلها من يي لام، وآخرون. 2. قدمت البيانات كما يعني ± SEM. وقد تم تحليل المقارنات بين المجموعات لأهمية مع اتجاه واحد أنوفا. واعتبرت ف <0.05 كبيرة. وقد أعادوا تحليل النتائج التي تم تحديدها كبيرة كما عبر أنوفا مع تصحيح توكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحسين الإنتاجية / الطهارة من hiPSC-مضادة
البروتوكولات التقليدية للتمييز الخلايا الجذعية البشرية في مضادة غالبا ما تكون محدودة بانخفاض المحصول والنقاء. على سبيل المثال، فقط 35-66٪ من HESC-مضادة الحصول عليها عن طريق فصل Percoll وتشكيل هيئة القلب أعرب بطيئة الميوسين السلسلة الثقيلة أو cTnT 6. نقاء متباينة السكان hiPSC-CM يمكن زيادتها بشكل كبير عن طريق اختيار للتعبير عن الجينات مراسل التي تم ربطها إلى المروج لCM محددة بروتين 7، 8، 9، ولكن هذا الأسلوب يتطلب بالضرورة استخدام المعدلة وراثيا الخلايا، والتي هي اقل من المرغوب فيه، ولا سيما بالنسبة للالتحقيقات السريرية. مع بروتوكول المعروضة هنا، وأعرب 68٪ من hiPSC-مضادة cTnT، ونقاء في وقت لاحق ارتفع إلى> 90٪ عن طريق تشريح الصغيرة وpreplating دون التلاعب الجيني أو واحدةاختيار -cell. وكان العائد الكلي ~ 3-5٬000٬000 hiPSC-مضادة لكل بئر.
تحسين الإنتاجية / استقرار hiPSC-ECS
وتستند اثنين الأكثر شيوعا بروتوكولات التمايز hiPSC-EC بشأن شارك في زراعة خلايا الفئران مع انسجة 10 و 11 و تشكيل الجنينية الجسم 12 و 13. ومع ذلك، يمكن للطريقة شارك في زراعة يؤدي إلى تلوث xenogenic مع خلايا الفئران-النسب أو البروتينات 10، وفقط ~ 15٪ أو أقل من الخلايا المنتجة عبر طريقة الجنينية الجسم تحمل النمط الظاهري EC 10 و 12 و 13. بروتوكول التمايز hiPSC-EC المقدمة هنا يلغي خطر التلوث xenogenic ويمكن أن يصل إلى 3 أضعاف أكثر فعالية من الأساليب التي تستخدم الهيئات الجنينية (اعتمادا على والذي يستخدم خط hiPSC). Furthermخام، بعد تنقيتها عن طريق اختيار التعبير CD31، ~ حافظت 90٪ من hiPSC-ECS النمط الظاهري EC لمدة 4 أسابيع على الأقل في المختبر، مقارنة أسبوعين فقط عندما يتم إنتاج hiPSC-ECS عبر بروتوكولات التمايز التقليدية 12.
المظهرية مواصفات hiPSC-SMCS
ولعل أفضل وصف النمط الظاهري من SMC (أو عدد سكانها SMCS) محاولة لخلق توازن بين الخصائص الغالب مقلص والاصطناعية، والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات كبيرة في التشكل والتعبير علامة، والنشاط. وهكذا، فإن فائدة hiPSC-SMCS لتطبيق معين قد تعتمد على النمط الظاهري الذي محددة يتم إنشاؤها. تمايز وتنقية البروتوكولات hiPSC-SMC المقدمة هنا هي أول من أنتج في الغالب مقلص أو الاصطناعية السكان SMC التي هي ~ 95٪ نقية في أسابيع فقط 2-3، وخطر التلوث xenogenic هو الحد الأدنى، لأن الإجراءات لا REQUغضب استخدام الخلايا المغذية.
تحسين Engraftment أسعار الخلايا المزروعة
ويعتقد أن إحدى العقبات الأساسية في العلاج بالخلايا فعالة ليكون العدد المنخفض للغاية من خلايا تدار التي المغروسة بواسطة عضلة القلب 14، 15، 16، 17. السيتوكينات مثل IGF-1 قد تحسن engraftment من خلال تمكين الخلايا على الصمود بشكل أفضل المكروية السامة في الأنسجة الدماغية 18، 19، 20، ولكن الضغوط العالية التي يسببها خلال انكماش قد ضغط على خلايا من خلال المسار الإبرة وفي الدورة الدموية الطرفية. وبالتالي، فإن معدل أعلى بكثير من engraftment يتحقق عن طريق حقن الخلايا من خلال التصحيح الفيبرين التي تحتوي على IGF-1، الذي كان أكثر من 2 أضعاف أكبر من المعدل الملاحظ عند سامكانت تدار جرعة خلية ه دون التصحيح، يمكن على الأرجح أن ينسب إلى كل من آثار سيتوبروتيكتيفي من IGF-1 والتصحيح نفسها، التي شكلت حاجز مادي التي منعت الخلايا من طرده في الفضاء النخابية.
خطوات حاسمة
لضمان تعدد القدرات للخلايا الوركين، فمن الضروري للتحقق من النمط النووي من خط hiPSC قبل التمايز، وتحديد التعبير عن علامات تعدد القدرات (NANOG، SSEA1، وOct4، وآخرون)، وتأكيد قدرتها على تشكيل مسخي . ويقترح لإعادة التحقق من تعدد القدرات الخاصة بهم عندما تم passaged خطوط hiPSC لأكثر من 10 أجيال. وضع hiPSC غير متمايزة هو أيضا أمر حاسم لتمييز الصحيح. لضمان وضع hiPSC قبل الشروع في التمايز، فمن المستحسن أن: 1) استخدام متوسطة جديدة (أقل من أسبوعين)، وتحديث المتوسطة يوميا قبل بدء hiPSC differentiatأيون. 2) تقليل الوقت الأنزيمية الهضم (أقل من 5 دقائق)، وبلطف ماصة صعودا وهبوطا الخلايا لمنع وقوع الضرر لا لزوم لها الخلايا. 3) replate الخلايا في مناطق ذات كثافة 1 × 10 5 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا. 4) دائما على خلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة، وتجنب الاحتفاظ الخلايا خارج الحاضنة لمدة أطول من 15 دقيقة.
القيود المفروضة على تقنية
العيب الرئيسي لدينا وسيلة للجمع بين حقن خلايا القلب المستمدة hiPSC وإدارة التصحيح هو شرط لجراحة الصدر المفتوحة؛ وبالتالي، من غير المرجح أن يكون للترجمة مباشرة إلى التطبيقات السريرية إلا كعلاج مساعد للمرضى الذين يخضعون لجراحة إعادة التوعي المتزامنة التاجية هذا النهج. والاستخدام السريري أكثر انتشارا يتطلب تطوير وسيلة لتوصيل العملي والغازية الحد الأدنى، مثل نهج endoscope- والقسطرة القائم التي يمكن الوصولالقلب عن طريق البطن والحجاب الحاجز. وعلاوة على ذلك، واحدة من مخاوف تتعلق بالسلامة أهم المرتبطة العلاج بالخلايا القلب هو تطور المضاعفات محدث اضطراب النظم، وعندما تم علاج القرود مع الحقن داخل عضلة القلب من 1000000000 مضادة المستمدة HESC، كل أربعة من الحيوانات، عدم انتظام ضربات القلب عفوية 21. ومع ذلك، لاحظنا أي دليل على حدوث مضاعفات محدث اضطراب النظم عندما تم حقن 10 ملايين مضادة المستمدة hiPSC في قلوب الخنازير مع اصابة الأشعة تحت الحمراء 2، ربما لأن جرعة خلية كانت 100 أضعاف أصغر.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات
الرفض المناعي من المرجح ان يلعب دورا هاما بالنسبة لمعدل engraftment منخفضة. و/ كاس تحرير النظام الجيني كريسبر قد تمكن الباحثون لإنشاء خط من hiPSCs "المانحة عالمي" من قبل ضرب (KO) الرئيسي مجمع التوافق النسيجي (MHC) من الدرجة الأولى والدرجة الثانية. الخلايا والأنسجة قد ح المستمدة KO-hiPSC MHCافي معدلات أعلى بكثير من engraftment. مع تحسن تقنيات، ومن المرجح أن تزداد معدلات engraftment. في مرحلة معينة من زيادة حجم الكسب غير المشروع، ومن المتوقع أن تزيد من arrhythmogenicity من قلب المتلقي الكسب غير المشروع كبير. الحد من الطعوم المرتبطة arrhythmogenicity يمكن تحقيقه باستخدام الخلايا مع زيادة الفجوة البروتينات تقاطع التعبير من خلال التكنولوجيا التحرير الجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
