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Developmental Biology

स्टेम सेल Myocardial मरम्मत के लिए हृदय कोशिकाओं व्युत्पन्न

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/55142
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham

Summary

हम cardiomyocytes, endothelial कोशिकाओं, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और एक वितरण पद्धति है कि पैच की मध्यस्थता साइटोकाइन वितरण के साथ सेल इंजेक्शन के संयोजन से प्रतिरोपित कोशिकाओं के engraftment में सुधार में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल फर्क के लिए तीन उपन्यास और अधिक कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) पूरी तरह से cardiomyocytes (hiPSC-सीएमएस), endothelial कोशिकाओं (hiPSC ईसीएस), और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) में hiPSCs फर्क के लिए प्रशासन से पहले विशेष प्रकार की कोशिकाओं, लेकिन पारंपरिक प्रोटोकॉल में भेदभाव किया जाना चाहिए बार कर रहे हैं कम उपज, पवित्रता, और / या गरीब प्ररूपी स्थिरता द्वारा सीमित। यहाँ, हम hiPSC मुख्यमंत्रियों, -ECs पैदा करने के लिए उपन्यास प्रोटोकॉल, और -SMCs काफी है कि पारंपरिक तरीकों की तुलना में अधिक कुशल हैं, साथ ही एक साइटोकाइन युक्त प्रशासन की साइट पर बनाया पैच के साथ सेल इंजेक्शन के संयोजन के लिए एक तरीका मौजूद है। पैच मायोकार्डियम से बाहर निचोड़ा जा रहा से कोशिकाओं को रोकने के लिए सुई ट्रैक, और सेल अस्तित्व सील, एक विस्तारित अवधि में इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक (आईजीएफ) जारी करके, दोनों इंजेक्शन कोशिकाओं की अवधारण को बेहतर बनाता है। myocardial ischemia-reperfusion चोट का एक स्वाइन मॉडल में, engraftment की दर अधिक से अधिक दो गुना अधिक था जबकोशिकाओं साइटोकाइन युक्त पैच पैच बिना कोशिकाओं की तुलना में, और दोनों कोशिकाओं और पैच के साथ उपचार के साथ दिलाई गई, लेकिन अकेले कोशिकाओं के साथ नहीं, हृदय समारोह और रोधगलितांश आकार में महत्वपूर्ण सुधार के साथ जुड़े थे।

Introduction

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) पुनर्योजी सेल थेरेपी के लिए सबसे होनहार एजेंटों में से एक हैं, क्योंकि वे एक संभावित असीमित रेंज और कोशिकाओं की मात्रा है कि मरीज की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अस्वीकार नहीं कर रहे हैं में भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि, आत्म प्रतिकृति और भेदभाव के लिए उनकी क्षमता भी ट्यूमर गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप, hiPSCs पूरी तरह से इस तरह के cardiomyocytes (सीएमएस), endothelial कोशिकाओं (ईसीएस), और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा करने की जरूरत है (एसएमसी ), प्रशासन से पहले। सेल प्रशासन का सबसे सरल और सबसे आम तरीकों में से एक प्रत्यक्ष intramyocardial इंजेक्शन है, लेकिन है कि देशी दौरे ऊतक द्वारा engrafted रहे हैं प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या में असाधारण कम है। इस उदासीनता के ज्यादातर इस्कीमिक ऊतक के साइटोटोक्सिक पर्यावरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है; हालांकि, रिहाई दिल, की मायोकार्डियम में सीधे इंजेक्शन जब murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) थे ओnly ~ छुड़ाया 3-5 घंटा 1, जो पता चलता है कि प्रशासित कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात प्रशासन साइट से बाहर निकल गया, शायद इसलिए कि वे उच्च दौरान उत्पादन के दबाव से सुई ट्रैक के माध्यम से बाहर निचोड़ा थे बनाए रखा गया 5 लाख कोशिकाओं का 40% दौरे संकुचन।

यहाँ, हम hiPSC व्युत्पन्न cardiomyocytes (hiPSC मुख्यमंत्रियों) 2, endothelial कोशिकाओं (hiPSC-ईसीएस) 3, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) 4 पैदा करने के लिए उपन्यास और काफी अधिक कुशल तरीके प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, इस hiPSC-एसएमसी प्रोटोकॉल पहले एक मुख्य रूप से सिंथेटिक या सिकुड़ा एसएमसी phenotype की ओर कोशिकाओं निर्देशन द्वारा दैहिक एसएमसी 5 में मनाया रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं की विस्तृत श्रृंखला की नकल करने के लिए है। हम यह भी सेल वितरण का एक तरीका है कि एक साइटोकाइन युक्त आतंच पी बनाने के द्वारा इंजेक्शन कोशिकाओं के engraftment की दर में सुधार प्रदान करते हैंइंजेक्शन स्थल पर ATCH। पैच दोनों सेल बनाए रखने में सुधार करने के लिए, मायोकार्डियम बाहर निकलने से कोशिकाओं को रोकने के लिए सुई ट्रैक, और सेल अस्तित्व सील, कम से कम तीन दिन की अवधि में इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक (आईजीएफ) जारी करके द्वारा प्रकट होता है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं बर्मिंघम में अलबामा विश्वविद्यालय के पशु दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है।

1. hiPSC मुख्यमंत्रियों में hiPSCs फर्क

  1. कोट रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा विकास कारक कम पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं। उपयोग करने से पहले पतला प्रोटीन मिश्रण aspirate। 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस mTeSR1 में 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला के साथ मध्यम पूरक पर पूर्व में लिपटे प्लेटों पर hiPSCs बीज, और संस्कृति कोशिकाओं (अच्छी तरह से प्रति 1 x 10 5 सेल)।
  2. मध्यम को रिफ्रेश दैनिक जब तक कोशिकाओं 90% संगम तक पहुँचने; तो, विकास कारक कम पतला प्रोटीन मिश्रण मध्यम (0.5 मिलीग्राम पतला प्रोटीन प्रति 6 अच्छी तरह से थाली मिश्रण है, अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर मध्यम), और संस्कृति के लिए 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए दो दिन कोशिकाओं जोड़ें।
    1. मध्यम बदलने के लिए, धीरे साथ वैक्यूम के माध्यम से पेट्री डिश से मध्यम बाहर चूसनाबाहर की कोशिकाओं को छूने, और एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग नए माध्यम जोड़ें।
  3. RPMI1640 मध्यम के साथ पूरक के साथ मध्यम जगह से भेदभाव आरंभ विकास कारक कम पतला प्रोटीन मिश्रण, B27 इंसुलिन के बिना, और 100 एनजी / एमएल Activin एक; संस्कृति 5% सीओ 2 और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
  4. ; RPMI1640 माध्यम है कि B27 के साथ इंसुलिन के बिना पूरक किया गया है, 10 एनजी / एमएल हड्डी morphogenic प्रोटीन 4 (बीएमपी 4), और 10 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) के साथ मध्यम बदलें संस्कृति 5% सीओ 2 और 96 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
  5. B27 के साथ पूरक RPMI1640 माध्यम के साथ मध्यम बदलें और 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं जारी; मध्यम ताज़ा हर 3 दिनों के लिए।
  6. भेदभाव की शुरुआत के बाद 3 दिन खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं करार ~ के समूहों का निरीक्षण करें। ~ 7 दिन पहले संकुचन के अवलोकन के बाद समूहों लीजिए और उन्हें हैंक्स बैलेंस्ड नमक के घोल में धो।
    1. उन्हें 100 यू / एमएल collagenase 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ चतुर्थ युक्त हैंक्स बफर में incubating द्वारा थाली में क्लस्टर कोशिकाओं को अलग कर देना; फिर, 5 मिनट के लिए ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) में 0.25% trypsin जोड़ें।
    2. RPMI / B27 माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ एंजाइम समाधान बेअसर और फिर RPMI / B27 माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
    3. hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की संख्या की गणना। संस्कृति 5% सीओ 2 और कम से कम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेमी बर्तन पर कोशिकाओं है, जो गैर cardiomyocyte कोशिकाओं संस्कृति पकवान की सतह का पालन करने की अनुमति देगा।
  7. सेल निलंबन, जो hiPSC मुख्यमंत्रियों शामिल लीजिए, और कोशिकाओं (10 सेमी पकवान प्रति लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं) एक पतला प्रोटीन मिश्रण लेपित सतह पर उन्हें संवर्धन द्वारा बनाए रखें।

2. hiPSC ईसीएस में hiPSCs फर्क

  1. वें incubating द्वारा एकल कक्षों में hiPSC आबादी को अलग कर देना5% सीओ 2 और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एजेंट chelating के साथ उन्हें। एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ताजा mTeSR1 मध्यम युक्त ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  2. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक mTeSR1 माध्यम से कोशिकाओं Resuspend। एक hemocytometer साथ सेल घनत्व का निर्धारण करते हैं।
  3. एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए 20 एनआईएच इकाइयों / मिलीलीटर थ्रोम्बिन समाधान के 250 μl जोड़ें।
  4. 12.5 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के 250 μl के लिए 1 एक्स 10 6 hiPSCs जोड़ें। और थ्रोम्बिन से भरी हुई अच्छी तरह से करने के लिए सेल युक्त फाइब्रिनोजेन समाधान के 250 μl जोड़ें। निरीक्षण मिश्रण मिनट के भीतर एक hiPSC युक्त आतंच पाड़ फार्म जमना।
  5. कांच कवर संदंश के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में जम, सेल युक्त scaffolds स्थानांतरण, और इंसुलिन के बिना 2% B27 के साथ पूरक 2 मिलीलीटर EBM2 माध्यम में scaffolds संवर्धन द्वारा भेदभाव आरंभ, activin-ए (50 एनजी / एमएल), और बीएमपी -4 (25 एनजी / 5% सीओ पर एमएल) के 24 घंटे के लिए
  6. धीरे कोशिकाओं को छूने के बिना वैक्यूम के माध्यम से पुराने मध्यम बाहर चूसने से मध्यम बदलें। नई EBM2 मध्यम इंसुलिन के बिना B27 के साथ पूरक, संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF, 50 एनजी / एमएल), erythropoietin (ईपीओ, 100 एनजी / एमएल), और बदलने वृद्धि कारक β1 (TGFβ1, 10 एनजी / एमएल), और संस्कृति को जोड़े 5% पर scaffolds सीओ 2 और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
  7. मध्यम और संस्कृति 5% सीओ 2 और एक अन्य 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मचानों को रिफ्रेश करें; फिर, मध्यम करने के लिए 200 यू collagenase चतुर्थ (100 यू / एमएल) जोड़कर पाड़ कोशिकाओं से जारी है।
  8. कोशिकाओं नीचे स्पिन के बाद वे जारी कर रहे हैं। 2 मिलीलीटर EGM2-एमवी B27, वीईजीएफ़-ए (50 एनजी / एमएल), और एस.बी.-431542 (10 माइक्रोन) के के 2% के साथ पूरक माध्यम के साथ मध्यम बदलें; मध्यम ताज़ा हर दो दिन।
  9. लगभग 10 दिन बाद (यानी, पर ~ 14 दिन के बाद भेदभाव शुरू किया गया था), कोशिकाओं 100 यू के साथ / एमएल collagenase चतुर्थ अलग कर देना, अलग-थलग जप्रवाह cytometry के माध्यम से विभेदित कोशिकाओं की आबादी से IPSC ईसीएस चुनाव आयोग विशिष्ट मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण करती है (जैसे, CD31, CD144) 3।
  10. एक स्थापित प्रोटोकॉल 3 के माध्यम से अलग-थलग hiPSC ईसीएस का विस्तार करें।

3. hiPSC-एसएमसी में hiPSCs फर्क

  1. , 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें कि पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ लेपित किया गया है पर hiPSCs बीज, और संस्कृति mTeSR1 माध्यम से कोशिकाओं, दैनिक मध्यम परिवर्तन के साथ मिला हुआ है जब तक (~ 2 दिन)।
  2. 3 दिन के लिए RPMI1640 मध्यम और 2% B27 प्लस इंसुलिन में CHIR99021 (5 माइक्रोन) के और बीएमपी -4 (10 एनजी / एमएल) के साथ कोशिकाओं संवर्धन द्वारा mesodermal-वंश कोशिकाओं में भेदभाव आरंभ करें।
  3. एक मुख्य रूप से सिंथेटिक phenotype के साथ hiPSC-एसएमसी का उत्पादन करने के लिए:
    1. संस्कृति वीईजीएफ़-ए (25 एनजी / एमएल), RPMI1640 मुझ में fibroblast वृद्धि कारक β (FGFβ, 5 एनजी / एमएल) के साथ कोशिकाओं dium, और 2% B27 शून्य से इंसुलिन 5% सीओ 2 और 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
    2. संस्कृति वीईजीएफ़-ए में कोशिकाओं (25 एनजी / एमएल), FGFβ (5 एनजी / एमएल) RPMI1640 माध्यम में, और 2% B27 प्लस इंसुलिन 5% सीओ 2 और 37 पर 2 दिनों के लिए सें।
    3. संस्कृति प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक β (PDGFβ, 10 एनजी / एमएल), TGFβ (3 एनजी / एमएल) RPMI1640 में, और 2% B27 प्लस इंसुलिन 5% सीओ 2 और 37 में कोशिकाओं 4 दिनों के लिए सें।
  4. एक मुख्य रूप से सिकुड़ा phenotype के साथ hiPSC-एसएमसी का उत्पादन करने के लिए:
    1. संस्कृति RPMI1640 में वीईजीएफ़-ए के साथ 4 दिनों (25 एनजी / एमएल) और FGFβ (5 एनजी / एमएल) और 2% B27 शून्य से इंसुलिन के लिए कोशिकाओं।
    2. संस्कृति RPMI1640 और 2% B27 प्लस इंसुलिन में PDGFβ (5 एनजी / एमएल) और TGFβ (2.5 एनजी / एमएल) के साथ 7 दिनों के लिए कोशिकाओं।
  5. लैक्टेट (4 मिमी) ~ 6 दिनों के लिए RPMI1640 चयापचय युक्त मध्यम में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा अंतिम hiPSC-एसएमसी आबादी शुद्ध।
jove_title "> 4। IGF-युक्त microspheres बनाना

  1. हीट जैतून का तेल एक पानी के स्नान में 45 डिग्री सेल्सियस के लिए।
  2. गर्मी 50 डिग्री सेल्सियस के लिए 10% जिलेटिन समाधान के 5 मिलीलीटर।
  3. जैतून का तेल, हलचल करने के लिए जिलेटिन जोड़ें, और फिर तेजी से पानी से स्नान करने के लिए बर्फ जोड़कर 5 डिग्री सेल्सियस तक शांत।
  4. पच्चीस मिनट बाद, microsphere गठन को प्रेरित करने के लिए जैतून का तेल को ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन जोड़ें।
  5. 5 में तापमान बनाए रखने 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस; फिर, microspheres इकट्ठा उन्हें पूर्व ठंडा एसीटोन के साथ 5 बार धोने जैतून का तेल निकालने के लिए, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर हवा शुष्क करने की अनुमति।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 70% इथेनॉल और 0.25% glutaraldehyde का एक समाधान में microspheres Resuspend पार से जोड़ने के लिए प्रेरित करने के लिए, और फिर 100 मिमी ग्लाइसिन के साथ मिश्रण बेअसर।
  7. आसुत घंटे 30 मिनट के लिए 5 माइक्रोग्राम IGF और 0.1% गोजातीय सीरम albumin युक्त 2 हे 15 μl के साथ 5 मिलीग्राम microspheres के मिश्रण से microspheres में लोड IGF।

5. चोट की साइट से अधिक पैच बनाना और कोशिकाओं को इंजेक्शन

  1. hiPSC व्युत्पन्न सीएमएस (2 लाख), एसएमसी (1 करोड़), और ईसी (1 मिलियन) एक साथ निलंबित 1 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) में।
  2. 1 मिलीलीटर फाइब्रिनोजेन समाधान (25 मिलीग्राम / एमएल) में microspheres की 5 मिलीग्राम निलंबित।
  3. सेल युक्त समाधान, फाइब्रिनोजेन / microsphere समाधान के साथ एक और सिरिंज, और थ्रोम्बिन समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक तिहाई सिरिंज के साथ एक सिरिंज भरें (80 एनआईएच इकाइयों / एमएल, 2 μl 400 मिमी 2 CaCl और 200 मिमी ε-aminocaproic के साथ पूरक एसिड)।
  4. शल्य चिकित्सा के लिए छोड़ दिया पूर्वकाल कोरोनरी धमनी उतरते के रूप में 2 से पहले वर्णित के बंधाव के माध्यम से स्वाइन दिल में रोधगलन प्रेरित।
    नोट: संक्षिप्त, महिला यॉर्कशायर स्वाइन में (~ 13 किलो, उम्र के 45 दिन) Telazol / xylazine (4.4 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ बेहोश कर रहे हैं, और isoflurane (0.5-5%) के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत intubated। एक 4 वें intercostal thoracotomy प्रदर्शन किया और पूर्वकाल छोड़ दिया कोरोनरी धमनी उतरते संपर्क में है। कोरोनरी धमनी 60 मिनट के लिए एक संयुक्ताक्षर द्वारा occluded है और फिर संयुक्ताक्षर निकाल दिया जाता है। तत्काल विद्युत defibrillation ventricular fibrillation के मामले में किया जाता है।
  5. स्वाइन दिल की infarcted क्षेत्र के epicardium पर एक बाँझ प्लास्टिक की अंगूठी (~ 2.5 सेमी) की स्थिति, और फिर एक साथ रिंग में microsphere / फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन समाधान इंजेक्षन।
  6. मिश्रण (30 सेकंड ~) जमना करने की अनुमति दें, और उसके बाद infarcted मायोकार्डियम में जम मिश्रण के माध्यम से सेल युक्त सिरिंज की सुई डालने और कोशिकाओं इंजेक्षन। 3-0 या 2-0 Monocryl सिवनी पशु आकार पर निर्भर करता है के साथ मांसपेशियों की परतों, चमड़े के नीचे ऊतक, और छाती की दीवार को बंद करें। Buprenorphine 0.01-0.02 मिलीग्राम / किग्रा इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन हर 8 घंटे की सर्जरी के बाद पहले 3 दिनों के लिए दर्द को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  7. हृदय समारोह का मूल्यांकन एक हृदय चुंबकीय अनुनाद का उपयोग करइमेजिंग (एमआरआई) शल्य प्रक्रिया, एक सप्ताह और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया 2, 3, 4 के बाद चार सप्ताह के पहले। अंतिम एमआरआई अध्ययन करने के बाद, पशु बलि और ऊतक विज्ञान और आणविक विश्लेषण 2, 3, 4 के लिए उनके दिल की प्रक्रिया।

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Representative Results

विभेदित hiPSC मुख्यमंत्रियों, -ECs, और -SMCs की विशेषता

HiPSCs के अंतर क्षमता, 4 2 से 3 का मूल्यांकन किया गया। फ्लो का हृदय ट्रोपोनिन टी (cTnT) अभिव्यक्ति का विश्लेषण बताते हैं कि अंतिम hiPSC-मुख्यमंत्री आबादी की शुद्धता 90% (चित्रा 1 ए, 1 बी, पैनल बी 1) पार कर सकते हैं। लगभग सभी कक्षों की धीमी गति से मायोसिन भारी श्रृंखला (चित्रा 1 बी, पैनल A1) व्यक्त की, α-sarcomeric actin (चित्रा 1 बी, पैनल A2) है, जबकि लगभग 25% मायोसिन प्रकाश श्रृंखला के 2V isoform (MLC2v) व्यक्त (चित्रा 1 बी, पैनल बी 2) है, जो केवल वेंट्रिकुलर मुख्यमंत्रियों 4 में मिला था। HiPSC-चुनाव आयोग भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता (यानी, CD31 का प्रतिशत + कोशिकाओं) द्रव्य थाlly अधिक है जब पकड़ती लाइन से hiPSCs (45.6%, चित्रा 1C, पैनल C2) की तुलना में PCBC16iPS कोशिकाओं के साथ (31.3%, चित्रा 1C, पैनल डी 2) के साथ प्रदर्शन किया; > 95% पवित्रता की आबादी CD31 अभिव्यक्ति के लिए चयन के माध्यम से प्राप्त किया गया, और चयनित कोशिकाओं के> 90% CD31 या CD144 के लिए 4 सप्ताह के लिए व्यक्त करने के लिए जारी रखा जब सुसंस्कृत EGM2-एमवी मध्यम (FBS के बिना) B27 के साथ पूरक में, वीईजीएफ़, और SB431542 (चित्रा -1) 3। शुद्ध hiPSC-एसएमसी की अधिक से अधिक 94% चिकनी पेशी actin (SMA) व्यक्त की, लेकिन सिंथेटिक hiPSC-एसएमसी कोलेजन 1, connexin 43, या vimentin (चित्रा 1E) को व्यक्त करने के सिकुड़ा hiPSC-एसएमसी की तुलना में अधिक होने की संभावना थे। HiPSC-एसएमसी के प्रवास और प्रसार क्षमता 4 का मूल्यांकन किया गया। सिंथेटिक hiPSC-एसएमसी भी अधिक प्रवासी और सिकुड़ा hiPSC-एसएमसी से proliferative थे (चित्रा 1F, पैनलों मैं और द्वितीय), सिकुड़ा एसएमसी अधिक दृढ़ता से अनुबंधित जबकि मैंn carbachol उपचार के लिए प्रतिक्रिया (चित्रा 1F, पैनलों तृतीय, चतुर्थ और वी)।

जिलेटिन microspheres से विकास कारक रिलीज

सुसंस्कृत, सेल मुक्त पैच से मध्यम में IGF-1 के स्तर की एलिसा मापन संकेत दिया कि वृद्धि कारक कम से कम 3 दिन (2A चित्रा) 2 की अवधि में microspheres से जारी किया गया था। विश्लेषण 5 माइक्रोग्राम IGF-1 के साथ IGF-युक्त microspheres की 5 मिलीग्राम लोड करके प्रदर्शन किया गया। एक पैच 1 मिलीलीटर फाइब्रिनोजेन समाधान और 1 मिलीलीटर थ्रोम्बिन के साथ microspheres के मिश्रण से तैयार की गई थी। पैच 2 मिलीलीटर सदस्य में संवर्धित किया गया था। मध्यम से एक मिलीलीटर एकत्र की है और ताजा सदस्य के 1 मिलीलीटर प्रत्येक दिन (चित्रा 2 बी) के साथ बदल दिया गया था। डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया।

एक आईआर चोट मॉडल से प्रेक्षणों

2 के एक स्वाइन मॉडल में जांच की गई है। 6 लाख hiPSC मुख्यमंत्रियों, -ECs, और -SMCs (प्रत्येक कोशिका प्रकार के 2 लाख) के कुल घायल दौरे ऊतक में सीधे इंजेक्ट किया गया। सेल + पैच समूह में जानवरों के लिए, एक पैच आतंच और से बना IGF-1-युक्त microspheres इंजेक्शन से पहले चोट की साइट पर बनाया गया था, जबकि सेल समूह में जानवरों को एक ही सेल खुराक के साथ, लेकिन पैच बिना इलाज किया गया; दोनों उपचार एमआई समूह में जानवरों से रोक रहे थे। चार सप्ताह की चोट और इलाज के बाद, सेल + पैच समूह में पशुओं के लिए दिया कोशिकाओं का 9% बनाए रखा और प्रशासन के स्थल पर जीवित रहने के लिए जारी रखा गया, कोशिकाओं सेल समूह में जानवरों को दिलाई का सिर्फ 4% की तुलना में (चित्रा 3 ए)। दोनों कोशिकाओं और पैच, लेकिन अकेले कोशिकाओं के साथ नहीं के साथ उपचार किया गया था, यह भी Associहृदय समारोह और रोधगलितांश आकार (चित्रा 3 बी) के मापन में महत्वपूर्ण सुधार के साथ पैदा।

आकृति 1
चित्रा 1: cardiomyocytes, endothelial कोशिकाओं, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में hiPSCs के भेदभाव। Cardiomyocyte भेदभाव और hiPSC मुख्यमंत्रियों की पवित्रता से फ्लो (ए) और विभिन्न हृदय मार्कर (बी) के साथ ऊतक विज्ञान के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। HiPSC के endothelial भेदभाव से फ्लो (सी) के साथ निर्धारित किया गया था। HiPSC ईसीएस के endothelial phenotype के रखरखाव से फ्लो (डी) द्वारा शुद्धि के बाद 2, 3, और 4 सप्ताह में CD31 और CD144 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था। HiPSC की चिकनी पेशी सेल भेदभाव विभिन्न मार्कर (ई) द्वारा मापा गया था। और के प्रवास और प्रसार संभावितबनाम सिकुड़ा चिकनी मांसपेशियों hiPSCs से ली गई कोशिकाओं सिंथेटिक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एफ) मूल्यांकन किया गया था। नाभिक immunofluorescence धुंधला में DAPI साथ counterstained थे। (बी) और 200 माइक्रोन (ई और एफ) में स्केल बार = 100 माइक्रोन। सिंथेटिक hiPSC-एसएमसी के प्रवास और प्रसार की क्षमता का मूल्यांकन किया गया (एफ, पैनल मैं और द्वितीय)। और carbachol उपचार के जवाब में सिकुड़ा एसएमसी के संकुचन (एफ, पैनल III-V) मूल्यांकन किया गया था। * पी <0.05, सिंथेटिक hiPSC-एसएमसी बनाम सिकुड़ा hiPSC-एसएमसी। ए और बी एल सुनो, एट अल से संशोधित किया गया है। 2। सी और डी जांग एस, एट अल से संशोधित किया गया है। 3। ई और एफ एल यांग, एट अल से संशोधित किया गया है। 4। डेटा मतलब (SEM) का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया। दो समूहों के बीच तुलना छात्र टी परीक्षण के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था, और कई समूहों के बीच तुलना एक तरह से एनोवा के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था। पी <0.05 महत्वपूर्ण माना जाता थानहीं कर सकते। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: microspheres से वृद्धि कारकों की रिहाई। IGF-युक्त microspheres संश्लेषित किया गया था (ए)। Microspheres से IGF-1 जारी 1, 3, 5 और 7 दिनों में मापा गया था के बाद वे (बी) संश्लेषित थे। स्केल बार = 200 माइक्रोन। पैनल एक तु एल, एट अल से संशोधित किया गया था। 2। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: hiPSC व्युत्पन्न trilineage सेल के साथ सेल थेरेपी की दक्षता का आकलनरास। तीन सेल की आबादी के लिए समग्र engraftment दर 4 सप्ताह कोशिका प्रत्यारोपण (ए) के बाद मूल्यांकन किया गया था। हृदय समारोह (के रूप में इंजेक्शन फ्रैक्शन ने संकेत दिया) और रोधगलन आकार कोशिका प्रत्यारोपण (बी) के बाद 1 और 4 हफ्तों में हृदय एमआरआई के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। * पी <0.05 एमआई बनाम; #P <0.05 पैच बनाम। ए और बी एल सुनो, एट अल से संशोधित किया गया है। 2। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किए गए। समूहों के बीच तुलना एक तरह से एनोवा के साथ महत्व के लिए विश्लेषण किया गया। पी <0.05 महत्वपूर्ण माना जाता था। एनोवा के माध्यम के रूप में महत्वपूर्ण पहचान परिणाम Tukey सुधार के साथ reanalyzed थे।

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Discussion

सुधार उपज / hiPSC मुख्यमंत्रियों की पवित्रता

सीएमएस में मानव स्टेम कोशिकाओं फर्क के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल अक्सर कम उपज और पवित्रता के द्वारा सीमित कर रहे हैं; उदाहरण के लिए, hESC मुख्यमंत्रियों का सिर्फ 35-66% Percoll जुदाई और हृदय शरीर के गठन के माध्यम से प्राप्त की धीमी गति से मायोसिन भारी चेन या cTnT 6 व्यक्त किया। भेदभाव hiPSC-मुख्यमंत्री आबादी की पवित्रता को काफी हद तक एक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति है कि के प्रमोटर से जोड़ा गया है के लिए चयन करके बढ़ाया जा सकता है एक मुख्यमंत्री के विशेष प्रोटीन 7, 8, 9, लेकिन इस तकनीक जरूरी आनुवंशिक रूप से संशोधित के उपयोग की आवश्यकता कोशिकाओं है, जो कम वांछनीय हैं, विशेष रूप से चिकित्सीय जांच के लिए। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, hiPSC मुख्यमंत्रियों के 68% cTnT व्यक्त की, और पवित्रता बाद में आनुवंशिक हेरफेर या एकल बिना सूक्ष्म विच्छेदन और Preplating के माध्यम से करने के लिए> 90% की वृद्धि हुई थीसेल चयन। कुल उपज ~ 3-5 लाख प्रति अच्छी तरह से hiPSC मुख्यमंत्रियों था।

hiPSC ईसीएस की बेहतर उपज / स्थिरता

दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया hiPSC-चुनाव आयोग भेदभाव प्रोटोकॉल murine stromal कोशिकाओं 10, 11 और भ्रूण-शरीर गठन 12, 13 के साथ सह संवर्धन पर आधारित हैं। हालांकि, सह संवर्धन विधि murine-वंश कोशिकाओं या प्रोटीन 10, और केवल ~ 15% या भ्रूण-शरीर विधि एक चुनाव आयोग phenotype 10, 12, 13 के माध्यम से ग्रहण का उत्पादन कोशिकाओं के कम से xenogenic संदूषण के लिए ले जा सकता है। hiPSC-चुनाव आयोग भेदभाव यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल xenogenic संक्रमण के जोखिम को समाप्त और अप करने के लिए हो सकता है तरीकों कि भ्रूण निकायों (जिस पर निर्भर करता hiPSC लाइन का इस्तेमाल किया जाता है) का उपयोग करने की तुलना में अधिक कुशल 3 गुना। Furthermअयस्क, CD31 अभिव्यक्ति के लिए चयन के माध्यम से शुद्धिकरण के बाद, ~ hiPSC ईसीएस के 90% चुनाव आयोग phenotype इन विट्रो में कम से कम 4 हफ्तों के लिए बनाए रखा है, सिर्फ दो सप्ताह जब hiPSC ईसीएस पारंपरिक भेदभाव प्रोटोकॉल 12 के माध्यम से उत्पादित कर रहे हैं की तुलना में।

hiPSC-एसएमसी की प्ररूपी विशिष्टता

एक एसएमसी के phenotype (या एसएमसी की आबादी) शायद सबसे अच्छा मुख्य रूप से सिकुड़ा और सिंथेटिक विशेषताओं के बीच एक संतुलन है, जो मार्कर अभिव्यक्ति गतिविधि आकृति विज्ञान में काफी मतभेद है, और करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में वर्णन किया गया है। इस प्रकार, एक विशेष आवेदन के लिए hiPSC-एसएमसी की उपयोगिता है जो विशिष्ट phenotype उत्पन्न होता है पर निर्भर हो सकता है। hiPSC-एसएमसी भेदभाव और शुद्धि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले मुख्य रूप से सिकुड़ा या सिंथेटिक एसएमसी आबादी है कि कर रहे हैं ~ 95% सिर्फ 2-3 हफ्तों में शुद्ध उत्पादन कर रहे हैं, और xenogenic संक्रमण के जोखिम को कम है, क्योंकि प्रक्रियाओं requ नहीं हैफीडर कोशिकाओं के उपयोग गुस्सा।

सुधार प्रतिरोपित कोशिकाओं के engraftment दर

प्रभावी सेल थेरेपी के लिए प्राथमिक बाधाओं में से एक प्रशासित कोशिकाओं है कि मायोकार्डियम 14, 15, 16, 17 से engrafted कर रहे हैं की बेहद कम संख्या में माना जा रहा है। ऐसे IGF-1 के रूप में साइटोकिन्स कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए बेहतर इस्कीमिक ऊतकों 18, 19, 20 में विषाक्त microenvironment सामना करने से engraftment में सुधार हो सकता है, लेकिन उच्च दबाव के संकुचन के दौरान प्रेरित सुई ट्रैक के माध्यम से और परिधीय संचलन में कोशिकाओं को बाहर निचोड़ कर सकते हैं। इस प्रकार, engraftment की काफी उच्च दर एक IGF-1-युक्त आतंच पैच, जो अधिक था मनाया जब सैम दर से अधिक 2 गुना के माध्यम से कोशिकाओं को इंजेक्शन द्वारा हासिल कीई सेल खुराक, पैच बिना दिलाई संभावना IGF-1 के cytoprotective प्रभाव को और पैच ही है, जो एक शारीरिक बाधा है कि epicardial अंतरिक्ष में अलग हो जा रहा से कोशिकाओं को रोका का गठन करने के लिए दोनों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

गंभीर कदम

कूल्हों कोशिकाओं के pluripotency सुनिश्चित करने के लिए, यह भेदभाव करने से पहले hiPSC लाइन के कुपोषण की जांच pluripotency मार्कर (Nanog, SSEA1, और Oct4, एट अल।) की अभिव्यक्ति का निर्धारण, और टेराटोमा गठन की उनकी क्षमता की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है । यह उनकी pluripotency फिर से जांच करने के लिए जब hiPSC लाइनों के 10 से अधिक पीढ़ियों के लिए passaged दिया है सुझाव दिया है। अविभाजित hiPSC की स्थिति भी सही भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। hiPSC भेदभाव की दीक्षा से पहले की स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए यह करने के लिए सिफारिश की है: 1) ताजा मध्यम (कम से कम दो सप्ताह पुराने) का उपयोग करें, और hiPSC differentiat की दीक्षा से पहले दैनिक मध्यम ताज़ाआयन; 2) enzymatic पाचन समय (कम से कम 5 मिनट) को कम करने, और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे कोशिकाओं कोशिकाओं को अनावश्यक नुकसान को रोकने के लिए; 3) 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं घनत्व पर कोशिकाओं replate; 4) हमेशा 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखने के लिए, और अब की तुलना में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर से बाहर की कोशिकाओं को रखने से बचें।

तकनीक की सीमाएं

इंजेक्शन hiPSC व्युत्पन्न हृदय कोशिकाओं और पैच प्रशासन के संयोजन के लिए हमारे विधि के प्राथमिक नुकसान खुली छाती सर्जरी के लिए आवश्यकता है; इस प्रकार, इस दृष्टिकोण सीधे रोगियों जो समवर्ती कोरोनरी revascularization सर्जरी के दौर से गुजर रहे हैं के लिए के रूप में adjunctive चिकित्सा छोड़कर नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए अनुवाद होने की संभावना नहीं है। और अधिक व्यापक नैदानिक ​​इस्तेमाल इस तरह के एक endoscope- और कैथेटर आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सकता है कि के रूप में एक व्यावहारिक और न्यूनतम इनवेसिव वितरण पद्धति के विकास की आवश्यकता होगीपेट और डायाफ्राम के माध्यम से दिल। इसके अलावा, सबसे महत्वपूर्ण सुरक्षा हृदय सेल थेरेपी के साथ जुड़े चिंताओं में से एक arrhythmogenic जटिलताओं का विकास होता है, और जब बंदरों 1 अरब hESC व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों की intramyocardial इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया, जानवरों के सभी चार सहज arrhythmias 21 विकसित की है। हालांकि, हम arrhythmogenic जटिलताओं का कोई सबूत नहीं है, जब 10 लाख hiPSC व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों आईआर चोट 2 के साथ स्वाइन के दिलों में इंजेक्शन थे, शायद इसलिए कि सेल खुराक छोटे 100 गुना था मनाया।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश

प्रतिरक्षा अस्वीकृति की संभावना कम engraftment दर के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। CRISPR / कैस जीन संपादन प्रणाली शोधकर्ताओं बाहर दस्तक (को) प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) मैं क्लास और द्वितीय श्रेणी के द्वारा "सार्वभौमिक दाता" hiPSCs की एक पंक्ति बनाने के लिए सक्षम हो सकता है। hiPSC एमएचसी KO-ली गई कोशिकाओं और ऊतकों ज सकता हैengraftment की काफी ऊंची दरों AVE। तकनीक में सुधार के रूप में, engraftment दरों में वृद्धि की संभावना है। वृद्धि भ्रष्टाचार आकार के कुछ बिंदु पर, बड़े भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ता दिल की arrhythmogenicity वृद्धि की संभावना है। ग्राफ्ट जुड़े arrhythmogenicity की कमी जीन संपादन प्रौद्योगिकी द्वारा खाई जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति की वृद्धि के साथ कोशिकाओं का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10 cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-β Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 ml centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Protocol Section 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-β Prospec CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ε-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5 T MRI General Electric Signa Horizon LX
7 T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

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References

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Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

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