Summary
Nous présentons trois protocoles nouveaux et plus efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines induites dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et une méthode de distribution qui permet d'améliorer la prise de greffe de cellules transplantées en combinant l'injection de cellules avec la livraison de cytokines pièce à médiation.
Abstract
Humaines induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSCs) doivent être entièrement différenciées en types de cellules spécifiques avant l'administration, mais des protocoles classiques pour différencier hiPSCs en cardiomyocytes (hiPSC-SGC), les cellules endothéliales (hiPSC-CEs), et les cellules musculaires lisses (CML) sont souvent limitée par un faible rendement, la pureté, et / ou une mauvaise stabilité phénotypique. Ici, nous présentons de nouveaux protocoles pour générer hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs qui sont sensiblement plus efficaces que les méthodes conventionnelles, ainsi qu'une méthode pour combiner l'injection de cellules avec un patch contenant une cytokine créée sur le site de l'administration. Le patch améliore à la fois la rétention des cellules injectées, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules d'être pressé hors du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période prolongée. Dans un modèle porcin d'infarctus lésions d'ischémie-reperfusion, le taux de prise de greffe était plus de deux fois plus élevée lorsque lales cellules ont été administrés avec le patch contenant les cytokines sont comparés aux cellules sans correction, et un traitement avec à la fois les cellules et le patch, mais non avec les cellules seules, a été associée à une amélioration significative de la fonction cardiaque et la taille de l'infarctus.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) sont parmi les agents les plus prometteurs pour la thérapie cellulaire régénérative, car ils peuvent être différenciées en une gamme potentiellement illimitée et la quantité de cellules qui ne sont pas rejetées par le système immunitaire du patient. Cependant, leur capacité d'auto-réplication et la différenciation peut aussi conduire à la formation de tumeurs et, par conséquent, hiPSCs doivent être pleinement différenciées en types de cellules spécifiques, tels que les cardiomyocytes (SGC), les cellules endothéliales (EC), et les cellules musculaires lisses (CML ), avant l'administration. Une des méthodes les plus simples et les plus courantes de l'administration des cellules est l'injection intra-myocardique directe, mais le nombre de cellules transplantées qui sont greffées par le tissu myocardique natif est exceptionnellement bas. Une grande partie de cette attrition peut être attribuée à l'environnement cytotoxique du tissu ischémique; Cependant, lorsque les cellules souches embryonnaires murines (CES) ont été injectés directement dans le myocarde des cœurs indemnes, oeul ~ 40% des 5 millions de cellules livrées ont été retenus pendant 3-5 h 1, ce qui suggère qu'une proportion importante des cellules administrées a quitté le site d'administration, peut - être parce qu'ils ont été évincés par la piste de l' aiguille par les hautes pressions produites au cours de la contraction du myocarde.
Ici, nous présentons des méthodes nouvelles et sensiblement plus efficaces pour générer cardiomyocytes hiPSC dérivés (hiPSC-SGC) 2, les cellules endothéliales (hiPSC-CEs) 3, et les cellules musculaires lisses (CML) 4. Notamment, ce protocole hiPSC-SMC est le premier à imiter le large éventail de caractéristiques morphologiques et fonctionnelles observées dans somatique CML 5 en dirigeant les cellules vers un phénotype SMC essentiellement synthétique ou contractile. Nous fournissons également une méthode de livraison de cellules qui améliore le taux de cellules injectées de greffe en créant un contenant cytokine-fibrine pATCH sur le site d'injection. Le patch semble améliorer à la fois la rétention des cellules, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules de sortir du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période d'au moins trois jours.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales sont réalisées en conformité avec les lignes directrices animales de l'Université d'Alabama à Birmingham.
1. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CMs
- Revêtir les puits d'une plaque à 6 puits avec un mélange de protéines gélatineux prérefroidie aux facteurs de croissance réduite à 4 ° C pendant une nuit. Aspirer le mélange de protéines gélatineux avant utilisation. Ensemencer les hiPSCs sur les plaques pré-revêtues, et la culture des cellules (1 x 10 5 cellules par puits) à 5% de CO 2 et 37 ° C en milieu mTeSR1 supplément avec un inhibiteur de ROCK 10 pm.
- Actualiser le moyen quotidien jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence; Ensuite, ajouter le mélange de protéines gélatineux facteurs de croissance réduite dans le milieu (mélange 0,5 mg gélatineux de protéines par plaque à 6 puits, 2 ml de milieu par puits) et culture des cellules pendant 5% de CO 2 et 37 ° C encore deux jours.
- Pour remplacer le milieu, aspirer délicatement le moyen de la boîte de Pétri via vide avecà toucher les cellules, et ajouter un nouveau milieu à l'aide d'une pipette de transfert.
- Initier la différenciation en remplaçant le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de facteurs de croissance réduit mélange protéique gélatineuse, sans B27 insuline et 100 ng / ml d'activine A; la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 24 heures.
- Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 qui a été complémenté avec B27 sans insuline, 10 ng / ml de protéine morphogénique de l'os 4 (BMP-4), et le facteur 10 ng / ml de croissance basique des fibroblastes (bFGF); la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 96 heures.
- Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de B27 et poursuivre la culture des cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C; rafraîchir le milieu tous les 3 jours.
- Observer des amas de cellules contracter sous le microscope ~ 3 jours après le début de la différenciation. Recueillir les grappes ~ 7 jours après la première observation des contractions et les laver dans une solution saline équilibrée de Hanks.
- Dissocier les cellules groupées dans la plaque en les incubant dans un tampon Hanks contenant 100 U / ml de collagénase IV pendant 10 min à 37 ° C en agitant doucement; puis, ajouter 0,25% de trypsine dans de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 min.
- Neutraliser la solution d'enzyme avec 10% de sérum de fœtus bovin dans du RPMI / moyen B27, puis remettre en suspension les cellules dans du milieu RPMI / B27.
- Comptez le nombre de cellules par hémocytomètre. Cultiver les cellules sur les boîtes de 10 cm à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 3 heures, ce qui permettra aux cellules non cardiomyocytes à adhérer à la surface de la boîte de culture.
- Recueillir la suspension cellulaire, qui contient le hiPSC CMS et maintenir les cellules (environ 1 x 10 6 cellules par boîte de 10 cm) en les cultivant sur une surface du mélange revêtu de protéine gélatineux.
2. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CEs
- Dissocier la population hiPSC en cellules isolées par incubation them avec un agent chélateur à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 5 min. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant du milieu mTeSR1 frais.
- Isoler les cellules à 200 xg pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans un milieu mTeSR1 complété avec un inhibiteur de ROCK 10 uM. Déterminer la densité de cellules avec un hémocytomètre.
- Ajouter 250 ul de 20 unités NIH / ml de solution de thrombine à un puits d'une plaque à 24 puits.
- Ajouter 1 x 10 6 hiPSCs 250 pi d'un / ml de solution de fibrinogène de 12,5 mg. Et ajouter 250 ul de solution de fibrinogène contenant des cellules à la thrombine ainsi chargé. Observer le mélange se solidifie pour former une fibrine échafaudage contenant de hiPSC au sein min.
- Transférer les, échafauds contenant des cellules solidifiées dans les puits d'une plaque à 6 puits avec la pince de verre de couverture, et d'initier la différenciation en cultivant les échafauds dans 2 ml de milieu EBM2 additionné de 2% B27 sans insuline, activine A (50 ng / ml) et la BMP-4 (25 ng / ml) pendant 24 heures à 5% de CO
- Remplacez le support en suçant doucement l'ancien milieu par le vide sans toucher les cellules. Ajouter un nouveau milieu EBM2 additionné de B27, sans insuline, facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF 50ng / ml), l'érythropoïétine (EPO, 100 ng / ml) et en transformant β1 de facteur de croissance (TGFβ1, 10 ng / ml) et de la culture le échafauds à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 48 h.
- Actualiser le moyen et la culture les échafauds à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant encore 48 heures; puis libérer les cellules de l'échafaudage par l'addition de 200 U de collagénase IV (100 U / ml) au milieu.
- Isoler les cellules après leur libération. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu EGM2-MV supplémenté avec 2% de B27, le VEGF-A (50 ng / ml), et le SB-431542 (10 uM); rafraîchir le milieu tous les deux jours.
- Environ 10 jours plus tard (soit le ~ Jour 14 après différenciation a été lancé), dissocier les cellules avec 100 U / ml de collagénase IV, isoler hiPSC-ECs de la population de cellules différenciées par cytométrie de flux analyse pour l'expression de protéines marqueurs EC-spécifiques (par exemple, CD31, CD144) 3.
- Développez le isolé hiPSC-CEs via un protocole établi 3.
3. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CML
- Ensemencer les hiPSCs sur des plaques qui ont été enrobées avec le mélange protéique gélatineuse, et la culture des cellules dans un milieu mTeSR1 à 5% de CO 2 et 37 ° C, avec des changements de milieu tous les jours, jusqu'à la confluence (~ 2 jours).
- Initier la différenciation en cellules mésodermiques lignée en cultivant les cellules avec CHIR99021 (5 uM) et BMP-4 (10 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l'insuline pendant 3 jours.
- Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype essentiellement synthétique:
- La culture des cellules avec le VEGF-A (25 ng / ml), de β du facteur de croissance des fibroblastes (FGFβ, 5 ng / ml) dans du RPMI1640 moi dium et 2% de B27 insuline à moins de 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 4 jours.
- La culture des cellules dans VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l' insuline à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 2 jours.
- La culture des cellules en β du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFß (3 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l' insuline à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 4 jours.
- Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype contractile principalement:
- La culture des cellules pendant 4 jours avec le VEGF-A (25 ng / ml) et FGFβ (5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de moins B27 insuline.
- La culture des cellules pendant 7 jours avec PDGFβ (5 ng / ml) et de la TGFß (2,5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l'insuline.
- Purifier populations finales hiPSC-SMC en cultivant les cellules dans du lactate (4 mM) contenant du milieu RPMI 1640 métabolique pendant environ 6 jours.
- Chauffer l'huile d'olive à 45 ° C dans un bain d'eau.
- Chauffer 5 ml d'une solution de gélatine à 10% à 50 ° C.
- Ajouter la gélatine à l'huile d'olive, mélanger, puis refroidir rapidement à 5 ° C en ajoutant de la glace pour le bain d'eau.
- Vingt-cinq minutes plus tard, ajouter réfrigérée (4 ° C), de l'acétone à l'huile d'olive pour induire la formation de microsphères.
- Maintenir la température à 5 ° C pendant 1 heure; puis, recueillir les microsphères, les laver 5 fois avec de l'acétone pré-refroidie pour éliminer l'huile d'olive, et leur permettre de sécher à l'air à 4 ° C.
- Remettre en suspension les microsphères dans une solution de 70% d'éthanol et 0,25% de glutaraldéhyde pendant une nuit à 4 ° C pour induire la réticulation, puis neutraliser le mélange avec de la glycine 100 mM.
- La charge de l' IGF dans les microsphères par mélange de 5 mg de microsphères avec 15 ul de H 2 O distillée contenant 5 ug d' IGF et 0,1% d' albumine de sérum bovin pendant 30 minutes.
5. Création du Patch sur le site de la blessure et l'injection des cellules
- Suspendre le CMs hiPSC dérivé (2 millions), CML (1 million), et endothéliales (1 million), ainsi que dans 1 ml du milieu essentiel minimum (MEM).
- Suspendre 5 mg de microsphères dans 1 ml de solution de fibrinogène (25 mg / ml).
- Remplir une seringue avec la solution contenant des cellules, une autre seringue contenant la solution de fibrinogène / microsphère, et une troisième seringue avec 1 ml de solution de thrombine (80 unités NIH / ml, supplémenté avec 2 ul de 400 mM de CaCl2 et 200 mM de ε-aminocaproïque acide).
- Chirurgicalement induire un infarctus du myocarde dans le cœur du porc par ligature de antérieure gauche artère coronaire descendante comme décrit précédemment 2.
NOTE: En bref, femelle porcine Yorkshire (~ 13 kg, 45 jours d'âge) sont sous sédation avec une injection intramusculaire de Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), et intubés sous anesthésie générale avec de l'isoflurane (0,5-5%). Une 4 ème intercthoracotomie ostal est réalisée et antérieure gauche artère coronaire descendante est exposée. L'artère coronaire est obstruée par une ligature pendant 60 minutes, puis la ligature est retirée. defibrillation électrique est effectuée immédiatement dans le cas de la fibrillation ventriculaire. - Placer un anneau en plastique stérile (~ 2,5 cm) sur l'épicarde de la région infarcie des coeurs de porc, puis injecter simultanément les solutions microsphère / fibrinogène et de thrombine dans l'anneau.
- Laisser le mélange se solidifier (~ 30 sec), puis insérez l'aiguille de la seringue contenant des cellules à travers le mélange solidifié dans le myocarde infarci et injecter les cellules. Fermez les couches musculaires, du tissu sous-cutané, et la paroi thoracique avec 3-0 ou 2-0 Monocryl suture selon la taille de l'animal. Buprénorphine 0,01-0,02 mg / injection intramusculaire kg toutes les 8 heures sera utilisé pour contrôler la douleur pour les 3 premiers jours après la chirurgie.
- Évaluer la fonction cardiaque en utilisant une résonance magnétique cardiaque(IRM) avant une intervention chirurgicale, d' une semaine et quatre semaines après l'intervention chirurgicale 2, 3, 4. Après les études d'IRM finales, sacrifiez l'animal et le traitement de leurs coeurs pour histologie et analyse moléculaire 2, 3, 4.
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Representative Results
Caractérisation des Differentiated hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs
La capacité différentielle de hiPSCs ont été évaluées 2, 3, 4. Débit analyse cytométrie de la troponine T cardiaque (cTnT) expression suggèrent que la pureté de la finale population hiPSC-CM peut dépasser 90% (figure 1A, 1B, panneau B1). Presque toutes les cellules ont exprimé la myosine lente chaîne lourde (figure 1B, le panneau A1), α-sarcomère actine (Figure 1B, panneau A2), tandis qu'environ 25% ont exprimé l'isoforme 2v de la chaîne légère de myosine (MLC2v) (figure 1B, le panneau B2), qui a été trouvé que dans ventriculaire CMs 4. L'efficacité du protocole de différenciation hiPSC-CE ( à savoir le pourcentage de CD31 + cellules) était substantially supérieur lorsqu'il est effectué avec hiPSCs de la ligne de GRIPS (45,6%, figure 1C, le panneau C2) que avec des cellules de PCBC16iPS (31,3%, figure 1C, le panneau D2); populations de pureté> 95% ont été obtenus par sélection pour l'expression de CD31, et> 90% des cellules sélectionnées ont continué à exprimer CD31 ou CD144 pendant jusqu'à 4 semaines quand elle est cultivée dans du milieu EGM2-MV (sans SVF) additionné de B27, le VEGF, et SB431542 (figure 1D) 3. Plus de 94% de la hiPSC-CML purifié exprimé actine musculaire lisse (SMA), mais synthétique hiPSC-CML étaient plus susceptibles que contractile hiPSC-CML pour exprimer le collagène 1, connexine 43, ou vimentine (figure 1E). La capacité de hiPSC-CML migration et la prolifération ont été évalués 4. Synthétique hiPSC-CML étaient également plus migrateurs et proliférative que contractile hiPSC-CML (Figure 1F, panneaux i et ii), tandis que CML contractiles contracté plus fortement in réponse au traitement par le carbachol (figure 1F, les panneaux iii, iv et v).
Un facteur de croissance de presse de Gélatine Microsphères
Des mesures ELISA de l' IGF-1 dans le milieu de culture, de patchs acellulaires ont indiqué que le facteur de croissance a été libérée à partir des microsphères sur une période d'au moins 3 jours (figure 2A) 2. Les analyses ont été réalisées en chargeant 5 mg de microsphères contenant de l'IGF-avec 5 pg d'IGF-1. Un patch a été généré en mélangeant les microsphères avec 1 ml de solution de fibrinogène et 1 ml de thrombine. Le patch a été cultivée dans 2 ml de MEM. Un ml de milieu a été collecté et remplacé par 1 ml de MEM frais chaque jour (figure 2B). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM.
Observations à partir d'un modèle IR-blessure
2. Un total de 6 millions de hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs (2 millions de chaque type de cellule) ont été injectés directement dans le tissu myocardique lésé. Pour les animaux du groupe CELL + Patch, un patch composé de fibrine et de l'IGF-1 contenant des microsphères a été créé sur le site de la blessure avant l'injection, alors que les animaux dans le groupe de cellules ont été traitées avec la même dose de cellules, mais sans le patch; les deux traitements ont été retenus à partir d'animaux dans le groupe MI. Quatre semaines après la lésion et le traitement, 9% des cellules délivrées à des animaux dans le groupe de cellules + patch ont été retenus et ont continué à survivre au niveau du site d'administration, comparativement à seulement 4% des cellules administrées à des animaux dans le groupe de cellules (Figure 3A). Le traitement à la fois les cellules et le patch, mais pas avec les cellules seules, était également Associciés à des améliorations significatives dans les mesures de la fonction cardiaque et la taille de l' infarctus (figure 3B).
Figure 1: La différenciation des cardiomyocytes dans hiPSCs, les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses. La différenciation des cardiomyocytes et la pureté de hiPSC-CM ont été évalués par cytométrie de flux (A) et histologie avec des marqueurs cardiaques différents (B). La différenciation endothéliale de hiPSC a été déterminée par cytométrie de flux (C). Le maintien du phénotype endothélial de hiPSC-EC a été évaluée par l' analyse de l'expression de CD31 et CD144 à 2, 3 et 4 semaines après la purification par cytométrie de flux (D). La différenciation des cellules lisses musculaires de hiPSC a été mesurée par différents marqueurs (E). Et le potentiel de la migration et la prolifération desles cellules musculaires lisses synthétiques par rapport aux cellules musculaires lisses contractiles dérivés de hiPSCs a été évaluée (F). Les noyaux ont été DAPI dans la coloration par immunofluorescence. Barre d'échelle = 100 pm (B) et 200 um (E et F). La capacité de synthèse hiPSC-CML migration et la prolifération a été évaluée (F, panel i et ii). Et la contraction des CML contractiles en réponse au traitement par le carbachol a été évaluée (F, tableau III-V). * P <0,05, synthétique hiPSC-CML vs. contractile hiPSC-CML. A et B ont été modifiés par Ye L, et al. 2. C et D ont été modifiés par Zhang S et al. 3. E et F ont été modifiés par Yang L, et al. 4. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Comparaison entre les deux groupes a été évaluée par le test T de Student, et la comparaison entre plusieurs groupes a été évaluée par le biais d'une analyse de variance. p <0,05 a été considérée comme significant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Libération des facteurs de microsphères de croissance. Des microsphères contenant de l' IGF-a été synthétisé (A). IGF-1 libération de microsphères a été mesurée à 1, 3, 5 et 7 jours après qu'ils ont été synthétisés (B). Barre d'échelle = 200 um. Un panneau a été modifié par Ye L., et al. 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Évaluation de l' efficacité de la thérapie cellulaire avec cel de trilineage hiPSC dérivésls. Le taux de greffage global de la population de trois cellules a été évalué 4 semaines après la transplantation de cellules (A). La fonction cardiaque (comme indiqué par la fraction d'éjection) et la taille de l' infarctus a été évaluée par IRM cardiaque à 1 et 4 semaines après la transplantation de cellules (B). * P <0,05 par rapport au MI; #p <0,05 par rapport au Patch. A et B ont été modifiés par Ye L., et al. 2. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM. Les comparaisons entre les groupes ont été analysés pour la signification d'une ANOVA. p <0,05 a été considérée comme significative. Résultats identifiés comme significatifs par ANOVA ont été réanalysés avec la correction Tukey.
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Discussion
Amélioration de rendement / pureté de hiPSC-CMs
protocoles classiques pour la différenciation des cellules souches humaines dans CMs sont souvent limitées par un faible rendement et la pureté; par exemple, juste 35-66% des CSEh-CMs obtenu par Percoll séparation et la formation du corps cardiaque exprimé myosine lente chaîne lourde ou cTnT 6. La pureté des populations hiPSC-CM différenciées peut être sensiblement augmentée en sélectionnant pour l'expression d'un gène rapporteur qui a été lié au promoteur d'un spécifiques au CM protéine 7, 8, 9, mais cette technique requiert obligatoirement l'utilisation d' organismes génétiquement modifiés des cellules, qui sont moins souhaitables, en particulier pour les examens cliniques. Avec le protocole présenté ici, 68% de la hiPSC-CMs exprimé cTnT, et la pureté a ensuite été augmenté à> 90% par l'intermédiaire de micro-dissection et prédépôt sans manipulation génétique ou simplesélection -cell. Le rendement total était ~ 3-5000000 hiPSC-CMs par puits.
Amélioration Rendement / Stabilité des hiPSC-CEs
Les deux protocoles de différenciation hiPSC-CE les plus couramment utilisés sont basés sur la co-culture avec des cellules murines stromales 10, 11 et formation embryonnaire-corps 12, 13. Cependant, la méthode de co-culture peut conduire à une contamination xénogénique avec des cellules murines de la lignée ou de protéines 10, et seulement environ 15% ou moins des cellules produites par le procédé embryonnaire corps supposer un phénotype CE 10, 12, 13. Le protocole de différenciation hiPSC-CE présentée ici élimine le risque de contamination xénogénique et peut être jusqu'à 3 fois plus efficace que les méthodes qui utilisent les corps embryonnaires (selon quelle ligne hiPSC est utilisé). e plusminerai, après purification par sélection pour l' expression de CD31, ~ 90% de la hiPSC-CEs a maintenu le phénotype CE pendant au moins 4 semaines in vitro, par rapport à seulement deux semaines quand hiPSC-CEs sont produits via des protocoles de différenciation conventionnels 12.
Phénotypique Spécification des hiPSC-CML
Le phénotype d'un SMC (ou une population de CML) est peut-être mieux décrit comme un équilibre entre les caractéristiques principalement contractiles et synthétiques, ce qui peut conduire à des différences substantielles dans la morphologie, l'expression du marqueur, et de l'activité. Ainsi, l'utilité de hiPSC-CML pour une application particulière peut dépendre de phénotype spécifique qui est généré. Les protocoles de différenciation et de purification hiPSC-SMC présentés ici sont les premiers à produire des populations majoritairement contractiles ou synthétiques SMC qui sont ~ pur à 95% en seulement 2-3 semaines, et le risque de contamination xénogénique est minime, parce que les procédures ne sont pas requIRE l'utilisation de cellules nourricières.
Amélioration de la prise de greffe Taux de cellules transplantées
L' un des principaux obstacles à la thérapie cellulaire efficace est censé être le très faible nombre de cellules administrées qui sont greffées par le myocarde 14, 15, 16, 17. Des cytokines telles que l' IGF-1 peuvent améliorer la prise de greffe , en permettant aux cellules de mieux résister aux microenvironnement toxiques dans les tissus ischémiques , 18, 19, 20, mais les hautes pressions induites lors de la contraction peut presser les cellules à travers le trajet de l' aiguille et dans la circulation périphérique. Ainsi, le taux de greffe considérablement plus élevé atteint par l'injection des cellules grâce à un patch de fibrine contenant IGF-1, ce qui était plus de 2 fois plus que le taux observé lorsque le same dose de cellules a été administré sans le timbre, peut probablement être attribuée à la fois aux effets cytoprotecteurs de l'IGF-1 et à la pièce elle-même, ce qui forme une barrière physique qui empêche les cellules d'être éjectés dans l'espace épicardique.
étapes critiques
Afin d' assurer la pluripotence des cellules HIPS, il est nécessaire de vérifier le caryotype de la ligne hiPSC avant la différenciation, de déterminer l'expression de marqueurs de pluripotence (Nanog, SSEA1 et Oct4, et al.), Et confirmer leur capacité de formation de tératome . Il est suggéré de re-vérifier leur pluripotence lorsque les lignes hiPSC ont été repiquées pendant plus de 10 générations. Le statut de hiPSC indifférenciée est également cruciale pour la bonne différenciation. Afin d'assurer l'état de la hiPSC avant le début de la différenciation, il est recommandé de: 1) utiliser un milieu frais (moins de deux semaines), et rafraîchir le moyen quotidien avant le début du hiPSC differentiation; 2) réduire le temps de digestion enzymatique (moins de 5 min), et doucement la pipette de haut en bas les cellules pour éviter les dommages inutiles aux cellules; 3) replate les cellules à une densité de 1 x 10 5 cellules par puits de la plaque de 6 puits; 4) toujours garder les cellules de 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur, et éviter de garder les cellules de l'incubateur pendant plus de 15 min.
Limites de la technique
Le principal inconvénient de notre méthode pour combiner des cellules cardiaques injectées hiPSC dérivés et de l'administration de patch est l'exigence pour la chirurgie à cœur ouvert; ainsi, cette approche est peu susceptible d'être directement transposables à des applications cliniques, sauf comme thérapie adjuvante pour les patients qui subissent une chirurgie de revascularisation coronaire simultanée. utilisation clinique plus répandue nécessitera le développement d'une méthode de livraison pratique et peu invasive, comme une approche endoscope- et le cathéter à base qui pourrait accéder àle cœur à travers l'abdomen et le diaphragme. En outre, l' un des problèmes de sécurité les plus critiques associés à la thérapie cellulaire cardiaque est le développement de complications arythmogènes, et quand les singes ont été traités avec des injections intramyocardiaques de 1 milliard de CMs CSEh dérivées, les quatre animaux ont développé des arythmies spontanées 21. Cependant, nous avons observé aucun signe de complications arythmogènes lorsque 10 millions de cms hiPSC dérivées ont été injectées dans le cœur des porcs avec des blessures IR 2, peut - être parce que la dose de cellules était 100 fois plus petit.
Applications ou orientations futures
Le rejet immunitaire joue probablement un rôle important pour le taux de greffe faible. Le / Cas système de montage du gène CRISPR peut permettre aux chercheurs de créer une ligne de hiPSCs «donneurs universels» par knock-out (KO) complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et de classe II. Les cellules et les tissus peuvent h hiPSC KO CMH dérivéesave des taux nettement plus élevés de la greffe. Comme les techniques améliorent, les taux sont susceptibles de prise de greffe augmenter. À certain point de l'augmentation de la taille de la greffe, on prévoit que la grande greffe pour augmenter la arythmogénicité du cœur bénéficiaire. La réduction des greffes associées arythmogénicité pourrait être obtenue en utilisant des cellules avec une augmentation de l'écart des protéines de jonction expression par la technologie de modification génétique.
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Disclosures
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
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