Summary
Vi presenterar tre nya och mer effektiva protokoll för differentiering mänskliga inducerade pluripotenta stamceller till kardiomyocyter, endotelceller och glatta muskelceller och en leveransmetod som förbättrar engraftment av transplanterade celler genom att kombinera cellinjektion med patch-medierad cytokin leverans.
Abstract
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) måste vara helt differentieras till specifika celltyper före administrering, men konventionella protokoll för differentiering hiPSCs i kardiomyocyter (hiPSC-CMS), endotelceller (hiPSC-ECS), och glatta muskelceller (SMC) är ofta begränsas av lågt utbyte, renhet och / eller dålig fenotypiska stabilitet. Här presenterar vi nya protokoll för att generera hiPSC-CMs, -ECs och -SMCs som är väsentligen effektivare än konventionella metoder, såväl som en metod för att kombinera cellinjektion med en cytokin-innehållande plåster som skapas över platsen för administrationen. Plåstret förbättrar både den kvarhållande av de injicerade cellerna, genom att försegla nålen spåret för att förhindra cellerna från att pressas ut från myokardiet, och cellöverlevnad, genom att frisätta insulinliknande tillväxtfaktor (IGF) under en längre period. I en svinmodell av ischemi-reperfusionsskada, graden av engraftment var mer än två gånger större närCellerna administreras med cytokin-innehållande plåster som jämför till cellerna utan plåster, och behandling med båda cellerna och plåstret, men inte med de ensamma celler, var associerat med signifikanta förbättringar i hjärtfunktion och infarktstorlek.
Introduction
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) är bland de mest lovande medel för regenerativ cellterapi, eftersom de kan delas in i ett potentiellt obegränsat utbud och mängd celler som inte avvisas av patientens immunsystem. Däremot kan deras förmåga till självreplikation och differentiering också leda till tumörbildning och därmed hiPSCs måste helt differentieras till specifika celltyper, såsom cardiomyocytes (CMS), endotelceller (ECS), och glatta muskelceller (SMC ), före administrering. Ett av de enklaste och vanligaste metoderna för cell administrering är direkt intramyocardial injektion, men antalet av transplanterade celler som inympats med den nativa hjärtmuskelvävnaden är exceptionellt låg. Mycket av denna förslitning kan hänföras till det cytotoxiska miljön i ischemisk vävnad; emellertid, när murina embryonala stamceller (ESCS) injicerades direkt in i myokardiet av oskadade hjärtan, oNLY ~ 40% av de 5 miljoner celler levererade behölls för 3-5 timmar en, vilket tyder på att en betydande andel av de administrerade cellerna lämnat administreringsstället, kanske för att de var pressas ut genom nålen spår genom de höga trycken som produceras under myocardial kontraktion.
Här presenterar vi nya och betydligt mer effektiva metoder för att generera hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMS) 2, endotelceller (hiPSC-ECS) 3, och glatta muskelceller (SMC) 4. Noterbart är här hiPSC-SMC-protokollet den första för att efterlikna det breda spektrum av morfologiska och funktionella egenskaper som observerats i somatisk SMC 5 genom att rikta cellerna mot en övervägande syntetiska eller kontraktila SMC fenotyp. Vi tillhandahåller även ett förfarande för celladministrering som förbättrar engraftment hastighet av injicerade cellerna genom att skapa en cytokin-innehållande fibrin patch över injektionsstället. Plåstret verkar förbättra både kvarhållande cell, genom att försegla nålen spåret för att förhindra cellerna från att lämna hjärtmuskulaturen, och cellöverlevnad, genom att frisätta insulinliknande tillväxtfaktor (IGF) under en period av minst tre dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utförs i enlighet med de djur riktlinjer för University of Alabama i Birmingham.
1. Differentiering hiPSCs in hiPSC-CMs
- Belägga brunnarna i en 6-brunnars platta med i förväg kyld tillväxt-faktor-reducerade gelatinös proteinblandningen vid 4 ° C över natten. Aspirera gelatinösa proteinblandningen före användning. Ympa hiPSCs på de i förväg belagda plattor, och odla cellerna (1 x 10 5 celler per brunn) vid 5% CO2 och 37 ° C i mTeSR1 mediumsupplement med 10 pM ROCK-inhibitor.
- Uppdatera mediet dagligen tills cellerna når 90% konfluens; sedan, tillsätt tillväxtfaktorreducerade gelatinös proteinblandningen till medium (0,5 mg gelatinös proteinblandning per 6-brunnar, 2 ml medium per brunn) i, och odla cellerna under 5% CO2 och 37 ° C ytterligare två dagar.
- För att byta ut mediet försiktigt suga ut mediet från petriskålen via vakuum medut röra cellerna och lägga till nytt medium med hjälp av en pipett.
- Initiera differentiering genom att ersätta mediet med RPMI1640-medium som kompletterats med tillväxt-faktor-reducerade gelatinös proteinblandningen, B27 utan insulin, och 100 ng / ml Aktivin A; odla cellerna vid 5% CO2 och 37 ° C under 24 h.
- Ersätta mediet med RPMI1640-medium som kompletterats med B27 utan insulin, 10 ng / ml benmorfogent protein 4 (BMP-4), och 10 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF); odla cellerna vid 5% CO2 och 37 ° C under 96 h.
- Ersätta mediet med RPMI1640-medium supplementerat med B27 och fortsätta odla cellerna vid 5% CO2 och 37 ° C; uppdatera medium var 3 dagar.
- Observera kluster av contracting celler under mikroskop ~ 3 dagar efter påbörjad differentiering. Samla kluster ~ 7 dagar efter första observera sammandragningar och tvätta dem i Hanks balanserade saltlösning.
- Dissociera de klustrade-cellerna i plattan genom att inkubera dem i Hanks buffert innehållande 100 U / ml kollagenas IV under 10 minuter vid 37 ° C med försiktig skakning; sedan, tillsätt 0,25% trypsin i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) under 5 min.
- Neutralisera enzymlösningen med 10% fetalt bovint serum i RPMI / B27-medium och därefter återsuspendera cellerna i RPMI / B27-medium.
- Räkna antalet celler genom hemocytometer. Odla cellerna på 10 cm skålar vid 5% CO2 och 37 ° C under minst 3 h, vilket gör att de icke-cardiomyocyte celler att vidhäfta till ytan av odlingsskålen.
- Samla cellsuspensionen, som innehåller hiPSC-CMs, och underhålla cellerna (cirka 1 x 10 6 celler per 10 cm skål) genom odling av dem på en gelatinös proteinblandning -belagd yta.
2. Differentiering hiPSCs in hiPSC-EC
- Dissociera hiPSC befolkningen i enstaka celler genom inkubation them med kelatbildande medel vid 5% CO2 och 37 ° C under 5 min. Överföra celler till en 15 ml centrifugrör innehållande färskt mTeSR1 medium.
- Centrifugera ner cellerna vid 200 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i mTeSR1-medium som kompletterats med 10 pM ROCK-inhibitor. Bestämma celltäthet med en hemocytometer.
- Tillsätt 250 pl av 20 NIH-enheter / ml trombinlösning till en brunn i en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 1 x 10 6 hiPSCs till 250 fil av en 12,5 mg / ml fibrinogenlösning. Och tillsätt 250 pl cellinnehållande fibrinogen lösning på trombin belastade väl. Observera blandningen stelna för att bilda en hiPSC innehållande fibrin byggnadsställning inom min.
- Överföra den stelnade, cellinnehållande ställningar i brunnarna på en 6-brunnsplatta med täckglas pincett, och initiera differentiering genom odling av byggnadsställningar i 2 ml EBM2 medium kompletterat med 2% B27 utan insulin, aktivin-A (50 ng / ml), och BMP-4 (25 ng / ml) under 24 h vid 5% CO
- Ersätta mediet genom att försiktigt suga ut den gamla mediet via vakuum utan att röra cellerna. Lägg till ett nytt EBM2 medium kompletterat med B27 utan insulin, vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF, 50 ng / ml), erytropoietin (EPO, 100 ng / ml), och transformerande tillväxtfaktor β1 (TGFβ1, 10 ng / ml), och kultur den ställningar vid 5% CO 2 och 37 ° C under 48 timmar.
- Uppdatera mediet och kulturen ställningar vid 5% CO2 och 37 ° C under ytterligare 48 h; Släpp sedan cellerna från ställningen genom att tillsätta 200 U kollagenas IV (100 U / ml) till mediet.
- Snurra ned cellerna efter att de släppts. Ersätta mediet med 2 ml EGM2-MV-medium kompletterat med 2% av B27, VEGF-A (50 ng / ml), och SB-431542 (10 | iM); uppdatera mediet varannan dag.
- Cirka 10 dagar senare (dvs. på ~ Dag 14 efter differentieringen inleddes), dissociera cellerna med 100 U / ml kollagenas IV, isolera hiPSC-EC från populationen av differentierade celler via flödescytometri analyser för expression av EG-specifika markörproteiner (t.ex. CD31, CD144) 3.
- Expandera isolerade hiPSC-EC via ett etablerat protokoll 3.
3. Differentiering hiPSCs in hiPSC-SMC
- Ympa hiPSCs på plattor som har belagts med gelatinös proteinblandning, och odla cellerna i mTeSR1 medium vid 5% CO2 och 37 ° C, med dagliga mediumbyten, tills konfluenta (~ 2 dagar).
- Initiera differentiering till mesodermalt-härstamningsceller genom odling av cellerna med CHIR99021 (5 | iM) och BMP-4 (10 ng / ml) i RPMI1640-medium och 2% B27 plus insulin i 3 dagar.
- För att producera hiPSC-SMC med en övervägande syntetisk fenotyp:
- Odla cellerna med VEGF-A (25 ng / ml), fibroblasttillväxtfaktor β (FGFβ, 5 ng / ml) i RPMI1640 me DIUM, och 2% B27 minus insulin vid 5% CO2 och 37 ° C under 4 dagar.
- Odla cellerna i VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) i RPMI1640-medium, och 2% B27 plus insulin vid 5% CO2 och 37 ° C under 2 dagar.
- Odla cellerna i blodplätthärledda tillväxtfaktor β (PDGFp, 10 ng / ml), TGFp (3 ng / ml) i RPMI1640, och 2% B27 plus insulin vid 5% CO2 och 37 ° C under 4 dagar.
- För att producera hiPSC-SMC med en övervägande kontraktil fenotyp:
- Odla cellerna under 4 dagar med VEGF-A (25 ng / ml) och FGFβ (5 ng / ml) i RPMI1640 och 2% B27 minus insulin.
- Odla cellerna under 7 dagar med PDGFp (5 ng / ml) och TGF (2,5 ng / ml) i RPMI1640 och 2% B27 plus insulin.
- Rena de slutliga hiPSC-SMC populationer genom odling av cellerna i laktat (4 mM), som innehöll RPMI1640 metabolisk medium för ~ 6 dagar.
- Värm olivolja till 45 ° C i ett vattenbad.
- Värme 5 ml 10% gelatinlösning till 50 ° C.
- Lägg gelatinet till olivolja, rör om, och sedan snabbt kyl till 5 ° C genom tillsats av is till vattenbadet.
- Tjugofem minuter senare, tillsätt kyld (4 ° C) aceton till olivolja för att inducera mikrosfärbildning.
- Hålla temperaturen vid 5 ° C under 1 h; sedan, samla mikrosfärerna, tvätta dem 5 gånger med i förväg kyld aceton för att avlägsna den olivolja, och tillåta dem att lufttorka vid 4 ° C.
- Återsuspendera mikrosfärerna i en lösning av 70% etanol och 0,25% glutaraldehyd över natten vid 4 ° C för att inducera tvärbindning, och sedan neutralisera blandningen med 100 mM glycin.
- Belastning IGF i mikrosfärerna genom blandning av 5 mg mikrosfärer med 15 pl destillerat H2O innehållande 5 | j, g IGF och 0,1% bovint serumalbumin under 30 min.
5. Skapa Patch över platsen för skadan och injicera celler
- Avbryta hiPSC-härledda CMS (2 miljoner), SMC (1 miljon), och EC (1 miljon) tillsammans i 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Suspendera 5 mg mikrosfärer i en ml fibrinogenlösning (25 mg / ml).
- Fyll en spruta med den cellinnehållande lösningen, en annan spruta med fibrinogen / mikrosfär-lösning, och en tredje spruta med 1 ml trombinlösning (80 NIH-enheter / ml, med tillsats av 2 | il 400 mM CaCl2 och 200 mM ε-aminokapronsyra syra).
- Kirurgiskt inducera hjärtinfarkt i svin hjärtat via ligering av vänster främre nedåtgående kransartären som beskrivits tidigare två.
OBS: I korthet kvinnliga Yorkshire svin (~ 13 kg, 45 dagar gamla) är sövd med intramuskulär injektion av Telazol / xylazin (4,4 mg / kg), och intuberades under narkos med isofluran (0,5-5%). En 4: e intercOstal torakotomi utförs och vänster främre nedåtgående kransartären exponeras. Kransartären ockluderas av en ligatur i 60 min och därefter ligaturen avlägsnas. Omedelbar elektrisk defibrillering utförs i fallet med ventrikulärt flimmer. - Placera en steril plastring (~ 2,5 cm) på epikardium av infarktregionen svin hjärtan, och sedan samtidigt injicera mikrosfär / fibrinogen och trombinlösningar in i ringen.
- Låt blandningen stelna (~ 30 sek), och sedan in nålen i cellinnehållande sprutan genom den stelnade blandningen i infarkthjärtmuskeln och injicera cellerna. Stäng muskelskikten, subkutan vävnad och bröstkorgen med 3-0 eller 2-0 Monocryl sutur beroende på djurets storlek. Buprenorfin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulär injektion var 8 timmar kommer att användas för att styra smärta för de första 3 dagarna efter operationen.
- Utvärdera hjärtfunktionen med hjälp av en hjärt magnetisk resonans(MRT) före kirurgiskt ingrepp, en vecka och fyra veckor efter den kirurgiska proceduren 2, 3, 4. Efter de slutliga MRI-studier, offra djuret och bearbeta sina hjärtan för histologi och molekylär analys 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av differentierade hiPSC-CMS, -ECs och -SMCs
Differentialkapacitet hiPSCs utvärderades 2, 3, 4. Flödescytometri analyser av kardiellt troponin T (cTnT) expression tyder på att renheten hos den slutliga hiPSC-CM population kan överstiga 90% (figur 1A, 1B, panel B1). Nästan alla celler uttryckte långsam myosin tung kedja (figur 1B, panel A1), α-sarcomeric aktin (Figur 1B, panel A2), medan cirka 25% uttryckte 2v isoformen av myosin lätta kedjan (MLC2v) (Figur 1B, panel B2), som konstaterades endast i kammar CMS 4. Effektiviteten i hiPSC-EG differentiering protokoll (dvs procentandelen CD31 + celler) var substantially högre när den utförs med hiPSCs från grepp linjen (45,6%, figur 1C, panel C2) än med PCBC16iPS celler (31,3%, figur 1C, panel D2); populationer av> 95% renhet uppnåddes genom val för CD31 uttryck, och> 90% av de markerade cellerna fortsatte att uttrycka CD31 eller CD144 i upp till fyra veckor vid odling i EGM2-MV-medium (utan FBS) kompletterat med B27, VEGF, och SB431542 (figur 1D) 3. Mer än 94% av det renade hiPSC-SMC uttryckte glatt muskulatur aktin (SMA), men syntetiska hiPSC-SMC var mer benägna än kontraktila hiPSC-SMC att uttrycka kollagen 1, connexin 43 eller vimentin (figur 1E). Migrationen och spridning förmåga hiPSC-SMC utvärderades fyra. Syntetisk hiPSC-SMC var också mer flyttande och proliferativ än sammandragande hiPSC-SMC (Figur 1F, paneler I och II), medan kontraktila SMC kontrakterade starkare in svar på karbakol behandling (Figur 1F, paneler III, IV och V).
Tillväxtfaktor Release av gelatin mikrosfärer
ELISA-mätningar av IGF-1-nivåer i mediet från odlade, cellfria fläckar indikerade att tillväxtfaktorn frisattes från mikrosfärerna under en period av minst 3 dagar (figur 2A) 2. Analyserna utfördes genom att ladda 5 mg av IGF-innehållande mikrosfärer med 5 | j, g IGF-1. Ett plåster framställdes genom att blanda mikrosfärer med 1 ml fibrinogenlösning och en ml trombin. Plåstret odlades i 2 ml MEM. En ml av mediet uppsamlades och ersattes med 1 ml färsk MEM varje dag (Figur 2B). Data presenterades som medelvärden ± SEM.
Observationer från en IR-skada Modell
2. Totalt 6.000.000 hiPSC-CMS, -ECs och -SMCs (2 miljoner varje celltyp) injicerades direkt i den skadade hjärtmuskelvävnaden. För djur i CELL + Patch-grupp, en lapp sammansatt av fibrin och IGF-1-innehållande mikrosfärer skapades över skadestället före injektion, medan djuren i cellgruppen behandlades med samma cell dos men utan plåstret; båda behandlingarna var undanhållit från djur i MI-gruppen. Fyra veckor efter skada och behandling, var 9% av cellerna levereras till djur i CELL + Patch grupp kvar och fortsatte att överleva på platsen för administrering, jämfört med bara 4% av cellerna administreras till djur i cellgruppen (Figur 3A). Behandling med både cellerna och plåstret, men inte med enbart celler, var också Associpade med betydande förbättringar i mätningar av hjärtfunktionen och infarktstorlek (figur 3B).
Figur 1: Differentiering av hiPSCs till kardiomyocyter, endotelceller och glatta muskelceller. Cardiomyocyte differentiering och renheten hos hiPSC-CMs utvärderades via flödescytometri (A) och histologi med olika hjärtmarkörer (B). Den endoteliala differentiering av hiPSC bestämdes med flödescytometri (C). Upprätthållandet av den endoteliala fenotyp av hiPSC-EC bedömdes via analysera uttrycket av CD31 och CD144 på 2, 3, och 4 veckor efter den rening genom flödescytometri (D). Den glatta muskelceller differentiering av hiPSC mättes genom olika markörer (E). Och migration och proliferation potentialsyntetiska glatta muskelceller vs. kontraktila glatta muskelceller härrörande från hiPSCs bedömdes (F). Kärnor motfärgades med DAPI i immunofluorescensfärgning. Skalstreck = 100 | im i (B) och 200 | j, m (E och F). Migrationen och spridning förmåga syntetisk hiPSC-SMC utvärderades (F, panel I och II). Och kontraktion av kontraktila SMC som svar på karbakol behandling bedömdes (F, Panel III-v). * P <0,05, syntetisk hiPSC-SMC jämfört sammandragande hiPSC-SMC. A och B ändrades från Ye L, et al. 2. C och D ändrades från Zhang S, et al. 3. E och F modifierades från Yang L, et al. 4. Data presenterades som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Jämförelse mellan två grupper utvärderades via Students T-test, och jämförelser mellan olika grupper bedömdes via envägs ANOVA. p <0,05 ansågs vara signifikan inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Release av tillväxtfaktorer från mikrosfärer. IGF-innehållande mikrosfärer syntetiserades (A). IGF-1 frisättning från mikrosfärer mättes vid 1, 3, 5 och 7 dagar efter att de syntetiserats (B). Skalstreck = 200 | j, m. Panel A modifierades från Ye L., et al. 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utvärdering av effektiviteten i cellterapi med hiPSC-härledda trilineage cells. Den totala engraftment kurs för tre cellpopulationen utvärderades 4 veckor efter celltransplantation (A). Hjärtfunktionen (vilket indikeras av ejektionsfraktion) och infarkt storlek utvärderades via hjärt MRI vid 1 och 4 veckor efter celltransplantation (B). * P <0,05 kontra Ml; #p <0,05 kontra Patch. A och B ändrades från Ye L., et al. 2. Data presenterades som medelvärde ± SEM. Jämförelser mellan grupper analyserades för signifikans med en envägs ANOVA. p <0,05 ansågs vara signifikant. Resultat identifierats som betydande via ANOVA var analyseras om med Tukey korrigering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förbättrat utbyte / renhet av hiPSC-CM
Konventionella protokoll för differentiering mänskliga stamceller i CMS begränsas ofta av lågt utbyte och renhet; till exempel, bara 35-66% av hESC-CM som erhållits via Percoll separation och hjärt kropp formation uttryckt långsam myosin tung kedja eller cTnT 6. Renheten av differentierade hiPSC-CM populationer kan ökas väsentligt genom att välja med avseende på expression av en reportergen som har kopplats till promotorn av en CM-specifikt protein 7, 8, 9, men denna teknik kräver nödvändigtvis användningen av genetiskt modifierade celler, som är mindre önskvärd, i synnerhet för kliniska undersökningar. Med protokollet presenteras här, 68% av hiPSC-CM uttryckte cTnT, och renheten därefter ökade till> 90% via mikro-dissektion och preplating utan genetisk manipulation eller enstaka-cell val. Det totala utbytet var ~ 3-5.000.000 hiPSC-CM per brunn.
Förbättrat utbyte / stabilitet hiPSC-EC
De två vanligaste protokollen hiPSC-EG differentiering bygger på samodling med murina stromaceller 10, 11 och embryonala kroppen formation 12, 13. Dock kunde co-odling metod leda till xenogen kontaminering med mus-härstamning celler eller proteiner 10 och endast ~ 15% eller mindre av de celler som producerats via embryonala kroppen metod anta ett EG-fenotyp 10, 12, 13. Den hiPSC-EG-differentiering Protokollet presenteras här eliminerar risken för xenogena förorening och kan vara upp till tre gånger mer effektivt än de metoder som använder embryonala organ (beroende på vilken hiPSC linje används). Furthermmalm, efter rening via val för CD31 uttryck, ~ 90% av hiPSC-EC underhålls EG fenotypen under minst 4 veckor in vitro, jämfört med bara två veckor när hiPSC-EC produceras via konventionella differentieringsprotokoll 12.
Fenotypisk Specifikation av hiPSC-SMC
Fenotypen av en SMC (eller en population av SMC) är kanske bäst beskrivas som en balans mellan övervägande kontraktila och syntetiska egenskaper, vilket kan leda till betydande skillnader i morfologi, markör uttryck och aktivitet. Sålunda kan användbarheten av hiPSC-SMC för en särskild tillämpning att bero på vilken specifik fenotyp genereras. De hiPSC-SMC differentiering och reningsprotokoll som presenteras här är de första att producera övervägande kontraktila eller syntetiska SMC populationer som är ~ 95% ren i bara 2-3 veckor, och risken för xenogena förorening är minimal, eftersom förfarandena inte require användningen av matarceller.
Förbättrad Engraftment relativa Transplanterade celler
En av de främsta hindren för en effektiv cellterapi tros vara den extremt låga antalet administrerade celler som ympats av hjärtmuskeln 14, 15, 16, 17. Cytokiner såsom IGF-1 kan förbättra engraftment genom att möjliggöra för cellerna att bättre stå emot den giftiga mikromiljö i ischemiska vävnader 18, 19, 20, men de höga trycken som induceras under kontraktion kan pressa cellerna ut genom nålen spåret och in i den perifera cirkulationen. Således, det betydligt högre frekvens av engraftment uppnås genom injicering av cellerna genom en IGF-1-innehållande fibrin lapp, som var mer än två gånger större än hastigheten observeras när same cell dosen administrerades utan plåstret, kan sannolikt tillskrivas både till de cytoprotektiva effekterna av IGF-1 och till plåstret i sig, vilket bildade en fysisk barriär som förhindrade cellerna från att matas ut in i den epikardiella utrymmet.
kritiska steg
För att säkerställa att pluripotens av höfterna celler är det nödvändigt att kontrollera karyotyp av hiPSC linjen före differentiering, bestämma uttrycket av pluripotens markörer (Nanog, SSEA1 och Oct4, et al.), Och bekräfta deras förmåga att teratom bildning . Det föreslås att åter kontrollera deras pluripotens när hiPSC linjer har passe för mer än 10 generationer. Statusen för odifferentierade hiPSC är också avgörande för den korrekta differentieringen. För att säkerställa status hiPSC före initieringen av differentiering, är det rekommenderat att: 1) använda färskt medium (mindre än två veckor gamla), och uppdatera mediet dagligen före initiering av hiPSC differentiatJon; 2) minska den enzymatiska uppslutningstiden (mindre än 5 min), och försiktigt pipettera upp och ner cellerna för att förhindra onödig skada på cellerna; 3) förnyad utbredning cellerna vid en densitet 1 x 10 5 celler per brunn i 6-brunnars platta; 4) alltid hålla cellerna i 37 ° C och 5% CO2 inkubator, och undvika att hålla cellerna ut ur inkubatorn under längre tid än 15 min.
Begränsningar av tekniken
Den primära nackdelen med vår metod för att kombinera injicerade hiPSC härledda hjärtceller och patch administrering är kravet på öppet bröst kirurgi; därför är det osannolikt att vara direkt överföra till kliniska tillämpningar utom som tilläggsbehandling för patienter som genomgår samtidig koronar revaskularisering kirurgi detta tillvägagångssätt. Mer utbredd klinisk användning kommer att kräva utveckling av en praktisk och minimalinvasiv leveransmetod, såsom en endoscope- och kateterbaserad metod som kan få tillgång tillhjärtat genom buken och membranet. Dessutom är en av de mest kritiska säkerhetsrisker förknippade med hjärtcellterapi utvecklingen av arytmogena komplikationer, och när apor behandlades med intramyocardial injektioner av 1 miljard hESC-derived CMS alla fyra djuren utvecklade spontana arytmier 21. Men observerade vi inga tecken på arytmogena komplikationer när 10 miljoner hiPSC härrörande CM injicerades in i hjärtat hos svin med IR skada 2, kanske på grund av cell dosen var 100 gånger mindre.
Framtida Program eller Vägbeskrivning
Immunavstötning spelar troligen en viktig roll för den låga engraftment hastigheten. Den crispr / Cas gen redigering system kan ge forskarna möjlighet att skapa en linje av "universell donator" hiPSCs genom knock out (KO) större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I och klass II. De hiPSC MHC KO-härledda celler och vävnader kan have betydligt högre hastigheter av engraftment. Som tekniker förbättras transplantationstakten sannolikt att öka. Vid viss punkt av ökningen transplantatet storlek, den stora transplantat förväntas öka arrhythmogenicity mottagarens hjärta. Reduktionen av transplantat associerade arrhythmogenicity skulle kunna uppnås genom att använda celler med ökning av kanalförbindelse proteiner expression av genen redigeringsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
