Summary
Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.
Abstract
Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) müssen vollständig in spezifische Zelltypen vor der Verabreichung unterschieden werden, aber herkömmliche Protokolle für hiPSCs in Kardiomyozyten (hiPSC-CMs), Endothelzellen (hiPSC-ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs) Differenzieren sind oft begrenzt durch geringe Ausbeute, Reinheit und / oder schlechter phänotypische Stabilität. Hier stellen wir neue Protokolle zum Erzeugen hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs, die wesentlich effizienter als herkömmliche Verfahren sind, sowie ein Verfahren zum Kombinieren von Zellinjektion mit einem Cytokin Haltiges Pflaster über der Verabreichungsstelle geschaffen. aus dem Myokard gequetscht, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen längeren Zeitraum der Patch verbessert sowohl die Beibehaltung der injizierten Zellen, indem die Nadelbahn Abdichten der Zellen aus zu verhindern. In einem Schweinemodell der myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung, war die Rate der Verpflanzung mehr als das Zweifache größer, wenn dieZellen wurden mit dem Zytokin Haltiges Pflaster zu den Zellen ohne Patch vergleicht verabreicht und die Behandlung sowohl mit den Zellen und dem Patch, aber nicht mit den Allein-Zellen wurde mit signifikanten Verbesserungen in der Herzfunktion und die Infarktgröße zugeordnet ist.
Introduction
Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gehören zu den vielversprechendsten Mittel für die regenerative Zelltherapie, weil sie in eine potenziell unbegrenzte Reichweite und Menge der Zellen unterschieden werden können, die durch den Patienten Immunsystem abgestoßen werden nicht. Aber ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation und die Differenzierung kann auch zur Tumorbildung führen und folglich müssen hiPSCs vollständig in spezifische Zelltypen zu differenzieren, wie Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs ), vor der Verabreichung. Eine der einfachsten und häufigsten Methoden der Zell Verabreichung direkte intramyokardiale Injektion, aber die Anzahl der transplantierten Zellen, die von der nativen Herzmuskelgewebe transplantiert werden, ist außerordentlich gering. Ein Großteil dieser Abrieb kann auf die zytotoxische Umgebung des ischämischen Gewebes zugeschrieben werden; Wenn jedoch murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurden direkt in das Myokard von unversehrten Herzen injiziert, only ~ 40% der 5 Millionen Zellen wurden für 3-5 h 1, behielt geliefert , die ein wesentlicher Teil der verabreichten Zellen legt nahe , dass die Applikationsstelle verlassen, vielleicht , weil sie durch die hohen Drücke durch die Nadelbahn herausgedrückt erzeugt während Myokardkontraktion.
Hier stellen wir neuartige und wesentlich effizientere Methoden zur Erzeugung hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) 2, Endothelzellen (hiPSC-ECs) 3 und glatten Muskelzellen (SMCs) 4. Bemerkenswert ist , ist dies hiPSC-SMC - Protokoll die ersten , die breite Palette von morphologischen und funktionellen Eigenschaften in somatischen SMCs 5 beobachtet zu imitieren , indem die Zellen in Richtung einer überwiegend synthetische oder Kontraktions SMC - Phänotyp zu lenken. Wir stellen auch ein Verfahren zur Zellabgabe, die durch die Schaffung eines Cytokin-enthaltenden Fibrin p die Transplantationsrate von injizierten Zellen verbessertAtch auf die Injektionsstelle. Der Patch erscheint beide Zellretention zu verbessern, indem der Nadelbahn Abdichten der Zellen aus dem Verlassen des Myokards, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen Zeitraum von mindestens drei Tage zu verhindern.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren werden in Übereinstimmung mit den Tier Richtlinien der University of Alabama in Birmingham durchgeführt.
1. Differenziert hiPSCs in hiPSC-CMs
- Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit vorgekühlten wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteingemisch bei 4 ° C über Nacht. Saugen Sie das gallertartig Proteinmischung vor dem Gebrauch. Seed die hiPSCs auf die vorbeschichteten Platten und Kultur der Zellen (1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung) bei 5% CO 2 und 37 ° C in mTeSR1 Medium Ergänzung mit 10 uM ROCK - Inhibitor.
- Aktualisieren Sie das Medium täglich, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen; dann, wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteinmischung zu dem Medium (0,5 mg gelatinösen Proteinmischung pro Platte mit 6 Vertiefungen, 2 ml Medium pro Vertiefung), und die Kultur der Zellen für 5% CO 2 und 37 ° C zwei Tage hinzu.
- Um das Medium zu ersetzen, saugen sanft das Medium aus der Petrischale über Vakuum mitaus den Zellen zu berühren, und neues Medium mit einer Transferpipette hinzufügen.
- Initiieren Differenzierung durch das Medium mit RPMI1640-Medium ersetzt, supplementiert mit Wachstumsfaktor reduzierte gelatinösen Proteingemisch, B27 ohne Insulin und 100 ng / ml Activin A; Kultur die Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C für 24 Std.
- Ersetzen des Mediums mit RPMI1640-Medium, das ohne Insulin mit B27 ergänzt wurde, 10 ng / ml bone morphogenic protein 4 (BMP-4) und 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF); Kultur die Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C für 96 Stunden.
- Ersetzen Sie das Medium mit RPMI1640 - Medium mit B27 ergänzt und weiter Kultur der Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C; erfrischen alle 3 Tage das Medium.
- Beobachten Cluster von Zellen unter dem Mikroskop ~ 3 Tage nach Beginn der Differenzierung zieht. Sammeln Sie die Cluster ~ 7 Tage nach der ersten Kontraktionen und waschen Sie sie in Hanks Balanced Salt Solution Beobachtung.
- Distanzieren der geclusterten-Zellen in der Platte, indem sie in Hanks-Puffer Inkubation für 10 min bei 37 ° C, die 100 U / ml Kollagenase IV unter leichtem Schütteln; Dann wird für 5 min 0,25% Trypsin in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzuzufügen.
- Neutralisieren der Enzymlösung mit 10% fötalem Rinderserum in RPMI / B27-Medium und dann Resuspendieren der Zellen in RPMI / B27 Medium.
- Zähle die Anzahl der Zellen durch Hämocytometer. Kultur die Zellen auf 10 cm - Schalen bei 5% CO 2 und 37 ° C für mindestens 3 Stunden, die die nicht-Kardiomyozyten - Zellen an die Oberfläche der Kulturschale anhaften können.
- Sammeln Sie die Zellsuspension, die die hiPSC-CMs enthält, und halten Sie die Zellen (etwa 1 x 10 6 Zellen pro 10 cm Schale) , indem sie auf einer gallertartigen Proteinmischung -beschichteten Oberfläche kultiviert werden .
2. Differenziert hiPSCs in hiPSC-ECs
- Distanzieren die hiPSC Bevölkerung in einzelne Zellen durch Inkubation them mit Mittel bei 5% CO 2 und 37 ° C für 5 min chelatisierenden. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit frischem mTeSR1 Medium.
- Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min. Resuspendieren der Zellen in mTeSR1 Medium, das mit 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.
- In 250 ul 20 NIH-Einheiten / ml Thrombin-Lösung auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- 1 x 10 6 hiPSCs bis 250 & mgr; l einer 12,5 mg / ml Fibrinogen - Lösung. Und fügen Sie die 250 ul zellhaltigen Fibrinogenlösung auf die Thrombin-geladen gut. Beachten Sie die Mischung verfestigen, um ein hiPSC haltigen Fibrin Gerüst innerhalb min zu bilden.
- Übertragen die verfestigten, zellhaltigen Gerüste in die Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit den Deckglaspinzetten und Differenzierung einzuleiten durch Kultivieren der Gerüste in 2 ml EBM2 Medium, ergänzt mit 2% B27 ohne Insulin, Activin-A (50 ng / ml) und BMP-4 (25 ng / ml) für 24 h bei 5% CO
- Ersetzen Sie das Medium vorsichtig das alte Medium über Vakuum saugt, ohne die Zellen zu berühren. Hinzufügen neuer EBM2 Medium, supplementiert mit B27 ohne Insulin, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, 50 ng / ml), Erythropoietin (EPO, 100 ng / ml) und transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1, 10 ng / ml), und die Kultur, die Gerüste bei 5% CO 2 und 37 ° C für 48 Stunden.
- Aktualisieren Sie die mittlere und Kultur die Gerüste bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 48 h; Dann lassen Sie die Zellen aus dem Gerüst durch Zugabe von 200 U Kollagenase IV (100 U / ml) zum Medium.
- Spin down die Zellen, nachdem sie freigegeben werden. Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml EGM2-MV-Medium mit 2% der B27 ergänzt, VEGF-A (50 ng / ml) und SB-431542 (10 & mgr; M); aktualisieren alle zwei Tage das Medium.
- Etwa 10 Tage später (dh auf ~ 14. Tag nach der Differenzierung initiiert wurde), distanzieren die Zellen mit 100 U / ml Kollagenase IV, isolieren hiPS-ECs aus der Population von differenzierten Zellen über Durchflusszytometrie analysiert für die Expression von EC-spezifischen Markerproteine (zB CD31, CD144) 3.
- Erweitern Sie den isolierten hiPSC-ECs über ein etabliertes Protokoll 3.
3. Differenziert hiPSCs in hiPSC-SMCs
- Samen der hiPSCs auf Platten, die die Zellen in mTeSR1 Medium bei 5% CO 2 und 37 ° C, mit täglicher Mediumwechsel, bis zur Konfluenz (~ 2 Tage) mit gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur beschichtet wurden.
- Initiieren Differenzierung in mesodermalen Abstammungslinien-Zellen durch Kultivieren der Zellen mit CHIR99021 (5 uM) und BMP-4 (10 ng / ml) in RPMI1640-Medium und 2% B27 plus Insulin für 3 Tage.
- HiPSC-SMCs mit überwiegend synthetischen Phänotyp zu erzeugen:
- Kultur der Zellen mit VEGF-A (25 ng / ml), Fibroblasten-Wachstumsfaktor-β (FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me dium und 2% B27 minus Insulins bei 5% CO 2 und 37 ° C für 4 Tage.
- Kultur der Zellen in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 - Medium und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO 2 und 37 ° C für 2 Tage.
- Kultur der Zellen in platelet-derived growth factor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF & bgr; (3 ng / ml) in RPMI - 1640 und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO 2 und 37 ° C für 4 Tage.
- HiPSC-SMCs mit überwiegend Kontraktions Phänotyp zu erzeugen:
- Kultur die Zellen für 4 Tage mit VEGF-A (25 ng / ml) und FGFβ (5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 minus Insulin.
- Kultur die Zellen für 7 Tage mit PDGFβ (5 ng / ml) und TGF & bgr; (2,5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 plus Insulin.
- Reinige den endgültigen hiPSC-SMC-Populationen, indem die Zellen in Lactat-Kultivierung (4 mM) RPMI1640 Stoffwechselmedium für ~ 6 Tage enthält.
- Olivenöl erhitzen auf 45 ° C in einem Wasserbad.
- Wärme 5 ml 10% igen Gelatinelösung auf 50 ° C.
- Fügen Sie die Gelatine zu dem Olivenöl, rühren, und dann schnell abkühlen bis 5 ° C durch das Eis in das Wasserbad Zugabe.
- Fünfundzwanzig Minuten später hinzuzufügen gekühlt (4 ° C) Aceton zu dem Olivenöl Mikrokügelchens Bildung zu induzieren.
- Man hält die Temperatur bei 5 ° C für 1 Stunde; Dann sammeln Sie die Microspheres, sie 5-mal mit vorgekühltem Aceton waschen das Olivenöl, und lassen Sie sie an der Luft trocknen bei 4 ° C zu entfernen.
- Resuspendieren der Mikrokügelchen in einer Lösung aus 70% Ethanol und 0,25% Glutaraldehyd über Nacht bei 4 ° C eine Vernetzung zu induzieren, und dann die Mischung mit 100 mM Glycin zu neutralisieren.
- Last IGF in die Mikrokügelchen durch Mischen von 5 mg Mikrosphären mit 15 & mgr; l destilliertem H 2 O , enthaltend 5 & mgr; g IGF und 0,1% Rinderserumalbumin für 30 min.
5. Erstellen der Patch über der Stelle der Verletzung und die Injektion der Zellen
- Hängen Sie den hiPSC abgeleiteten CMs (2 Millionen), SMCs (1 Million) und ECs (1 Million) zusammen in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Suspend 5 mg Mikrokügelchen in 1 ml Fibrinogen-Lösung (25 mg / ml).
- Füllen einer Spritze mit der zellhaltigen Lösung, eine andere Spritze mit der Fibrinogen / Mikrokügelchen - Lösung und eine dritte Spritze mit 1 ml Thrombinlösung (80 NIH Einheiten / ml, ergänzt mit 2 & mgr; l 400 mM CaCl 2 und 200 mM ε-Aminocapronsäure Acid).
- Chirurgisch Myokardinfarkt bei Schweinen Herz über Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie induzieren , wie vor 2 beschrieben.
HINWEIS: Kurz gesagt, weibliche Yorkshire Schweine (~ 13 kg, 45 Tage alt) mit intramuskuläre Injektion von Telazol / Xylazin sediert sind (4,4 mg / kg) und unter Vollnarkose mit Isofluran (0,5-5%) intubiert. A 4 th intercostal Thorakotomie Koronararterie vorderen absteigenden ausgeführt und links ausgesetzt ist. Die Koronararterie wird durch eine Ligatur für 60 min okkludiert und dann wird die Ligatur entfernt. Sofortige elektrische Defibrillation wird im Fall von ventrikulärer Fibrillation durchgeführt. - Positionieren Sie einen sterilen Kunststoffring (~ 2,5 cm) auf dem Epikard des Infarktregion Schweineherzen, und dann zu injizieren gleichzeitig die Mikrokügelchen / Fibrinogen und Thrombin-Lösungen in den Ring.
- Lassen Sie die Mischung (~ 30 sec) zu verfestigen, und dann legen Sie die Nadel der zellhaltigen Spritze durch die verfestigte Mischung in das Infarkt Myokard und injizieren die Zellen. Schließen Sie die Muskelschichten, Unterhautgewebe, und der Brustwand mit 3-0 oder 2-0 Monocryl Naht je nach Tiergröße. Buprenorphin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulär alle 8 Stunden verwendet werden, um Schmerzen für die ersten 3 Tage nach der Operation zu steuern.
- Bewerten Sie die Herzfunktion eines Herz mittels magnetischer Resonanzimaging (MRI) vor dem chirurgischen Eingriff, einer Woche und vier Wochen nach der chirurgischen Prozedur 2, 3, 4. Nach dem abschließenden MRT - Studien, opfern , um das Tier und verarbeiten ihre Herzen für die Histologie und molekulare Analyse 2, 3, 4.
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Representative Results
Charakterisierung von Differentiated hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs
Die differentielle Kapazität von hiPSCs 2 wurden ausgewertet, 3, 4. Durchflusszytometrie analysiert des kardialen Troponin T (cTnT) Ausdruck deuten darauf hin , dass die Reinheit des endgültigen hiPSC-CM Bevölkerung 90% überschreiten kann (Abbildung 1A, 1B, Panel B1). Fast alle der Zellen langsam Myosin schwere Kette exprimiert (Abbildung 1B, Tafel A1), α-sarcomeric Aktin (1B, Tafel A2), während etwa 25% der 2v Isoform von Myosin Light Chain (MLC2v) (Abbildung 1B, ausgedrückt Panel B2), die nur in ventrikulären CMs 4 gefunden wurde. Die Effizienz des hiPSC-EC Differenzierungsprotokoll (dh der Prozentsatz an CD31 + Zellen) substantially höher , wenn sie mit hiPSCs vom GRIPS Linie (45,6%, 1C, Panel - C2) als mit PCBC16iPS Zellen (31,3%, 1C, Platte D2) durchgeführt wird ; Populationen von> 95% Reinheit wurden durch Selektion auf CD31 Expression erreicht, und> 90% der ausgewählten Zellen fortgesetzt CD31 oder CD144 für bis zu 4 Wochen, wenn sie in EGM2-MV-Medium (ohne FBS) ergänzt mit B27, VEGF, zum Ausdruck bringen und SB431542 (1D) 3. Mehr als 94% des gereinigten hiPSC-SMCs ausgedrückt Glattmuskelaktin (SMA), aber synthetische hiPSC-SMCs wurden eher als Kontraktions hiPSC-SMCs Kollagen 1, Connexin 43 oder Vimentin (Abbildung 1E) zum Ausdruck bringen. Die Migration und Proliferation Fähigkeit von hiPSC-SMCs wurden 4 bewertet. Synthetische hiPSC-SMCs waren auch Migration und Proliferation als Kontraktions hiPSC-SMCs (1F, Platten i und ii), während die Kontraktions SMCs kontrahierten i stärkern Reaktion auf Carbachol - Behandlung (1F, Paneele iii, iv und v).
Growth-Faktor-Freisetzung aus Gelatine Microspheres
ELISA - Messungen von IGF-1 - Konzentrationen im Medium von kultivierten, zellfreien Pflaster zeigten , dass der Wachstumsfaktor aus den Mikrokügelchen über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen freigelassen wurde (2A) 2. Die Analysen wurden durch Laden 5 mg IGF-enthaltenden Mikrokügelchen mit 5 & mgr; g IGF-1 durchgeführt. Ein Patch wurde erzeugt, indem die Mikrokügelchen mit 1 ml Fibrinogen-Lösung und 1 ml Thrombin mischt. Der Patch wurde kultiviert in 2 ml MEM. Ein ml des Mediums wurden gesammelt und durch 1 ml frisches MEM pro Tag (2B). Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt.
Beobachtungen aus einer IR-Verletzung Modell
2 untersucht worden. Insgesamt 6 Millionen hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs (2 Millionen jeder Zelltyp) wurden direkt in den geschädigten Herzgewebe injiziert. Für Tiere in der Zelle + Patch-Gruppe, ein Pflaster, bestehend aus Fibrin und IGF-1 enthaltenden Mikrokügelchen wurde über der Verletzungsstelle vor der Injektion erzeugt, während die Tiere in der Zellengruppe mit der gleichen Zell Dosis behandelt wurden, aber ohne die Patch; Beide Behandlungen wurden von Tieren in der MI-Gruppe zurückgehalten. Vier Wochen nach der Verletzung und Behandlung, 9% der zu den Tieren gelieferten Zellen in der Zelle + Patch - Gruppe wurden beibehalten und weiterhin an der Stelle der Verwaltung , um zu überleben, im Vergleich zu nur 4% der auf Tiere in der Zellgruppe verabreichten Zellen (Abbildung 3A). Behandlung mit sowohl den Zellen und dem Patch, aber nicht mit den Zellen allein, war auch AssociATED mit signifikanten Verbesserungen in Messungen der Herzfunktion und die Infarktgröße (3B).
Abbildung 1: Die Differenzierung der hiPSCs in Kardiomyozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen. Kardiomyozyten Differenzierung und die Reinheit des hiPSC-CMs wurden mittels Durchflusszytometrie (A) und Histologie mit verschiedenen Herzmarker (B) bewertet. Die Differenzierung der endothelialen hiPSC wurde mit Durchflusszytometrie (C) bestimmt. Die Wartung des endothelialen Phänotyp hiPSC-ECs wurde durch die Analyse der Expression von CD31 und CD144 auf 2, 3 und 4 Wochen nach der Reinigung mittels Durchflusszytometrie (D) bewertet. Die glatte Muskulatur der Zelldifferenzierung von hiPSC wurde von verschiedenen Markern (E) gemessen. Und die Migration und Proliferation Potenzialsynthetischen glatten Muskelzellen vs. Kontraktions glatten Muskulatur von hiPSCs abgeleiteten Zellen beurteilt wurde (F). Die Kerne wurden mit DAPI in der Immunfluoreszenzanfärbung counterstained. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m in (B) und 200 um (E und F). Die Migration und Proliferation Fähigkeit von synthetischen hiPSC-SMCs wurden ausgewertet (F, Panel-i und ii). Und Kontraktion der Kontraktions SMCs als Reaktion auf Carbachol Behandlung wurde beurteilt (F, Panel III-V). * P <0,05, synthetische hiPSC-SMCs vs. Kontraktions hiPSC-SMCs. A und B wurden aus Ye L modifiziert, et al. 2. C und D wurden aus Zhang S modifiziert, et al. 3. E und F wurden von Yang L modifiziert, et al. 4. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Vergleich zwischen den beiden Gruppen wurde über den Student-T-Test ausgewertet, und den Vergleich zwischen mehreren Gruppen wurde durch Einweg-ANOVA bewertet. p <0,05 wurde als signifi betrachtetkippen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Mikrokügelchen. IGF-enthaltenden Mikrokügelchen wurde synthetisiert (A). IGF-1 - Freisetzung aus Mikrokügelchen wurde gemessen bei 1, 3, 5 und 7 Tage , nachdem sie synthetisiert wurden (B). Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Panel A wurde von Ye L. modifiziert, et al. 2. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Bewertung der Effizienz der Zelltherapie mit hiPSC abgeleiteten trilineage cells. Die Gesamttransplantationsrate für die drei Zellpopulation wurde 4 Wochen nach Zelltransplantation (A) bewertet. Herzfunktion (wie durch Ejektionsfraktion angegeben) und Infarktgröße wurden durch kardiale MRI nach 1 und 4 Wochen nach der Zelltransplantation (B) bewertet. * P <0,05 gegenüber MI; #p <0,05 gegenüber Flecken. A und B wurden aus Ye L. modifiziert, et al. 2. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden für die Bedeutung mit one-way ANOVA analysiert. p <0,05 wurde als signifikant angesehen. Ergebnisse als signifikant über ANOVA identifiziert wurden mit dem Tukey-Korrektur erneut analysiert.
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Discussion
Verbesserte Ausbeute / Reinheit von hiPSC-CMs
Herkömmliche Protokolle für die oft menschliche Stammzellen in CMs Differenzierung durch eine geringe Ausbeute und Reinheit begrenzt; zum Beispiel erhalten nur 35-66% der hESC-CMs über Percoll Trennung und Herzkörperbildung langsam Myosin schwere Kette oder cTnT 6 ausgedrückt. Die Reinheit von differenzierten hiPSC-CM - Populationen im wesentlichen durch die Auswahl für die Expression eines Reportergens erhöht werden, die dem Promotor eines CM-spezifische Protein - 7, 8, 9, aber diese Technik notwendigerweise die Verwendung von gentechnisch veränderten erfordert verbunden ist Zellen, die weniger wünschenswert sind, besonders für klinische Prüfungen. Mit dem Protokoll hier vorgestellten 68% des hiPSC-CMs ausgedrückt cTnT, und die Reinheit wurde anschließend erhöht auf> 90% über Mikro-Dissektion und Vorabscheidungs ohne genetische Manipulation oder einzelne-cell Auswahl. Die Gesamtausbeute betrug ~ 3,5 Millionen hiPSC-CMs pro Vertiefung.
Verbesserte Rendite / Stabilität von hiPSC-ECs
Die beiden am häufigsten verwendeten hiPSC-EC Differenzierungsprotokolle basieren auf Co-Kultivierung mit murinen Stromazellen 10, 11 und embryonalen Körperbildung 12, 13. Allerdings könnte die Co-Kultivierungsverfahren zu xenogenen Kontamination mit Maus-Linie Zellen oder Proteine 10, Blei und nur ~ 15% oder weniger der über den embryonalen Körper Verfahren hergestellten Zellen nehmen eine EC - Phänotyp 10, 12, 13. Die hiPSC-EC Differenzierung Protokoll hier vorgestellten eliminiert das Risiko von xenogenen Kontamination und kann bis zu 3-mal effizienter als die Methoden, die verwendet werden embryonale Körper (je nachdem, welche hiPSC Leitung verwendet wird) sein. Furthermore nach Reinigung mittels Selektion auf CD31 - Expression, ~ 90% der hiPSC-ECs gehalten , um die EG - Phänotyp für mindestens 4 Wochen in vitro, im Vergleich zu nur zwei Wochen bei hiPSC-ECs über Protokolle herkömmliche die Differenzierung 12 erzeugt werden.
Die phänotypische Spezifikation von hiPSC-SMCs
Der Phänotyp einer SMC (oder eine Population von SMCs) ist vielleicht am besten als ein Gleichgewicht zwischen beschrieben überwiegend Kontraktions und synthetischen Eigenschaften, die zu erheblichen Unterschiede in der Morphologie, Marker-Expression und Aktivität führen kann. Somit kann die Brauchbarkeit von hiPSC-SMCs für eine bestimmte Anwendung, hängt von den spezifischen Phänotyp erzeugt wird. Die hiPSC-SMC Differenzierung und Reinigungsprotokolle präsentiert werden, gehören die erste überwiegend Kontraktions oder synthetische SMC Populationen zu produzieren, die ~ 95% rein sind in nur 2-3 Wochen, und das Risiko von xenogenen Kontamination ist minimal, da die Verfahren nicht requ tunire die Verwendung von Feeder-Zellen.
Verbesserte Transplantationsrate von transplantierten Zellen
Einer der Haupthindernisse effektive Zelltherapie wird angenommen , dass die extrem niedrige Anzahl von Zellen verabreicht werden , die 14, 15 durch das Myokard gepfropft sind, 16, 17. Cytokine wie IGF-1 kann Verpflanzung verbessern , indem die Zellen ermöglicht , die toxische Mikro in ischämischen Geweben 18, 19, 20 besser zu widerstehen, aber die hohen Drücke während der Kontraktion induziert wird, kann die Zellen verdrängen durch die Nadelbahn und in die periphere Zirkulation. Somit ist die wesentlich höhere Rate der Verpflanzung durch Injizieren der Zellen durch einen IGF-1 enthaltenden Fibrin Patch erreicht, was mehr war als 2-fach größer ist als die Rate beobachtet, wenn die same Zell Dosis wurde ohne das Pflaster verabreicht werden, können wahrscheinlich sowohl die zytoprotektive Wirkung von IGF-1 und an den Patch selbst, die eine physische Barriere gebildet zurückzuführen, dass die Zellen, die aus in den Raum ausgestoßen epikardialen verhindert wird.
Kritische Schritte
Um die Pluripotenz der hiPS Zellen zu gewährleisten, ist es notwendig , den Karyotyp der hiPSC Linie vor der Differenzierung zu prüfen, bestimmen die Expression von Pluripotenz Marker (Nanog, SSEA1 und Oct4, et al.), Und bestätigen ihre Fähigkeit zur Teratom Bildung . Es wird vorgeschlagen, ihre Pluripotenz erneut zu prüfen, wenn hiPSC Linien sind seit mehr als 10 Generationen agiert worden. Der Status von undifferenzierten hiPSC ist auch entscheidend für die korrekte Differenzierung. Um den Status des hiPSC vor der Einleitung der Differenzierung zu gewährleisten, wird empfohlen: 1) verwenden frisches Medium (weniger als zwei Wochen alt), und aktualisieren Sie das Medium täglich vor Beginn der hiPSC differentiatIon; 2) reduzieren die enzymatische Verdauung Zeit (weniger als 5 min), und sanft Pipette nach oben und unten die Zellen die unnötige Schädigung der Zellen zu verhindern; 3) Ausstrich die Zellen in einer Dichte 1 x 10 5 Zellen pro Well der 6-well - Platte; 4) halten immer die Zellen in 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator, und vermeiden Sie die Zellen aus dem Inkubator zu halten länger als 15 min.
Einschränkungen der Technik
Der Hauptnachteil unserer Methode zum Kombinieren injiziert hiPSC abgeleiteten Herzzellen und Patch-Verwaltung ist die Voraussetzung für die offene Brust-Chirurgie; Somit ist dieser Ansatz wahrscheinlich nicht direkt an klinischen Anwendungen außer als Zusatztherapie bei Patienten übersetzbar sein, die gleichzeitige koronare Revaskularisation Chirurgie durchlaufen. Mehr breite klinische Anwendung wird die Entwicklung eines praktischen und minimal-invasive Lieferung Methode, wie ein Endoskop- und katheterbasierten Ansatz erfordern, dass der Zugang könntedas Herz durch den Bauch und Zwerchfell. Weiterhin ist eine der kritischsten Sicherheitsbedenken mit kardialen Zelltherapie verbunden ist , ist die Entwicklung von arrhythmogenen Komplikationen und bei Affen , die mit intramyokardiale Injektion von 1 Milliarde hES-abgeleitete CMs behandelt wurden, alle vier der Tiere entwickelten spontane Arrhythmien 21. Wir beobachteten jedoch keine Hinweise auf arrhythmogenic Komplikationen bei 10 Millionen hiPSC abgeleitete CMs in die Herzen von Schweinen mit IR - Verletzung 2 injiziert wurden, vielleicht , weil die Zelle Dosis war 100-fach kleiner.
Zukünftige Anwendungen oder Wegbeschreibungen
Immunabstoßung wahrscheinlich spielt eine wichtige Rolle für die niedrige Transplantationsrate. Der CRISPR / Cas-Gen Editing-System kann den Forschern ermöglichen, durch Knock-out (KO) Major Histocompatibility Complex (MHC) der Klasse I und II eine Reihe von "Universalspender" hiPSCs zu erstellen. Die hiPSC MHC KO-abgeleiteten Zellen und Geweben have wesentlich höhere Raten von Verpflanzung. Als Techniken zu verbessern, sind Verpflanzung Raten wahrscheinlich zunehmen. Zu bestimmten Punkt der Erhöhung der Graft-Größe wird die große Transplantat erwartet, dass die arrhythmogenicity des Empfängers Herz zu erhöhen. Die Reduktion von Transplantaten assoziiert arrhythmogenicity könnte durch Verwendung von Zellen mit einer Zunahme von gap junction-Proteine die Expression von dem Gen Editing-Technologie erreicht werden.
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Disclosures
Keiner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
