Summary
Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.
Abstract
Le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) devono essere completamente in tipi cellulari specifici prima della somministrazione, ma i protocolli convenzionali per differenziare hiPSCs in cardiomiociti (hiPSC-CMS), cellule endoteliali (hiPSC-ECS), e cellule muscolari lisce (SMC) sono spesso limitata dalla bassa resa, la purezza, e / o di scarsa stabilità fenotipica. Qui, presentiamo protocolli innovativi per generare hiPSC-CM, -ECs e -SMCs sostanzialmente più efficiente rispetto ai metodi convenzionali, come pure un metodo per combinare iniezione di cellule con una patch citochina contenente creato sul sito di somministrazione. La patch migliora sia la conservazione delle cellule iniettate, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule vengano spremuto fuori del miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo prolungato. In un modello suino di infarto del danno da ischemia-riperfusione, il tasso di attecchimento è stato più di due volte maggiore quando lacellule sono state somministrate con la patch citochina contenente confronto alle cellule senza patch, e il trattamento con entrambe le celle e la patch, ma non solo con le cellule, è stato associato a miglioramenti significativi nella funzione cardiaca e dimensioni dell'infarto.
Introduction
cellule staminali pluripotenti umane indotta (hiPSCs) sono tra gli agenti più promettenti per la terapia cellulare rigenerativa perché possono essere differenziati in una gamma potenzialmente illimitato e quantità di cellule che non sono rifiutato dal sistema immunitario del paziente. Tuttavia, la loro capacità di auto-replicazione e differenziazione può anche portare alla formazione di tumori e, di conseguenza, hiPSCs bisogno di essere completamente differenziate in tipi cellulari specifici, come i cardiomiociti (CMS), cellule endoteliali (ECS), e le cellule muscolari lisce (SMC ), prima della somministrazione. Uno dei metodi più semplici e più comuni di somministrazione delle cellule è iniezione intramiocardico diretta, ma il numero di cellule trapiantate che sono innestato dal tessuto miocardico nativo è eccezionalmente bassa. Gran parte di questo attrito può essere attribuito per l'ambiente citotossico del tessuto ischemico; tuttavia, quando le cellule staminali embrionali murine (CES) sono state iniettate direttamente nel miocardio di cuori illesi, oolo ~ 40% dei 5 milioni di cellule consegnati sono stati conservati per 3-5 ore 1, il che suggerisce che una parte sostanziale delle cellule somministrate usciti dal sito di somministrazione, forse perché sono stati espulsi attraverso il percorso dell'ago dalle alte pressioni prodotte durante contrazione del miocardio.
Qui, vi presentiamo nuovi metodi e sostanzialmente più efficienti per la generazione di cardiomiociti hiPSC-derivati (hiPSC-CMS) 2, le cellule endoteliali (hiPSC-ECS) 3, e cellule muscolari lisce (SMC) 4. In particolare, questo protocollo hiPSC-SMC è il primo a simulare la vasta gamma di caratteristiche morfologiche e funzionali osservate in somatica SMCs 5 indirizzando le cellule verso un fenotipo prevalentemente sintetico o contrattile SMC. Forniamo anche un metodo di consegna cellula che migliora il tasso di attecchimento di cellule iniettate creando una citochina contenente fibrina pATCH sul sito di iniezione. Il cerotto sembra migliorare sia la ritenzione cellulare, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule dalla esistente miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo di almeno tre giorni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con le linee guida animali della University of Alabama a Birmingham.
1. Differenziazione hiPSCs in hiPSC-CMS
- Cappotto dei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con pre-raffreddata fattore di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa a 4 ° C per tutta la notte. Aspirare miscela proteica gelatinosa prima dell'uso. Seed i hiPSCs sulle piastre pre-verniciato, e la cultura nelle cellule (1 x 10 5 cellule per pozzetto) al 5% di CO 2 e 37 ° C in mTeSR1 supplemento mezzo con inibitore ROCK 10 micron.
- Aggiornare la media giornaliera fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza; poi, aggiungere fattore di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa al mezzo (miscela 0,5 mg gelatinosa proteine per 6 pozzetti, 2 ml di mezzo per pozzetto), e la cultura le cellule per 5% di CO 2 e 37 ° C altri due giorni.
- Per sostituire il mezzo, delicatamente succhiare il mezzo dalla capsula di Petri con sottovuotoout toccare le cellule, e aggiungere nuovo mezzo utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Avviare differenziazione sostituendo il mezzo con il mezzo RPMI1640 supplementato con fattori di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa, B27 senza insulina, e 100 ng / ml Activin A; cultura le cellule a 5% di CO 2 e 37 ° C per 24 ore.
- Sostituire il mezzo con il mezzo RPMI1640 che è stato integrato con B27 senza insulina, 10 ng / ml proteina ossea morfogenetica 4 (BMP-4), e 10 Fattore ng / ml base di crescita dei fibroblasti (bFGF); cultura le cellule a 5% di CO 2 e 37 ° C per 96 ore.
- Sostituire il supporto con il mezzo RPMI1640 integrato con B27 e continuare la cultura le cellule a 5% di CO 2 e 37 ° C; aggiornare il mezzo ogni 3 giorni.
- Osservare gruppi di contrarre le cellule sotto il microscopio ~ 3 giorni dopo l'inizio della differenziazione. Raccogliere i cluster ~ 7 giorni dopo la prima osservazione contrazioni e lavarli in Hanks soluzione salina bilanciata.
- Dissociare il cellule raggruppate nella piastra incubandoli in tampone Hanks contenente 100 U / ml di collagenasi IV per 10 min a 37 ° C con delicata agitazione; quindi, aggiungere 0,25% tripsina in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 5 min.
- Neutralizzare soluzione enzimatica con il 10% di siero fetale bovino in RPMI medio / B27 e risospendere le cellule in medium / B27 RPMI.
- Contare il numero di cellule emocitometro. Culture cellule sui piatti 10 cm al 5% di CO 2 e 37 ° C per almeno 3 ore, che consentano alle cellule non cardiomiociti ad aderire alla superficie del piatto cultura.
- Raccogliere la sospensione cellulare, che contiene il hiPSC-CM, e mantenere le cellule (circa 1 x 10 6 cellule per 10 cm Piatto) da essi coltura su una superficie Rivestiti miscela proteica gelatinosa.
2. Differenziare hiPSCs in hiPSC-EC
- Dissociare la popolazione hiPSC in singole cellule incubando °em con chelanti agente al 5% di CO 2 e 37 ° C per 5 min. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente mezzo mTeSR1 fresco.
- Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno mTeSR1 integrato con inibitore ROCK 10 micron. Determinare la densità cellulare con un emocitometro.
- Aggiungere 250 ml di 20 unità NIH / ml soluzione di trombina ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere 1 x 10 6 hiPSCs a 250 microlitri di una / soluzione di fibrinogeno ml 12,5 mg. E aggiungere i 250 ml di soluzione di fibrinogeno cella contenente la trombina-caricato bene. Osservare la miscela solidificare per formare una impalcatura di fibrina hiPSC contenenti all'interno di min.
- Trasferire i, ponteggi cellule contenenti solidificati nei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con la pinza di vetro di copertura, e avviare la differenziazione coltivando i ponteggi in 2 ml di mezzo EBM2 integrato con il 2% B27 senza insulina, activin-A (50 ng / ml), e BMP-4 (25 ng / ml) per 24 ore a 5% CO
- Sostituire il mezzo attraverso delicatamente succhiando il mezzo di vecchia via del vuoto senza toccare le cellule. Aggiungere nuovo mezzo EBM2 integrato con B27 senza insulina, fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF, 50 ng / ml), eritropoietina (EPO, 100 ng / ml), e trasformando β1 fattore di crescita (TGFβ1, 10 ng / ml), e la cultura ponteggi a 5% di CO 2 e 37 ° C per 48 ore.
- Aggiornare medio e coltura scaffold al 5% di CO 2 e 37 ° C per altre 48 ore; quindi, rilasciare le cellule dal scaffold aggiungendo 200 U collagenasi IV (100 U / ml) al mezzo.
- Spin giù le cellule dopo che sono stati rilasciati. Sostituire il mezzo con 2 ml di mezzo EGM2-MV supplementato con 2% di B27, VEGF-A (50 ng / ml), e SB-431.542 (10 mM); aggiornare il mezzo ogni due giorni.
- Circa 10 giorni dopo (cioè, il ~ 14 ° giorno dopo la differenziazione stato avviato), dissociare le cellule con 100 U / ml di collagenasi IV, isolare hiPSC-EC dalla popolazione di cellule differenziate tramite citometria a flusso analizza per l'espressione di EC-specifiche proteine marker (ad esempio, CD31, CD144) 3.
- Espandere l'isolato hiPSC-EC tramite un protocollo stabilito 3.
3. Differenziare hiPSCs in hiPSC-SMC
- Seed i hiPSCs su piatti che sono stati rivestiti con miscela proteica gelatinosa, e la cultura nelle cellule in terreno mTeSR1 al 5% di CO 2 e 37 ° C, con variazioni medie giornaliere, fino confluenti (~ 2 giorni).
- Avviare differenziazione in cellule mesodermal lineage-coltivando le cellule con CHIR99021 (5 mM) e BMP-4 (10 ng / ml) in terreno RPMI1640 e 2% B27 più insulina per 3 giorni.
- Per produrre hiPSC-SMC con un fenotipo prevalentemente sintetico:
- Cultura le cellule con VEGF-A (25 ng / ml), fattore di crescita dei fibroblasti (β FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me dium e 2% B27 meno insulina al 5% di CO 2 e 37 ° C per 4 giorni.
- Cultura le cellule in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in terreno RPMI1640 e 2% B27 più insulina al 5% di CO 2 e 37 ° C per 2 giorni.
- Cultura le cellule β fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ (3 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 più insulina al 5% di CO 2 e 37 ° C per 4 giorni.
- Per produrre hiPSC-SMC con un fenotipo prevalentemente contrattile:
- Cultura le cellule per 4 giorni con VEGF-A (25 ng / ml) e FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 meno insulina.
- Cultura le cellule per 7 giorni con PDGFβ (5 ng / ml) e TGFβ (2,5 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 più insulina.
- Purificare le popolazioni finali hiPSC-SMC coltivando le cellule in lattato (4 mm) contenente RPMI1640 medio metabolica per ~ 6 giorni.
- olive calore olio a 45 ° C in un bagno d'acqua.
- Calore 5 ml di soluzione di gelatina al 10% a 50 ° C.
- Aggiungere la gelatina per l'olio d'oliva, mescolare, e poi rapidamente raffreddare a 5 ° C aggiungendo ghiaccio bagnomaria.
- Venticinque minuti dopo, aggiungere refrigerata (4 ° C) acetone per l'olio di indurre la formazione microsfere.
- Mantenere la temperatura a 5 ° C per 1 ora; poi, raccogliere le microsfere, lavarli 5 volte con acetone pre-raffreddata a rimuovere l'olio d'oliva, e lasciarli asciugare a 4 ° C.
- Risospendere le microsfere in una soluzione di etanolo al 70% e lo 0,25% glutaraldeide notte a 4 ° C per indurre reticolazione e quindi neutralizzare la miscela con 100 mM glicina.
- Carico IGF nelle microsfere miscelando 5 mg microsfere con 15 microlitri distillata H 2 O contenente 5 mg IGF e lo 0,1% di albumina sierica bovina per 30 min.
5. Creare la patch sul sito di lesione e l'iniezione delle Cellule
- Sospendere il hiPSC di derivazione CM (2 milioni), SMC (1 milione), e ECS (1 milione) insieme in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
- Sospendere 5 mg di microsfere in 1 ml di soluzione di fibrinogeno (25 mg / ml).
- Riempire una siringa con la soluzione di cellule contenente, un'altra siringa con la soluzione di fibrinogeno / microsfere, e una terza siringa con 1 ml di soluzione di trombina (80 unità NIH / ml, integrati con 2 microlitri 400 mM CaCl 2 e 200 mM ε-aminocaproic acido).
- Chirurgicamente indurre infarto del miocardio nel cuore suina tramite legatura delle discendente anteriore dell'arteria coronaria come descritto in precedenza 2.
NOTA: In breve, femmina Yorkshire suina (~ 13 kg, 45 giorni di età) sono sedati con l'iniezione intramuscolare di Telazol / xylazina (4,4 mg / kg), e intubati in anestesia generale con isoflurano (0,5-5%). Un 4 ° interctoracotomia ostal viene eseguito e lasciato coronaria discendente anteriore è esposto. L'arteria coronarica è occlusa da una legatura per 60 minuti e poi la legatura viene rimosso. defibrillazione elettrica Immediatamente viene eseguita in caso di fibrillazione ventricolare. - Posizionare un anello di plastica sterile (~ 2,5 centimetri) sul epicardio della regione infartuata di cuori suini, e poi iniettare contemporaneamente le soluzioni microsfere / fibrinogeno e trombina sul ring.
- Lasciare la miscela a solidificare (~ 30 sec), e quindi inserire l'ago della siringa cella contenente attraverso la miscela solidificata nel miocardio infartuato e iniettare le cellule. Chiudere gli strati muscolari, il tessuto sottocutaneo, e la parete toracica con 3-0 o 2-0 monocryl sutura a seconda delle dimensioni degli animali. Buprenorfina 0,01-0,02 mg kg iniezione / intramuscolare ogni 8 ore sarà utilizzato per controllare il dolore per i primi 3 giorni dopo l'intervento.
- Valutare la funzione cardiaca utilizzando una risonanza magnetica cardiacaImaging (MRI) prima della procedura chirurgica, una settimana e quattro settimane dopo la procedura chirurgica 2, 3, 4. Dopo gli studi di risonanza magnetica finali, sacrificare l'animale ed elaborare i loro cuori per istologia e analisi molecolare 2, 3, 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caratterizzazione di differenziata hiPSC-CM, -ECs, e -SMCs
La capacità differenziale hiPSCs stati valutati 2, 3, 4. Flusso analizza citometria di T (cTnT) espressione troponina cardiaca suggeriscono che la purezza della popolazione finale hiPSC-CM può superare il 90% (Figura 1A, 1B, pannello B1). Quasi tutte le celle espresso lento miosina catena pesante (Figura 1B, pannello A1), α-sarcomerica actina (Figura 1B, pannello A2), mentre circa il 25% espresso l'isoforma 2v della catena leggera della miosina (MLC2v) (Figura 1B, pannello B2), che è stato trovato solo nel ventricolo CM 4. L'efficienza del protocollo differenziazione hiPSC-CE (cioè la percentuale di CD31 + cellule) era substantially superiore quando eseguita con hiPSCs della linea impugnature (45,6%, figura 1C, pannello C2) che con le cellule PCBC16iPS (31,3%, figura 1C, pannello D2); popolazioni di purezza> 95% sono stati ottenuti mediante selezione per l'espressione CD31, e> 90% delle cellule selezionate continuato ad esprimere CD31 o CD144 fino a 4 settimane quando coltivate in terreno EGM2-MV (senza FBS) supplementato con B27, VEGF, e SB431542 (Figura 1D) 3. Più del 94% del purificato hiPSC-SMC espresso actina del muscolo liscio (SMA), ma sintetico hiPSC-SMC sono stati più probabile rispetto contrattile hiPSC-SMC per esprimere collagene 1, connessina 43, o vimentina (Figura 1E). La capacità di migrazione e la proliferazione di hiPSC-SMC sono stati valutati 4. Sintetico hiPSC-SMC sono stati anche più migratoria e proliferativa rispetto contrattile hiPSC-SMC (Figura 1F, pannelli I e II), mentre SMC contrattili contratta più fortemente in risposta al trattamento carbacolo (Figura 1F, pannelli III, IV e V).
La crescita-fattore di rilascio da gelatina microsfere
Misurazioni ELISA di IGF-1 nel mezzo di patch coltivate, cellule libere indicato che il fattore di crescita è stato rilasciato dalle microsfere per un periodo di almeno 3 giorni (Figura 2A) 2. Le analisi sono state eseguite caricando 5 mg di microsfere IGF contenenti con 5 mg IGF-1. Una patch è stata generata miscelando le microsfere con 1 ml di soluzione di fibrinogeno e trombina 1 ml. Il cerotto è stato coltivato in 2 ml MEM. Un ml del mezzo è stato raccolto e sostituito con 1 ml di MEM fresco ogni giorno (Figura 2B). I dati sono stati presentati come media ± SEM.
Le osservazioni da un modello IR-infortunio
2. Un totale di 6 milioni di hiPSC-CM, -ECs, e -SMCs (2 milioni di ciascun tipo di cellula) sono state iniettate direttamente nel tessuto miocardico danneggiato. Per gli animali del gruppo CELL + Patch, un cerotto composto di fibrina e IGF-1 contenente microsfere è stata creata nel sito di lesione prima dell'iniezione, mentre gli animali del gruppo CELL sono stati trattati con la stessa dose cella, ma senza la patch; entrambi i trattamenti sono stati trattenuti da animali nel gruppo MI. Quattro settimane dopo la lesione e il trattamento, il 9% delle cellule consegnati animali nel gruppo CELL + Patch stati mantenuti e continuato per sopravvivere al sito di somministrazione, rispetto ad appena 4% delle cellule somministrate agli animali nel gruppo CELL (Figura 3A). Il trattamento con entrambe le celle e la patch, ma non con le sole cellule, sia associ ancheated con significativi miglioramenti nelle misure della funzione cardiaca e la dimensione infartuale (Figura 3B).
Figura 1: Differenziazione delle hiPSCs in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Differenziazione dei cardiomiociti e la purezza del hiPSC-CM sono stati valutati mediante citometria di flusso (A) e istologia con diversi marcatori cardiaci (B). La differenziazione endoteliale di hiPSC stata determinata con citometria di flusso (C). Il mantenimento del fenotipo endoteliale di hiPSC-EC è stata valutata mediante analisi della espressione di CD31 e CD144 a 2, 3, e 4 settimane dopo la purificazione mediante citometria di flusso (D). La differenziazione delle cellule muscolari lisce della hiPSC stata misurata con vari marcatori (E). E la migrazione e la proliferazione di potenzialecellule muscolari lisce sintetiche vs cellule muscolari lisce contrattili derivati da hiPSCs stata valutata (F). I nuclei sono stati di contrasto con DAPI nella colorazione immunofluorescenza. Barra di scala = 100 micron di (B) e 200 micron (E ed F). La capacità di migrazione e la proliferazione delle sintetica hiPSC-CML sono state valutate (F, pannello I e II). E contrazione SMCs contrattili in risposta al trattamento è stata valutata carbacolo (F, pannello iii-v). * P <0.05, sintetico hiPSC-SMC vs contrattile hiPSC-SMC. A e B sono stati modificati da Ye L, et al. 2. C e D sono stati modificati da Zhang S, et al. 3. E e F sono stati modificati da Yang L, et al. 4. I dati sono stati presentati come media ± errore standard della media (SEM). Confronto tra due gruppi è stata valutata attraverso il test T di Student, e il confronto tra più gruppi è stata valutata mediante ANOVA. p <0.05 è stato considerato signifisopraelevazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rilascio dei fattori di crescita da microsfere. IGF-contenente microsfere è stato sintetizzato (A). IGF-1 rilascio da microsfere è stata misurata a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo che sono stati sintetizzati (B). Barra di scala = 200 micron. Pannello A è stato modificato da Ye L., et al. 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della efficacia della terapia cellulare con cel trilineare hiPSC-derivatiLS. Il tasso di attecchimento generale per la popolazione tre cellule è stata valutata 4 settimane dopo il trapianto di cellule (A). La funzione cardiaca (come indicato dalla frazione di eiezione) e le dimensioni del miocardio sono stati valutati mediante risonanza magnetica cardiaca a 1 e 4 settimane dopo il trapianto di cellule (B). * P <0,05 rispetto MI; #p <0.05 vs Patch. A e B sono stati modificati da Ye L., et al. 2. I dati sono stati presentati come media ± SEM. I confronti tra i gruppi sono stati analizzati per la significatività con ANOVA. p <0.05 è stato considerato significativo. Risultati individuati come significativi tramite ANOVA sono stati rianalizzati con la correzione Tukey.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migliorata la resa / purezza di hiPSC-CMS
protocolli convenzionali per differenziare le cellule staminali umane in CM sono spesso limitati da una bassa resa e la purezza; per esempio, solo 35-66% di hESC-CM ottenuto tramite Percoll separazione e la formazione del corpo cardiaco espresso lento catena pesante della miosina o cTnT 6. La purezza delle popolazioni hiPSC-CM differenziate può essere sostanzialmente aumentata selezionando per l'espressione di un gene reporter che è stato collegato al promotore di una specifica-CM proteine 7, 8, 9, ma questa tecnica richiede necessariamente l'uso di organismi geneticamente modificati cellule, che sono meno desiderabile, in particolare per indagini cliniche. Con il protocollo presentato qui, il 68% del hiPSC-CMS espresso cTnT, e la purezza è stato successivamente aumentato a> 90% tramite micro-dissezione e preplating senza manipolazione genetica o singolaselezione -cell. Il rendimento totale è stato di 3,5 milioni ~ hiPSC-CMS per pozzetto.
Migliorata la resa / Stabilità di hiPSC-EC
I due protocolli di differenziazione più comunemente usati hiPSC-CE si basano su co-coltura con cellule murine stromali 10, 11 e formazione embrionale-corpo 12, 13. Tuttavia, il metodo di co-coltura potrebbe portare alla contaminazione xenogenica con cellule murine lignaggio o proteine 10, e solo ~ 15% o meno delle cellule prodotte tramite il metodo embrionale corpo assumere un fenotipo EC 10, 12, 13. Il protocollo di differenziazione hiPSC-CE qui presentato elimina il rischio di contaminazione xenogenico e può essere fino a 3 volte più efficiente rispetto ai metodi che utilizzano corpi embrionali (a seconda di quale linea hiPSC è utilizzata). Furthermminerale, dopo la purificazione attraverso la selezione per l'espressione CD31, ~ 90% del hiPSC-EC ha mantenuto il fenotipo CE per almeno 4 settimane in vitro, rispetto ad appena due settimane quando hiPSC-EC sono prodotti tramite i protocolli di differenziazione convenzionali 12.
Fenotipica Specifiche di hiPSC-SMC
Il fenotipo di un SMC (o di una popolazione di CML) è forse meglio descritta come un equilibrio tra le caratteristiche prevalentemente contrattili e sintetici, che può portare a sostanziali differenze nella morfologia, espressione marcatore, e l'attività. Così, l'utilità di hiPSC-CML per una particolare applicazione può dipendere da quale fenotipo specifico viene generato. La differenziazione e purificazione protocolli hiPSC-SMC qui presentati sono i primi a produrre popolazioni prevalentemente contrattili o sintetici SMC che sono ~ 95% puro in sole 2-3 settimane, e il rischio di contaminazione xenogenica è minimo, perché le procedure non lo fanno require l'uso di cellule di alimentazione.
Migliorata Attecchimento Tasso di cellule trapiantate
Uno degli ostacoli principali per la terapia con cellule efficace si crede di essere il numero estremamente basso di cellule somministrate che sono innestati dal miocardio 14, 15, 16, 17. Le citochine come IGF-1 può migliorare l'attecchimento consentendo alle cellule di resistere meglio microambiente tossici in tessuti ischemici 18, 19, 20, ma le alte pressioni indotte durante la contrazione possono comprimere le cellule attraverso la pista ago e nella circolazione periferica. Pertanto, il notevolmente più elevato tasso di attecchimento ottenuto iniettando le cellule attraverso un cerotto fibrina IGF-1 contenente, che era più di 2 volte superiore al tasso osservato quando il samDose cellule e stato somministrato senza la patch, può probabilmente essere attribuita sia agli effetti citoprotettivo di IGF-1 e alla pezza medesima, che formava una barriera fisica che impediva le cellule venga espulso nello spazio epicardico.
fasi critiche
Per garantire la pluripotenza delle cellule fianchi, è necessario verificare il cariotipo della linea hiPSC prima differenziazione, determinare l'espressione di marcatori pluripotenza (Nanog, SSEA1, e Oct4, et al.), E confermare la loro capacità di formazione teratoma . Si suggerisce di ri-verificare la loro pluripotenza quando le linee hiPSC sono stati diversi passaggi per più di 10 generazioni. Lo status di hiPSC indifferenziata è anche fondamentale per la corretta differenziazione. Per garantire lo stato del hiPSC prima dell'inizio della differenziazione, si consiglia di: 1) utilizzare un mezzo fresco (meno di due settimane), e aggiorna la media giornaliera prima di iniziare hiPSC differentiationico; 2) ridurre il tempo di digestione enzimatica (meno di 5 minuti), e delicatamente pipetta su e giù per le cellule per prevenire i danni inutili alle cellule; 3) replate le cellule ad una densità 1 x 10 5 cellule per pozzetto della piastra da 6 pozzetti; 4) mantenere sempre le celle 37 ° C e 5% CO 2 incubatore e evitare di tenere le cellule fuori dell'incubatore per più di 15 min.
LIMITI DELLA TECNICA
Lo svantaggio principale del nostro metodo per combinare iniettate cellule cardiache hiPSC di derivazione e l'amministrazione delle patch è il requisito per la chirurgia open-petto; in tal modo, questo approccio è improbabile che sia direttamente traducibile per applicazioni cliniche, tranne come terapia aggiuntiva per i pazienti che si sottopongono a un intervento chirurgico rivascolarizzazione coronarica concorrente. Più diffuso uso clinico richiederà lo sviluppo di un metodo di consegna pratico e minimamente invasiva, come ad esempio un approccio endoscope- e il catetere-based che potrebbe accederecuore attraverso l'addome e il diaframma. Inoltre, uno dei problemi di sicurezza più critiche associate alla terapia cellulare cardiaca è lo sviluppo di complicanze aritmogene, e quando le scimmie sono stati trattati con iniezioni intramiocardici di 1 miliardo di CM hESC-derivata, tutti e quattro gli animali hanno sviluppato aritmie spontanee 21. Tuttavia, abbiamo osservato alcuna evidenza di complicanze aritmogeni quando 10 milioni di CM hiPSC-derivati sono state iniettate nei cuori di suini con la ferita IR 2, forse perché la dose di cella era 100 volte più piccolo.
Applicazioni o Direzioni future
rigetto immunitario probabilmente svolge un ruolo importante per il basso tasso di attecchimento. Il / sistema di editing gene Cas CRISPR può consentire ai ricercatori di creare una linea di hiPSCs "donatore universale" da knock out (KO) complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II. Le cellule e tessuti maggio ore hiPSC MHC KO-derivatiave tassi sostanzialmente più alti di attecchimento. Poiché le tecniche migliorano, i tassi di attecchimento rischiano di aumentare. A certo punto l'aumento della dimensione dell'innesto, la grande graft dovrebbe aumentare la arrhythmogenicity del cuore destinatario. La riduzione di innesti associati arrhythmogenicity potrebbe essere realizzato usando cellule con aumento del gap proteine giunzione espressione dalla tecnologia editing gene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessuna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol Section 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10 cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Protocol Section 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-β | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Protocol Section 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-β | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Protocol Section 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Protocol Section 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| ε-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5 T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7 T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
References
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
