כאן, אנו מתארים את טיהור pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) שלפוחית הקרום החיצוני (OMVs) מתרבויות נוזלי. שלפוחית מטוהרים אלה משמשות לטיפול מקרופאגים לנתח פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
חיידקים יכולים להפריש גורמים ארסיים באמצעות מנגנונים שונים 1. מלבד מערכות הפרשה הידועות, גראם שלילי חיידקים יכולים להחליף מידע ולספק גורמים ארסיים באמצעות שלפוחית קרום חיצונית (OMVs), שהם קטנים, שלפוחית אליפטית 10-300 ננומטר בקוטר עם מבנה קרום bilayered. הם מופרשים במגוון סביבות גידול (בתרבות הנוזלית, תרבות מוצקה, biofilms) ובכל שלבי הגדילה 2, 3. OMVs הם אמצעי חשוב של תחבורה (למשל, חלבונים, adhesins, רעלים, ואנזימים, כמו גם עבור LPS, אשר נמצא על פני השטח OMV) 4. מטען intraluminal מוגן מפני שפלה פרוטאוליטים, כך הוא מסוגל לפעול על פני מרחקים ארוכים, ואת השלפוחית ניתן למצוא בנוזלי גוף לאיברים מרוחקים 5, 6,"Xref"> 7, 8. הם לא יכולים להיות מוכרים בלבד נלקחו על ידי תאים איקריוטיים 9, 10, אבל יתר על כן, הם יכולים להקל על הכריכה של חיידקי הפלישה שלהם לתוך תאי מארחים 4. Pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) הוא חיידק גראם שלילי שיכול לשחרר OMVs. ב הריאה האנושית, זה בעיקר מדביק מקרופאגים מכתשיים, למרות המארח הטבעי הם 11 מים מתוקים אמבות. זיהום pneumophila ל עלול לגרום למחלת הליגיונרים, צורה חמורה של דלקת ריאות 12. היא חוסמת phagosome-ליזוזום היתוך בתוך התא המארח. כמו כן מגייס אברונים מארחים, לפיה נישה שכפול, את vacuole המכיל הלגיונלה (LCV), נוצרת 13, 14. השפלה ליזוזומלית היא עכבות לא רק על ידי tra חלבון מפעילnslocation באמצעות מערכת הפרשת IV סוג, אלא גם על ידי שחרור של OMVs 15.
טיהור OMVs מתרבויות חיידקי נדרש לנתח את השפעתם על תאי הנמען. מחקרים קודמים התמקדו תכולת החלבון של ל pneumophila OMVs ועל ההשפעה של שלפוחית על תאי אפיתל המכתשית 16, אך מחקרים מאוחרים יותר עם השתלות רקמת הריאה האנושית הראו כי ל pneumophila OMVs נתפסות על ידי מקרופאגים מכתשיים 17.
כמו דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן הנוכחי OMVs (PAMPs) ו אנטיגנים חיידקיים אחרים, הם עלולים להשפיע על הזיהום של תאי איקריוטיים ולווסת את התגובה החיסונית המארחת 18. ל pneumophila OMVs הפתיל במהירות עם קרום התא המארח, יתר על כן, הם להפעיל את קרומי TLR2 19. כידוע כי ל pneumophמינהל מקרקעי ישראל OMVs לעורר מקרופאגים ותאי אפיתל באופן פרו-דלקתיים 16, 17, ניתחנו את ההשפעה של OMVs על תהליך ההדבקה ב מקרופאגים האדם Murine.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לגידול של pneumophila ל בתרבות הנוזלית לבודד את OMVs המופרש על ידי ultracentrifugation הפרש ועל מנת להעריך את ההשפעה של השלפוחית בתא פונדקאי איקריוטיים, במישרין או בעקבות זיהום.
OMVs של חיידקים פתוגנים ואת ההשפעה של שלפוחית קרום אלה על תאי היעד שלהם כרגע נלמד באופן אינטנסיבי. לדוגמה, perfringens Clostridium -derived OMVs לעורר הפרשת ציטוקינים ב מקרופאגים, לימפוציטים מסוג B יכול להיות מופעל על ידי OMVs מ Borrelia burgdorferi, ו הליקובקטר פילורי -released שלפוחית הממברנה יכול לפעול על תאי אפיתל קיבה 21, 22, 23. ל pneumophila, פתוגן תאי שיכול לגרום צורה חמורה של דלקת ריאות לא טיפוסי, גם משחרר OMVs כי הם מסוגלים להפעיל תאי אפיתל ריאות מקרופאגים 16, 19. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד בקנה מידה קטן של ל pneumophila OMVs מתרבות נוזלי ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של OMVs דלקת ריאות. זה קריטי לעבוד תחת קונדיט סטרילייונים כדי לשלול זיהום מחיידקים אחרים כדי להשיג pneumophila ל טהור -derived הכנה OMV. בידודו של OMVs כולל צעד סינון דרך הנקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום של גלולה OMV שהושג עם pneumophila ל ', למרות שזה מקטין את התשואה OMV, מאז OMVs הגדול הם איבדו אחר צעד סינון זה.
יתר על כן, בדקנו את התגובה של מקרופאגים אדם murine לאלה שלפוחית מבודדת תאים נגועים עם pneumophila ל ביתר דיוק משוער מצב דלקת ריאות הלגיונלה, שם OMVs משתחררים בתוך LCV ידי חיידקים תאיים 15. מינוני OMV המועסקים היו מוערכים בהתאם לסכום OMV החופשי זיהום במבחנה של מקרופאגים אדם לאחר 24 שעות של דגירה (מתואר התייחסות 20). עבור הגירוי של תאי נמען אחרים או בניסויי vivo,מינוני OMV אחרים עשויים להיות נחוצים וצריכים הוקמו. הניתוח של השפעת L. pneumophila OMVs מייצג התקדמות לפרוטוקול שתיאר Jager ו שטיינהרט 24.
הנה, PMA בדיל THP-1 תאים לשמש מודל עבור מקרופאגים מכתשיים בשל ההיצע המוגבל של חומר אנושי עיקרי. התוספת של PMA מבדיל בין תאי THP-1 monocytic לתאים מקרופאג דמוי 25. יתר על כן, הם קו תא מודל ידוע pneumophila ל שמלומד 26. מלבד שורת תאים monocytic האנושי הזה, תאי mBMDM משמשים. mBMDM הם מקובל לחקר ההשפעות של ל pneumophila 27, 28, 29. האפשרות להשתמש knockouts הגנטי TLRs שונה או חלבונים אחרים ולגרום להם כלי רב ערך ללימוד תופעות OMV. ב ORDאה כדי להפחית את כמות עכברים בכל ניסוי, mBMDM משמש במקום מקרופאגים מכתשיים בשל המגבלות של מקרופאגים. ניסויי מפתח עשויים לדרוש מקרופאגים מכתשיים למתן תוקף.
מלבד פרוטוקול בזאת המתואר של ultracentrifugation לטהר OMVs, אפשר לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות, אשר נכלל בפרוטוקול ידי Chutkan et al. 30. זה יכול לשפר את הטוהר של התכשיר OMV השיג ולהפחית את כמות אגרגטים חלבון מטוהרים שיתוף, flagellin, ו LPS. טוהר הכנת OMV המתקבל ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים או על ידי ניתוח מעקב nanoparticle כצעד משלים בקרת איכות. זה יכול לספק אמצעי נוסף של כימות, מעבר הליך מדידת חלבון המוצגת כאן. לחלופין, ריכוז LPS ניתן לנתח על ידי מבחן lysate Limulus amebocyte. אם התשואה OMV היא נמוכה,צעד ריכוז נוסף באמצעות מסנני צנטריפוגלי יכול להתבצע, דבר שלא נעשה כאן. אם התשואה הייתה נמוכה מהצפוי, OMVs שהושלך.
במסגרת המאמץ המתמשך להבהיר את המנגנונים ביולוגיים ופונקציות מאחורי OMVs, השפעת תנאי לחץ שונים על ייצור OMV יכולה להיבדק. מניעת מזון, שינויי טמפרטורת דגירה, או חשיפה לחומרים מזיקים עלולות להשפיע על הפרשת OMV 31. בתנאי עקה אפשריים הם דנו בפרוטוקול ידי Klimentova ו Stulik 32. יתר על כן, יתר או hypovesiculating ל מוטנטים pneumophila יכול להיווצר. הכנות OMV השונות ניתן תהיינה לנתח ניסויי זיהום עם מקרופאגים, explants רקמת ריאה האנושית (מתואר התייחסות 17), או אפילו במודלי in vivo. מלבד התפקיד של OMVs איתות חיסון מולד, השפיע בתקשורת חיידקיםניתן לטפל באופן ניסיוני. יתר על כן, את ההשפעה של מפלי איתות חיסוניים שונים מולד עשויה להיות מנותחת על ידי השימוש בתאי נוקאאוט בעכברים או דור CRISPR / Cas9 נוק-אאוט שורות תאים אנושיים. מחקר בסיסי זה ב OMVs יסייע בפיתוח אסטרטגיות חיסון חדשים, אשר כבר קיימות עבור B דלקת קרום המוח מועברים על ידי meningitides Neisseria 33.
החל מן הפרוטוקול על בידוד ואפיון OMV, אפשר ליישם את זה על חיידקים גראם שליליים אחרים לתאי המארח אחרים; זה צריך להיות מותאם רק לצמיחה של החיידקים בתרבות נוזלית. הפרוטוקול בהוצאת Chutkan et al. מספק מידע מפורט על הדור של OMVs מ coli Escherichia ו Pseudomonas aeruginosa 30. התרבות צריכה לא להגיע בשלב נייח מאוחר כדי להימנע מהעלאות בחיידקים lysed וחלבונים זיהום ומםbranes. בנוסף, מינון OMV משמש גירוי של תאי המארחים צריך להיקבע על פי כמות ה- OMVs במהלך זיהומי in vivo, תוך הקפדה על שיעור נמוך של רעילות. בדרך זו, את התפקיד פתולוגית של OMVs, השפיע על תקשורת בין-מינים, ואינטראקציות מארח הפתוגן יכול להיבחן.
כדי להמשיך ללמוד את התפקיד של ל pneumophila OMVs דלקת ריאות, הכנות OMV סטנדרטיות עם תשואות מספיק ניסויי זיהום דומים נדרשות. פרוטוקול זה יעזור לתקנן נהלי בידוד להאריך מחקרי OMV כדי חיידקים גראם שליליים אחרים לתאים מארחים אחרים. יתרה מזאת, מחקר יהנה מפורט בידע במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להרחיב את הניסויים להגדרות in vivo. בעתיד, פרוטוקול זה יכול להתארך עד הבידוד של OMVs מחומר ביולוגי ראשוני, כגון סרום או lav ברונכואלוואולריתנוזל גיל, כדי לקבל תובנות לגבי הרכב OMVs שוחרר לביתו בתנאים פיזיולוגיים. זה יעזור לקבוע פרמטרים מרכזיים של הרכב OMV וכדי להבין את המאפיינים של במבחנה OMVs -generated.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים פרופ 'ד"ר מרקוס Schnare לספק לנו TLR2 – / – ו TLR2 / 4 – / – עכברים פרופ' ד"ר קרסטן Kirschning עבור טריף / MyD88 – / – עכברים. חלקים של עבודה זו מומנה על ידי Bundesministerium für Bildung und Forschung (ה: miRSys ביו – FKZ 0316175B, דואר: מד CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), דויטשה Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), ו Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (RNomics רפואי LOEWE – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), כל כדי BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |