ここでは、 レジオネラ・ニューモフィラ (L.ニューモ )液体培養物から外膜小胞(OMVを)の精製を記載しています。これらの精製された小胞は、次いで、それらのプロ炎症性の可能性を分析するために、マクロファージの治療のために使用されます。
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
細菌は異なるメカニズム1を介して病原性因子を分泌することができます。よく知られている分泌システムのほかに、グラム陰性細菌は、情報を交換することができ、直径及び二層状膜構造を持つ小さな、回転楕円体小胞10〜300nmである外膜小胞(OMVを)を介して病原性因子を提供します。彼らは、成長環境(液体培養、固体培養、およびバイオフィルム)の様々な、すべての成長段階2、3に分泌されます。 OMVを輸送する重要な手段である( 例えば、OMVの表面上に見出されるタンパク質、アドヘシン、毒素、酵素、ならびにためのLPSのための)4。管腔内の貨物は、タンパク質分解から保護されたので、長い距離にわたって作用することができる、と小胞は、体液や遠隔臓器5、6で見つけることができますされています「外部参照」> 7、8。彼らは認識し、真核細胞9,10によって取り込まが、さらに、それらは、宿主細胞4に細菌およびそれらの浸潤の結合を促進することが可能であることはできません。 レジオネラ・ニューモフィラ (L.ニューモは )のOMVを解放することができ、グラム陰性細菌です。ヒトの肺では、それは主に、その天然の宿主は淡水アメーバ11であっても、肺胞マクロファージに感染します。 L.・ニューモフィラ感染はレジオネラ症、肺炎12の重症型を引き起こす可能性があります。また、宿主細胞内のブロックファゴソーム – リソソーム融合を。複製ニッチ、 レジオネラ -含有小胞(LCV)は、13、14を形成することも、ホスト細胞内小器官を動員します。リソソーム分解だけでなく、エフェクタータンパク質TRAによって阻害されますIV型分泌システムを介して、だけでなく、OMVを15のリリースによりnslocation。
細菌培養物からのOMVの精製は、レシピエント細胞に対する効果を分析するために必要とされます。 L.ニューモフィラのOMVのタンパク質含有量に及び肺胞上皮細胞16が、ヒト肺組織移植とその後の研究に小胞の影響に焦点を当てた初期の研究はL.ニューモフィラのOMVは肺胞マクロファージ17によって取り込まれることを実証しました。
OMVを、本病原体関連分子パターン(PAMP)および他の細菌抗原として、それらは、真核細胞の感染に影響を与えると宿主免疫応答18を調節するかもしれません。 L.ニューモフィラのOMVが急速さらに、それらは、膜TLR2 19を活性化する 、宿主細胞膜と融合し、。それはL. pneumophことが知られているようILAのOMVは、炎症誘発性の様式16、17にマクロファージおよび上皮細胞を刺激し、我々は、ヒトおよびマウスのマクロファージにおける感染プロセスに対するのOMVの影響を分析しました。
ここでは、直接、または感染後、差動超遠心分離により分泌のOMVを分離し、真核生物の宿主細胞に小胞の影響を評価するために、液体培養中でL.・ニューモフィラの栽培のためのプロトコルを説明します。
細菌性病原体およびそれらの標的細胞上のこれらの膜小胞の影響のOMVは、現在集中的に研究されています。例えば、 クロストリジウム・パーフリンジェンスののOMVが、マクロファージにおけるサイトカインの分泌を誘導由来、Bリンパ球は、 ボレリアブルグドルフェリからのOMVによって活性化され、およびヘリコバクター・ピロリは、膜小胞は、胃上皮細胞21、22、23に作用することができる-releasedできます。 L.ニューモ 、非定型肺炎の重症型を誘導することができる細胞内病原体は、また、肺上皮細胞とマクロファージ16、19を活性化することができるのOMVを解放します。ここでは、肺炎でのOMVの潜在的な役割を研究するための培養液からL.ニューモのOMVの小規模単離するための詳細なプロトコルを提示します。無菌コンディット下で作業することが重要ですイオンおよび純粋L.・ニューモフィラを得るために、他の細菌からの汚染を排除するためには、OMV調製物が由来しました。 OMVを単離は、最大のOMVは、この濾過工程で失われるので、これは、OMVの収率を低下させるにもかかわらず、L。ニューモで得られるOMVペレットの汚染を防止するために、0.22ミクロンの細孔を介して濾過するステップを含みます。
さらに、我々はより密接のOMVが細胞外細菌15でLCVの内側にリリースされたレジオネラ肺炎、の状況に近づけるために、これらの単離された小胞およびL.ニューモで感染した細胞にヒトおよびマウスマクロファージの応答をテストしました。採用OMVの用量は、インキュベーションの24時間後のヒトマクロファージのインビトロ感染における自由OMV量に応じて推定されている(参考文献20に記載)。他のレシピエント細胞の刺激のために、またはin vivo実験において 、他のOMV投与量が必要になるかもしれませんし、確立されなければなりません。 L.ニューモフィラのOMVの効果の分析はイェーガーとシュタイナー24によって記述されたプロトコルに進歩を表しています。
ここでは、PMA分化THP-1細胞は、初代ヒト材料の限られた在庫状況により、肺胞マクロファージのモデルとして役立ちます。 PMAの添加は、マクロファージ様細胞25への単球THP-1細胞を区別する。さらに、それらは、L。ニューモ研究 26のための周知のモデル細胞株です。このヒト単球細胞株のほか、mBMDM細胞が使用されます。 mBMDMは広くL.ニューモ 27、28、29の効果の研究のために受理されています。異なるのTLRまたは他のタンパク質のための遺伝子ノックアウトを使用する可能性は、それらのOMV効果を研究するための貴重なツールとなっています。 ORDで実験あたりのマウスの量を低下させるために、ERは、mBMDMではなく、マクロファージの制限による肺胞マクロファージから使用されています。主な実験は、検証のために肺胞マクロファージを必要とするかもしれません。
OMVを精製するための超遠心分離の本明細書に記載のプロトコルに加えて、Chutkan らのプロトコルに含まれている密度勾配遠心分離を行うことができます。 30。これは、得られたOMV調製物の純度を向上させると共精製されたタンパク質の凝集、フラジェリン、およびLPSの量を減らすことができます。得られたOMV調製物の純度は、品質管理における補助ステップとして、透過型電子顕微鏡法によって、またはナノ粒子追跡分析によって分析することができます。これは、ここで提示タンパク質の測定手順を超えて、定量化の追加の手段を提供することができます。任意に、LPS濃度はリムルス変形細胞溶解物の試験によって分析することができます。 OMV収率が低い場合、遠心フィルターを経由して、追加の濃縮工程は、ここで行われなかった、実行することができます。収量が予想より低かった場合は、OMVを廃棄しました。
OMVを背後にある生物学的メカニズムと機能を解明するための継続的な取り組みの一環として、OMVの生産に異なるストレス条件の影響を試験することができます。栄養欠乏、インキュベーション温度の変化、または有害な薬剤への曝露は、OMV分泌31に影響を与える可能性があります。可能性のあるストレス条件はKlimentovaとStulik 32によってプロトコルで説明されています。また、ハイパーまたはhypovesiculating L.・ニューモ変異体が生成することができます。異なるOMV調製物は、その後、(文献17に記載)、ヒト肺組織外植片、あるいはin vivoモデルにおけるマクロファージの感染実験で分析することができました。細菌の通信における自然免疫シグナル伝達におけるのOMVの役割、彼らの影響力のほかに実験的に対処することができます。さらに、様々な自然免疫シグナル伝達カスケードの影響は、マウスノックアウト細胞の使用またはヒト細胞株におけるCRISPR / Cas9ノックアウトの生成によって分析されることがあります。 OMVのこの基礎研究はすでに髄膜炎菌 33によって送信された髄膜炎Bのために存在する新たなワクチン戦略の開発を支援します。
OMVの単離および特徴上のプロトコルから始めて、1は、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞にこれを適用することができます。それは、液体培養における細菌の増殖を調整する必要があります。 Chutkan らによって発表されたプロトコル。 大腸菌や緑膿菌 30からのOMVの生成に関する詳細な情報を提供しています。文化を溶解し、細菌の増加と汚染タンパク質とMEMを避けるために、後期定常期に達するべきではありませんブレーン。さらに、宿主細胞の刺激のために使用されるOMV用量は依然として細胞毒性の低い速度を確保しながら、 インビボでの感染の間のOMVの存在量に応じて決定する必要があります。このように、OMVをの病理学的役割は、種間の通信、およびホスト病原体相互作用に及ぼす影響を調べることができました。
さらに肺炎でL.ニューモのOMVの役割を研究するために、十分な収量と同等の感染実験で標準化されたOMV調製物が必要とされています。このプロトコルは、分離手順を標準化し、他のグラム陰性菌および他の宿主細胞へのOMVの研究を拡張するのに役立ちます。さらに、研究は、 インビボでの設定に実験を拡張するために使用することができる、 インビトロ知識に詳細恩恵を受ける。今後は、このプロトコルは、血清又は気管支LAVとして、主要な生物学的材料からのOMVの単離に拡張することができ年齢流体は、生理学的条件の下でリリースするOMVの組成への洞察を得るために。これは、OMV組成物の重要なパラメータを決定し、in vitroで -generatedのOMVの性質を理解するのに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、TLR2をご提供するための教授マルクスSchnareに感謝– / –およびTLR2 / 4 – / –マウスおよびTRIF / MyD88のための教授カルステンKirschning – / –マウス。 、ドイツ学術協会(SFB / TR-84; BundesministeriumがビルドゥングウントForschung(:: – – http://www.bmbf.de/メッドCAPSYS FKZ 01X1304E FKZ 0316175B、電子バイオmiRSys e)をFURことで、この作業の一部は資金を供給されましたhttp://www.sfb-tr84.de/)、およびHessisches MinisteriumのfürWissenschaftウントクン(LOEWE医療RNomics – FKZ 519/03 / 00.001-(0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics)、すべてのBSへ。
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |