We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Bacteriën kunnen virulentiefactoren uitscheiden via verschillende mechanismen 1. Naast de bekende secretorische systemen kunnen Gram-negatieve bacteriën informatie uit en levert virulentiefactoren via buitenmembraan vesicles (OMV's), die zijn kleine, bolvormige blaasjes 10-300 nm in diameter en met een tweelagig membraanstructuur. Ze zijn afgescheiden in verschillende groei omstandigheden (vloeibare kweek, vaste fase en biofilms) en in alle groeifasen 2, 3. OMV's een belangrijk transportmiddel (bijvoorbeeld voor eiwitten, adhesinen, toxines en enzymen, alsmede voor LPS, dat wordt gevonden aan het oppervlak OMV) 4. De intraluminale lading is beschermd tegen proteolytische afbraak, zodat zij kan optreden over lange afstanden en de vesicles kunnen worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen en verre organen 5, 6,"xref"> 7, 8. Ze kunnen alleen worden herkend en opgenomen door eukaryotische cellen 9, 10, maar bovendien kunnen zij de binding van bacteriën en hun invasie in gastheercellen vergemakkelijken 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) is een Gram-negatieve bacterie die OMV's kunnen vrijgeven. In de menselijke long, het voornamelijk infecteert alveolaire macrofagen, ook al zijn natuurlijke gastheer zijn zoetwater amoeben 11. Een L. pneumophila infectie kan de veteranenziekte, een ernstige vorm van longontsteking 12 veroorzaken. Het blokkeert phagosome-lysosoom fusie in de gastheercel. Het werft ook gastheer organellen, waarbij een replicatie niche, de Legionella-bevattende vacuole (LCV), wordt gevormd 13, 14. Lysosomale afbraak wordt geremd niet alleen effectoreiwit translocation via de type IV secretie systeem, maar ook door het vrijkomen van OMV's 15.
Het zuiveren van OMV's uit bacteriële kweken moet hun effect op ontvangende cellen te analyseren. Eerdere studies gericht op het eiwitgehalte van L. pneumophila OMV en de invloed van de blaasjes op alveolaire epitheelcellen 16, maar latere studies met humane long weefseltransplantatie aangetoond dat L. pneumophila OMV gebruik is gemaakt door alveolaire macrofagen 17.
Als OMV aanwezig pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en andere bacteriële antigenen, kunnen ze van invloed zijn op de infectie van eukaryote cellen en moduleren de immuunrespons van de gastheer 18. L. pneumophila OMV snel fuseren met menselijke celmembranen en bovendien, activeren ze de membraneuze TLR2 19. Aangezien het bekend is dat L. pneumophila OMV stimuleert macrofagen en epitheelcellen in een pro-inflammatoire wijze 16, 17, analyseerden we het effect van OMV's voor het infectieproces in menselijk en murine macrofagen.
We beschrijven hier een protocol voor het kweken van L. pneumophila in vloeibare kweek met de uitgescheiden OMV isoleren differentieel ultracentrifugatie en het effect van de blaasjes op eukaryote gastheercellen beoordelen, hetzij rechtstreeks of na een infectie.
De OMV's van bacteriële pathogenen en de gevolgen van deze vesicles op hun doelwitcellen worden momenteel intensief bestudeerd. Bijvoorbeeld, Clostridium perfringens -afgeleide OMV induceert cytokine secretie in macrofagen, B-lymfocyten worden geactiveerd door OMV's van Borrelia burgdorferi en Helicobacter pylori -released membraan blaasjes kan handelen maagepitheelcellen 21, 22, 23. L. pneumophila, een intracellulair pathogeen die een ernstige vorm van atypische longontsteking kan veroorzaken, brengt ook OMV's die kunnen long epitheelcellen en macrofagen 16, 19 te activeren zijn. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de kleine schaal isolatie van L. pneumophila OMV's uit vloeibare cultuur aan de mogelijke rol van OMV's in een longontsteking te bestuderen. Het is cruciaal om onder steriele conditionen en uit te sluiten besmetting van andere bacteriën om een pure L. pneumophila verkrijgen -afgeleide OMV voorbereiding. De isolatie van OMV's omvat een filtratiestap door 0,22 urn poriën teneinde de verontreiniging van de verkregen pellet OMV met L. pneumophila voorkomen, ook al beperkt de OMV opbrengst, aangezien het grootste OMV's verloren deze filtratiestap.
Verder hebben we de activiteit van humane en murine macrofagen die geïsoleerd blaasjes en geïnfecteerde cellen met L. pneumophila getest om dichter te benaderen de situatie in Legionella pneumonia, wanneer OMV's binnen de LCV worden vrijgegeven door extracellulaire bacteriën 15. De toegepaste doses OMV zijn geschat op basis van de vrije hoeveelheid OMV in een in vitro infectie van humane macrofagen na 24 uur incubatie (beschreven in referentievoorbeeld 20). Voor het stimuleren van andere ontvangende cellen of in vivo experimenten,andere OMV doses kan nodig zijn en moet worden vastgesteld. De analyse van het effect van L. pneumophila OMV vertegenwoordigt een vooruitgang op de door Jager en Steinert 24 protocol.
Hier, PMA gedifferentieerde THP-1-cellen dienen als model voor alveolaire macrofagen vanwege de beperkte beschikbaarheid van primaire menselijke materiaal. De toevoeging van PMA onderscheidt de monocytische THP-1 cellen in macrofaag-achtige cellen 25. Bovendien zijn ze een bekend model cellijn L. pneumophila bestudeert 26. Naast deze menselijke monocytische cellijn, worden mBMDM cellen gebruikt. mBMDM worden geaccepteerd voor de studie van de effecten van L. pneumophila 27, 28, 29. De mogelijkheid om genetische knockouts voor verschillende TLRs of andere eiwitten maken ze een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen OMV effecten. in order om de hoeveelheid muizen per experiment verlagen mBMDM gebruikt in plaats van alveolaire macrofagen vanwege de beperkingen van de macrofagen. Key experimenten kunnen alveolaire macrofagen ter validatie vereisen.
Naast de hierin beschreven protocol van ultracentrifugatie om OMV zuiveren, kan men een dichtheidsgradiënt centrifugatie, die is opgenomen in het protocol Chutkan et al uitvoeren. 30. Dit kan de zuiverheid van het verkregen OMV preparaat verbeteren en de hoeveelheid co-gezuiverd eiwit aggregaten, flagelline en LPS verminderen. De zuiverheid van de verkregen OMV preparaat kan worden geanalyseerd met transmissie-elektronenmicroscopie of nanodeeltje tracking-analyse als een aanvullende stap in de kwaliteitscontrole. Dit kan een extra middel van kwantificering bieden, voorbij het eiwit meetprocedure hier gepresenteerd. Eventueel kan de LPS-concentratie wordt geanalyseerd door een limulus amoebocyt lysaat proef. Als de OMV rendement laag is, eenaanvullende concentratiestap via centrifugale filters worden uitgevoerd, die hier niet is gedaan. Indien het rendement lager dan verwacht, werden de OMV's weggegooid.
Als onderdeel van de voortdurende inspanning om de biologische mechanismen en functies achter OMV helderen, kan de invloed van verschillende stress op OMV productie getest. Nutrient ontbering, veranderingen in de incubatie temperatuur, of blootstelling aan schadelijke stoffen zou een impact hebben op OMV afscheiding 31 te hebben. Mogelijke stress-condities worden besproken in het protocol door Klimentova en Stulik 32. Bovendien kan hyper- of hypovesiculating L. pneumophila mutanten worden gegenereerd. De verschillende OMV preparaten kunnen dan in infectie-experimenten worden geanalyseerd macrofagen, longweefsel explantaten mens (in Referentievoorbeeld 17 beschreven), of in in vivo modellen. Naast de rol van OMV's in aangeboren immuunsysteem signalering, hun invloed in bacteriële communicatiekan experimenteel worden aangepakt. Bovendien kan het effect van verschillende aangeboren immuunrespons signaling cascades worden geanalyseerd door het gebruik van muizen knockout cellen of het genereren van CRISPR / Cas9 knockouts in humane cellijnen. Deze fundamentele onderzoek op OMV's zullen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe vaccin strategieën, die reeds meningitis B overgebracht door Neisseria meningitidis 33 bestaan.
Uitgaande van het Protocol betreffende de OMV isolatie en karakterisering, kan men dit toepassen op andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen; het moet alleen worden aangepast aan de groei van de bacteriën in vloeibare kweek. Het protocol gepubliceerd door Chutkan et al. geeft gedetailleerde informatie over het genereren van OMV's van Escherichia coli en Pseudomonas aeruginosa 30. De cultuur moet de late stationaire fase niet bereiken om stijgingen van de gelyseerde bacteriën en verontreinigende eiwitten en mem te voorkomenbranen. Bovendien, de OMV wordt gebruikt bij stimulatie van de gastheercellen te worden bepaald volgens de hoeveelheid OMV aanwezig bij in vivo infectie, maar verzekert een lage cytotoxiciteit. Op deze manier, de pathologische rol van OMV's, hun impact op inter-soorten communicatie en gastheer-pathogeen interacties kunnen worden onderzocht.
Om de rol van L. pneumophila OMV longontsteking verdere studie, zijn gestandaardiseerd OMV preparaten voldoende opbrengst en vergelijkbare infectie experimenten nodig. Dit protocol zal helpen isoleringsprocedures standaardiseren en OMV studies uit te breiden tot andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen. Daarnaast zal het onderzoek profiteren van de gedetailleerde in vitro kennis, die kan worden gebruikt voor experimenten in vivo instellingen verlengen. In de toekomst kan dit protocol worden uitgebreid tot de isolatie van OMV's uit primaire biologisch materiaal, zoals serum of bronchoalveolaire lavleeftijd vloeistof, om inzicht te krijgen in de samenstelling van OMV's vrijgegeven onder fysiologische omstandigheden. Dit zal helpen om belangrijke parameters van OMV samenstelling bepalen en de eigenschappen van in vitro -generated OMV begrijpen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Prof. Dr. Markus Schnare voor het verstrekken van ons met TLR2 – / – en TLR2 / 4 – / – muizen en Prof. Dr. Carsten Kirschning voor TRIF / MyD88 – / – muizen. Delen van dit werk werd gefinancierd door Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) en Hessische Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), allemaal BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |