Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

doi: 10.3791/55146 Published: February 22, 2017

Summary

We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.

Introduction

Bacteriën kunnen virulentiefactoren uitscheiden via verschillende mechanismen 1. Naast de bekende secretorische systemen kunnen Gram-negatieve bacteriën informatie uit en levert virulentiefactoren via buitenmembraan vesicles (OMV's), die zijn kleine, bolvormige blaasjes 10-300 nm in diameter en met een tweelagig membraanstructuur. Ze zijn afgescheiden in verschillende groei omstandigheden (vloeibare kweek, vaste fase en biofilms) en in alle groeifasen 2, 3. OMV's een belangrijk transportmiddel (bijvoorbeeld voor eiwitten, adhesinen, toxines en enzymen, alsmede voor LPS, dat wordt gevonden aan het oppervlak OMV) 4. De intraluminale lading is beschermd tegen proteolytische afbraak, zodat zij kan optreden over lange afstanden en de vesicles kunnen worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen en verre organen 5, 6,"xref"> 7, 8. Ze kunnen alleen worden herkend en opgenomen door eukaryotische cellen 9, 10, maar bovendien kunnen zij de binding van bacteriën en hun invasie in gastheercellen vergemakkelijken 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) is een Gram-negatieve bacterie die OMV's kunnen vrijgeven. In de menselijke long, het voornamelijk infecteert alveolaire macrofagen, ook al zijn natuurlijke gastheer zijn zoetwater amoeben 11. Een L. pneumophila infectie kan de veteranenziekte, een ernstige vorm van longontsteking 12 veroorzaken. Het blokkeert phagosome-lysosoom fusie in de gastheercel. Het werft ook gastheer organellen, waarbij een replicatie niche, de Legionella-bevattende vacuole (LCV), wordt gevormd 13, 14. Lysosomale afbraak wordt geremd niet alleen effectoreiwit translocation via de type IV secretie systeem, maar ook door het vrijkomen van OMV's 15.

Het zuiveren van OMV's uit bacteriële kweken moet hun effect op ontvangende cellen te analyseren. Eerdere studies gericht op het eiwitgehalte van L. pneumophila OMV en de invloed van de blaasjes op alveolaire epitheelcellen 16, maar latere studies met humane long weefseltransplantatie aangetoond dat L. pneumophila OMV gebruik is gemaakt door alveolaire macrofagen 17.

Als OMV aanwezig pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en andere bacteriële antigenen, kunnen ze van invloed zijn op de infectie van eukaryote cellen en moduleren de immuunrespons van de gastheer 18. L. pneumophila OMV snel fuseren met menselijke celmembranen en bovendien, activeren ze de membraneuze TLR2 19. Aangezien het bekend is dat L. pneumophila OMV stimuleert macrofagen en epitheelcellen in een pro-inflammatoire wijze 16, 17, analyseerden we het effect van OMV's voor het infectieproces in menselijk en murine macrofagen.

We beschrijven hier een protocol voor het kweken van L. pneumophila in vloeibare kweek met de uitgescheiden OMV isoleren differentieel ultracentrifugatie en het effect van de blaasjes op eukaryote gastheercellen beoordelen, hetzij rechtstreeks of na een infectie.

Protocol

1. Bereid Medium en Agar Plates

  1. Bereid 1 liter bouillon medium (YEB). Los 10 g ACES en 10 g gistextract in 900 ml gedestilleerd water. Breng de pH op 6,9 met KOH (5 N). Voeg 10 ml L-cysteïne (0,4 g in 10 ml gedestilleerd water) en 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml gedestilleerd water). Vullen tot 1 L met gedestilleerd water en filter steriliseren van de oplossing (poriegrootte: 0,22 pm). Bewaren bij 4 ° C.
  2. Bereid gebufferd houtskool gistextract (BCYE) agarplaten. Los 10 g ACES en 10 g gistextract in 900 ml gedestilleerd water. Breng de pH op 6,9 met KOH (5 N). Voeg 15 g agar en 2,5 g actieve kool. Vul tot 1 L met gedestilleerd water en autoclaaf.
    1. Voeg 10 ml L-cysteïne (0,4 g in 10 ml gedestilleerd water) en 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml gedestilleerd water, zowel gesteriliseerd door filtratie door 0,22 urnporiën) afgekoeld tot BCYE (ongeveer 50 ° C). Gietplaten en bewaar bij 4 ° C.

2. Ontwikkel L. pneumophila

  1. Verspreid L. pneumophila stam Corby (type wild, WT) op BCYE agarplaten en incubeer ze op 37 ° C gedurende 3 dagen. Inoculeer 10 ml YEB op een OD 600 van 0,3 met L. pneumophila van de voorkweek plaat; Incubeer de kiemen bij 37 ° C op een roterende schudinrichting (150 rpm) gedurende 6 uur.
  2. Controleer de zuiverheid van de vloeibare kweek door het verspreiden van 100 pi van de suspensie op een bloed-agarplaat. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
  3. Voeg de overblijvende vloeibare kweek tot 90 ml vers YEB medium en geïncubeerd op een roterende schudinrichting (37 ° C en 150 rpm) tot een OD600 van 3,0-3,5, waarvan ongeveer 16-20 uur duurt bereiken.

3. Bereid en kwantificeren van L. pneumophila OMV

OPMERKING: Voer alle volgende centrifugeren staps onder steriele omstandigheden en bij 4 ° C.

  1. Centrifugeer de vloeistof cultuur bij 4.000 xg gedurende 20 minuten om de bacteriën pellet. Breng de bovenstaande om verse centrifugebuizen, gooi de bacteriële pellet, en herhaal het centrifugeren (4000 x g gedurende 20 min). Herhaal deze stap een keer.
  2. Steriel filter resterende supernatant tweemaal (poriegrootte: 0,22 pm). Breng de bacterievrije supernatant ultracentrifuge buizen en ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 3 uur.
  3. Giet het supernatant en gooi deze weg. Resuspendeer de pellet OMV in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en ultracentrifuge (100.000 xg gedurende 3 h) contaminerende proteïnen en LPS te verwijderen.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de OMV pellet in 500 pi steriel PBS. Streak 20 ul op een bloed agar plaat en op een BCYE agarplaat om bacteriële besmetting van de bereide blaasjes te sluiten. Incubeer het bloed agar plaat 's nachts en de BCYE agarplaat gedurende 3 dagen (beide op 376, C).
  5. Kwantificeren eiwithoeveelheid verkregen uit de OMV preparaat met een bicinchoninezuur bepaling volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: De concentratie van 100 ml L. pneumophila cultuur is gewoonlijk 1 ug / ul. Bewaar de bereide en gekwantificeerde OMV bij -20 ° C.

4. Pre-treat macrofagen

  1. Bereid THP-1-cellen.
    Opmerking: THP-1 is een monocytische cellijn afgeleid van een leukemie patiënt.
    1. Voeg 2x10 5 THP-1-cellen per 24 putjes en differentiëren door toevoegingen 20 nM forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) in macrofaag-achtige cellen. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C.
    2. Vervang het medium met 500 ul vers medium en incubeer gedurende nog 24 uur; het optimale medium voor THP-1 cellen bestaat uit RPMI 1640 een hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal kalfsserum.
  2. Isoleer het muizen beenmerg afgeleide macrofagen (mBMDM), zoals beschreven in verwijzenENCE 20.
  3. Behandel THP-1-afgeleide macrofagen of mBMDM met OMV.
    1. Ontdooi de OMV's bereid in stap 3 en toe volgens hun hoeveelheid eiwit (0,1, 1 en 10 ug / ml) aan de menselijke of murine macrofagen. Incubeer de macrofagen met OMV's bij 37 ° C gedurende ten minste 20 uur. Gebruik het supernatant ELISA of verder gaan met stap 5.

5. Infect de macrofagen en te beoordelen Bacteriële replicatie met een kiemgetal (CFU) Assay

  1. Gebruik L. pneumophila uit stap 2.1, voorbehandelde THP-1 cellen of mBMDM uit stap 4.3, en niet voorbehandeld macrofagen als controles (2x10 5/24 wells). Mis het medium niet uit te wisselen.
  2. Infect THP-1 cellen met L. pneumophila Corby WT en mBMDM met een flagelline ontbreekt mutant van L. pneumophila Corby (beide met een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 wells) en incubeer gedurende 24 en 48 uur, respectievelijk. Bereid both L. pneumophila Corby (WT of flagelline-arme mutant) zoals beschreven in stap 2.1.
  3. Lyse van de cellen in het medium door de toevoeging van saponine (eindconcentratie: 0,1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
  4. Resuspendeer de bacteriën door pipetteren en de suspensie in een reactievat. Bereid seriële verdunningen van de L. pneumophila bevattende media in steriele PBS.
  5. Strook 50 pi van de benodigde verdunningen op BCYE agarplaten en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C.
  6. Visueel tellen de gevormde kolonies. Bereken de CFU vergelijking 1 Normaliseren van de CFU telresultaat niet voorbehandeld maar geïnfecteerde macrofagen, die zijn ingesteld op 100%.

Representative Results

De experimentele opstelling te bereiden L. pneumophila OMV's en hun invloed op de pro-inflammatoire reactie van macrofagen na infectie is in Figuur 1 te analyseren. De pro-inflammatoire potentieel van de bereide OMV's kunnen worden geanalyseerd op PMA gedifferentieerde THP-1-cellen, die is getoond in figuur 2. THP-1-cellen reageren met een tijds- en dosisafhankelijke toename van IL-8 en IL-6 secretie. Bovendien kan de invloed van verschillende TLRs op L. pneumophila OMV erkenning worden geanalyseerd door mBMDM uit verschillende genetische achtergronden, zoals dit door de CXCL1 ELISA in figuur 3. mBMDM van WT-muizen afgescheiden CXCL1 na OMV stimulatie, terwijl mBMDM TLR2 / 4 - / - uitgescheiden aanzienlijk minder. Om het effect van L. pneumophila OMV's op bacteriële replicatie in THP-1 macrofagen, cellen werden gepreïncubeerd met OMV en bovendien geïnfecteerdmet L. pneumophila (Figuur 4 A). De pre-stimulatie van THP-1-afgeleide macrofagen vermindert eerst de bacteriële replicatie na 24 uur van infectie, maar het leidt tot een verdubbeling CFU tellen bij het later tijdstip (48 uur pi). De impact van Toll-like receptor (TLR) signalering op OMV erkenning na de infectie van de macrofagen kan worden beoordeeld door mBMDM, zoals weergegeven in figuur 4 B. Bacteriële replicatie stijgt met vertienvoudigd in mBMDM van WT dieren na OMV pre-incubatie, terwijl TLR2 - / - en TRIF / MyD88 - / - cellen niet deze toename van L. pneumophila replicatie tonen.

Figuur 1
Figuur 1: Experimentele procedure. (A) L. pneumophila Corby WT van 10-cm BCYE agarplaten worden gebruikt om een kleine vloeibare kweek (10 ml), die in 90 ml vers YEB overgedragen entenmedium na 6 uur. Een klein volume wordt ook uitgeplaat op een agarplaat bloed te controleren op zuiverheid. De bacteriën worden geïncubeerd bij 37 ° C tot de vroege stationaire fase (OD 600 = 3,0-3,5). (B) De vloeibare kweek wordt gecentrifugeerd en steriel gefiltreerd om de bacteriën te verwijderen. De Legionella -vrij supernatant wordt vervolgens ultracentrifugeerd een OMV pellet, die wordt geresuspendeerd in PBS en nog te hebben ultracentrifuge. De geïsoleerde blaasjes worden opnieuw gesuspendeerd, gecontroleerd op zuiverheid, en gekwantificeerd voor het eiwit bedrag. De schaal bar vertegenwoordigt 2,5 cm. (C) menselijke of murine macrofagen gestimuleerd met de gekwantificeerde OMV. De celkweek supernatant kan worden gebruikt voor ELISA of macrofagen kunnen worden geïnfecteerd met L. pneumophila bacteriële replicatie bepalen CFU test op 10 cm agarplaten BCYE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Pro-inflammatoire activatie van THP-1 cellen door L. pneumophila OMV's. (A) Hier de monocytische THP-1 cellijn wordt gebruikt als model voor alveolaire macrofagen. PMA gedifferentieerde THP-1-cellen werden behandeld met toenemende doses van L. pneumophila OMV (0,01-25 ug / ml) gedurende 24 en 48 uur, respectievelijk. Het celvrije supernatant werd gebruikt voor IL-8-ELISA. De gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten ± SEM getoond. THP-1-cellen reageerden op slechts 0,01 ug / ml L. pneumophila OMV's met aanzienlijke IL-8 secretie, die tijd- en dosisafhankelijk was. (B) L. pneumophila OMV (0,1-10 ug / ml) werden met PMA gedifferentieerde THP-1 cellen te stimuleren. Het supernatant werd na 24 en 48 uur incubatie, en de vrijgegeven IL-6 werd gemeten in de supernatant via ELISA. De gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten ± SEM getoond. THP-1-cellen uitgescheiden aanzienlijke hoeveelheden IL-6, zelfs bij de laagste dosis OMV's (0,1 ug / ml). De afscheiding van IL-6 toe met toenemende doses OMV en langere incubatietijden. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P <0,05 en ** p <0,01 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV. Overgenomen met toestemming van referentie 20. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: De pro-inflammatoire activatie van macrofagen afhankelijk TLR2 / 4. mBMDM van WT- en TLR2 / 4 - / - muizen werden met L. pneumophila OMV (0,1 of 1 ug / ml). CXCL1 secretie werd geanalyseerd door ELISA na 24 en 48 uur, respectievelijk. Degemiddelde waarden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten zijn getoond. mBMDM van WT-muizen reageerden met een dosis-afhankelijke CXCL1 secretie na L. pneumophila OMV incubatie. TLR2 / 4 - / - mBMDM uitgescheiden aanzienlijk minder CXCL1 vergelijking met WT mBMDM en deze afscheiding niet toenam dosisafhankelijk. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P <0,05 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV; #p <0,05 in vergelijking met een gelijk behandeld WT monster. Overgenomen met toestemming van referentie 20. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: L. pneumophila OMV voorincubatie verhogingen bacteriële replicatie in macrofagen. (A) gedifferentieerde THP-1-cellen werden gepreïncubeerd met OMV (0,1, 1 of 10 μ, G / ml) of LPS / IFN-γ (200 ng / ml elk) of werden onbehandeld gelaten ter controle. Na voorincubatie (20 h), werden THP-1 cellen geïnfecteerd met L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) gedurende 2, 24 en 48 uur, respectievelijk. THP-1 cellen werden gelyseerd door de toevoeging van saponine en de bacteriën werden geplaat op agarplaten BCYE. KVE's werden berekend op 0 ug / ml OMV na elk tijdspunt. De balken geven de gemiddelde waarden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in technische duplo. Er waren geen verschillen in bacteriële opname (2 uur na infectie (pi)) ten opzichte van niet voorbehandelde cellen. Veranderingen in bacteriële replicatie werden vastgesteld na 24 en 48 uur, respectievelijk. LPS / IFN-γ voorbehandelde THP-1-cellen bleken de bacteriologische belasting 24 uur pi Dit werd eveneens waargenomen dosisafhankelijk voor L. pneumophila OMV-vooraf behandelde cellen. Bij het later tijdstip (48 uur pi), OMV voorbehandelde THP-1 cellen vertoonden een verdubbeling L. pneumophila replicatie, terwijl LPS / IFN-γ voorbehandelde macrofagen vertoonden een verdere vermindering van bacteriële verontreiniging. Statistieken: Mann-Whitney-test; * P <0,05 en ** p <0,01 vergeleken met de overeenkomstige 0 ug / ml OMV. (B) mBMDM van muizen met verschillende genetische achtergronden (WT, TLR2 - / - en TRIF / MyD88 - / -) werden vooraf geïncubeerd met 0,1 ug / ml L. pneumophila OMV gedurende 20 uur en werden vervolgens geïnfecteerd met een flagellin- deficiënte mutant van L. pneumophila Corby (MOI 0,5) gedurende 48 uur. mBMDM werden gelyseerd door de toevoeging van saponine en de Legionella werden geplaat op agarplaten BCYE. De CFE werd berekend op 0 ug / ml OMV, aangeduid door de getrokken lijn. De balken geven de gemiddelde waarden ±± SEM van drie onafhankelijke experimenten, elk in duplo uitgevoerd. mBMDM van WT-muizen vertoonden een stijging van L. pneumophila replicatie na OMV voorbehandeling. TLR2 - / - macrofagen vertoonden significant verminderde - / - mBMDM. Statistieken: Mann-Whitney-test; p <0,05 in vergelijking met de WT sample. Overgenomen met toestemming van referentie 20. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De OMV's van bacteriële pathogenen en de gevolgen van deze vesicles op hun doelwitcellen worden momenteel intensief bestudeerd. Bijvoorbeeld, Clostridium perfringens -afgeleide OMV induceert cytokine secretie in macrofagen, B-lymfocyten worden geactiveerd door OMV's van Borrelia burgdorferi en Helicobacter pylori -released membraan blaasjes kan handelen maagepitheelcellen 21, 22, 23. L. pneumophila, een intracellulair pathogeen die een ernstige vorm van atypische longontsteking kan veroorzaken, brengt ook OMV's die kunnen long epitheelcellen en macrofagen 16, 19 te activeren zijn. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de kleine schaal isolatie van L. pneumophila OMV's uit vloeibare cultuur aan de mogelijke rol van OMV's in een longontsteking te bestuderen. Het is cruciaal om onder steriele conditionen en uit te sluiten besmetting van andere bacteriën om een pure L. pneumophila verkrijgen -afgeleide OMV voorbereiding. De isolatie van OMV's omvat een filtratiestap door 0,22 urn poriën teneinde de verontreiniging van de verkregen pellet OMV met L. pneumophila voorkomen, ook al beperkt de OMV opbrengst, aangezien het grootste OMV's verloren deze filtratiestap.

Verder hebben we de activiteit van humane en murine macrofagen die geïsoleerd blaasjes en geïnfecteerde cellen met L. pneumophila getest om dichter te benaderen de situatie in Legionella pneumonia, wanneer OMV's binnen de LCV worden vrijgegeven door extracellulaire bacteriën 15. De toegepaste doses OMV zijn geschat op basis van de vrije hoeveelheid OMV in een in vitro infectie van humane macrofagen na 24 uur incubatie (beschreven in referentievoorbeeld 20). Voor het stimuleren van andere ontvangende cellen of in vivo experimenten,andere OMV doses kan nodig zijn en moet worden vastgesteld. De analyse van het effect van L. pneumophila OMV vertegenwoordigt een vooruitgang op de door Jager en Steinert 24 protocol.

Hier, PMA gedifferentieerde THP-1-cellen dienen als model voor alveolaire macrofagen vanwege de beperkte beschikbaarheid van primaire menselijke materiaal. De toevoeging van PMA onderscheidt de monocytische THP-1 cellen in macrofaag-achtige cellen 25. Bovendien zijn ze een bekend model cellijn L. pneumophila bestudeert 26. Naast deze menselijke monocytische cellijn, worden mBMDM cellen gebruikt. mBMDM worden geaccepteerd voor de studie van de effecten van L. pneumophila 27, 28, 29. De mogelijkheid om genetische knockouts voor verschillende TLRs of andere eiwitten maken ze een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen OMV effecten. in order om de hoeveelheid muizen per experiment verlagen mBMDM gebruikt in plaats van alveolaire macrofagen vanwege de beperkingen van de macrofagen. Key experimenten kunnen alveolaire macrofagen ter validatie vereisen.

Naast de hierin beschreven protocol van ultracentrifugatie om OMV zuiveren, kan men een dichtheidsgradiënt centrifugatie, die is opgenomen in het protocol Chutkan et al uitvoeren. 30. Dit kan de zuiverheid van het verkregen OMV preparaat verbeteren en de hoeveelheid co-gezuiverd eiwit aggregaten, flagelline en LPS verminderen. De zuiverheid van de verkregen OMV preparaat kan worden geanalyseerd met transmissie-elektronenmicroscopie of nanodeeltje tracking-analyse als een aanvullende stap in de kwaliteitscontrole. Dit kan een extra middel van kwantificering bieden, voorbij het eiwit meetprocedure hier gepresenteerd. Eventueel kan de LPS-concentratie wordt geanalyseerd door een limulus amoebocyt lysaat proef. Als de OMV rendement laag is, eenaanvullende concentratiestap via centrifugale filters worden uitgevoerd, die hier niet is gedaan. Indien het rendement lager dan verwacht, werden de OMV's weggegooid.

Als onderdeel van de voortdurende inspanning om de biologische mechanismen en functies achter OMV helderen, kan de invloed van verschillende stress op OMV productie getest. Nutrient ontbering, veranderingen in de incubatie temperatuur, of blootstelling aan schadelijke stoffen zou een impact hebben op OMV afscheiding 31 te hebben. Mogelijke stress-condities worden besproken in het protocol door Klimentova en Stulik 32. Bovendien kan hyper- of hypovesiculating L. pneumophila mutanten worden gegenereerd. De verschillende OMV preparaten kunnen dan in infectie-experimenten worden geanalyseerd macrofagen, longweefsel explantaten mens (in Referentievoorbeeld 17 beschreven), of in in vivo modellen. Naast de rol van OMV's in aangeboren immuunsysteem signalering, hun invloed in bacteriële communicatiekan experimenteel worden aangepakt. Bovendien kan het effect van verschillende aangeboren immuunrespons signaling cascades worden geanalyseerd door het gebruik van muizen knockout cellen of het genereren van CRISPR / Cas9 knockouts in humane cellijnen. Deze fundamentele onderzoek op OMV's zullen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe vaccin strategieën, die reeds meningitis B overgebracht door Neisseria meningitidis 33 bestaan.

Uitgaande van het Protocol betreffende de OMV isolatie en karakterisering, kan men dit toepassen op andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen; het moet alleen worden aangepast aan de groei van de bacteriën in vloeibare kweek. Het protocol gepubliceerd door Chutkan et al. geeft gedetailleerde informatie over het genereren van OMV's van Escherichia coli en Pseudomonas aeruginosa 30. De cultuur moet de late stationaire fase niet bereiken om stijgingen van de gelyseerde bacteriën en verontreinigende eiwitten en mem te voorkomenbranen. Bovendien, de OMV wordt gebruikt bij stimulatie van de gastheercellen te worden bepaald volgens de hoeveelheid OMV aanwezig bij in vivo infectie, maar verzekert een lage cytotoxiciteit. Op deze manier, de pathologische rol van OMV's, hun impact op inter-soorten communicatie en gastheer-pathogeen interacties kunnen worden onderzocht.

Om de rol van L. pneumophila OMV longontsteking verdere studie, zijn gestandaardiseerd OMV preparaten voldoende opbrengst en vergelijkbare infectie experimenten nodig. Dit protocol zal helpen isoleringsprocedures standaardiseren en OMV studies uit te breiden tot andere Gram-negatieve bacteriën en andere gastheercellen. Daarnaast zal het onderzoek profiteren van de gedetailleerde in vitro kennis, die kan worden gebruikt voor experimenten in vivo instellingen verlengen. In de toekomst kan dit protocol worden uitgebreid tot de isolatie van OMV's uit primaire biologisch materiaal, zoals serum of bronchoalveolaire lavleeftijd vloeistof, om inzicht te krijgen in de samenstelling van OMV's vrijgegeven onder fysiologische omstandigheden. Dit zal helpen om belangrijke parameters van OMV samenstelling bepalen en de eigenschappen van in vitro -generated OMV begrijpen.

Acknowledgments

Wij danken Prof. Dr. Markus Schnare voor het verstrekken van ons met TLR2 - / - en TLR2 / 4 - / - muizen en Prof. Dr. Carsten Kirschning voor TRIF / MyD88 - / - muizen. Delen van dit werk werd gefinancierd door Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) en Hessische Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), allemaal BS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5% sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby --- --- kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA --- --- kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM --- --- kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7, (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74, (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181, (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19, (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154, (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65, (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275, (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29, (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437, (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23, (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12, (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13, (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74, (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76, (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82, (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78, (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12, (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304, (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61, (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71, (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73, (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11, (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195, (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. Novartis.com. Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).
<em>Legionella pneumophila</em> Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).More

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter