Her beskriver vi oprensningen af Legionella pneumophila (L. pneumophila) ydre membranvesikler (OMV'er) fra flydende kulturer. Disse oprensede vesikler anvendes derefter til behandling af makrofager til at analysere deres pro-inflammatoriske potentiale.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Bakterier kan udskille virulensfaktorer via forskellige mekanismer 1. Udover de kendte sekretoriske systemer, kan gramnegative bakterier udveksle information og levere virulensfaktorer via ydre membranvesikler (OMV'er), som er små, sfæroide vesikler 10-300 nm i diameter, og med en dobbeltlagede membran struktur. De udskilles i forskellige vækstmiljøer (flydende kultur, fast kultur, og biofilm) og i alle vækstfaser 2, 3. OMV'er er et vigtigt middel til transport (fx for proteiner, adhæsiner, toksiner, og enzymer, samt for LPS, som findes på OMV overflade) 4. Den intraluminale gods er beskyttet mod proteolytisk nedbrydning, så det er i stand til at handle over lange afstande, og vesiklerne kan findes i kropsvæsker og fjerntliggende organer 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan ikke kun anerkendes og optages af eukaryote celler 9, 10, men de er desuden i stand til at lette bindingen af bakterier og deres invasion i værtsceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) er en Gram-negativ bakterie, der kan frigive OMV'er. I den menneskelige lunge, det inficerer primært alveolære makrofager, selv om dens naturlige vært er ferskvand amøber 11. En L. pneumophila infektion kan forårsage legionærsyge, en alvorlig form for lungebetændelse 12. Det blokerer fagosom-lysosom fusion i værtscellen. Det rekrutterer også vært organeller, hvorved en replikering niche, den legionella-holdige vakuolen (LCV), dannes 13, 14. Lysosomal nedbrydning inhiberes ikke kun af effektor protein translocation via type IV sekretion system, men også ved udgivelsen af OMV'er 15.
Oprensningen af OMV'er fra bakteriekulturer er nødvendig for at analysere deres virkning på recipientceller. Tidligere undersøgelser fokuseret på indholdet af L. pneumophila OMV'er protein og om indflydelsen af vesiklerne på alveolære epitelceller 16, men senere undersøgelser med humane lunge vævstransplantater viste, at L. pneumophila OMV'er optages af alveolære makrofager 17.
Som OMV'er tilstedeværende patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) og andre bakterielle antigener, kan de have en indvirkning på infektion af eukaryote celler og modulere værtens immunrespons 18. L. pneumophila OMV'er hurtigt fusionerer med værten cellemembraner og desuden de aktiverer membranøs TLR2 19. Da det er kendt, at L. pneumophILA OMV'er stimulere makrofager og epitelceller i en pro-inflammatorisk måde 16, 17, analyserede vi virkningerne af OMV'er på infektionen proces i humane og murine makrofager.
Her beskriver vi en protokol for dyrkning af L. pneumophila i flydende kultur at isolere de secernerede OMV'erne ved differential ultracentrifugering og at vurdere virkningen af de blærer på eukaryote værtsceller, enten direkte eller efter en infektion.
De OMV'erne af bakterielle patogener og virkningen af disse membranvesikler på deres målceller øjeblikket intensivt undersøgt. F.eks Clostridium perfringens-afledte OMV'er inducere cytokinsekretion i makrofager, kan B-lymfocytter aktiveres af OMV'er fra Borrelia burgdorferi, og Helicobacter pylori -released membranvesikler kan handle på gastriske epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, et intracellulært patogen, som kan fremkalde en alvorlig form for atypisk pneumoni, også frigiver OMV'er, der er i stand til at aktivere lungeepitelceller og makrofager 16, 19. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for lille skala isolering af L. pneumophila OMV'er fra flydende kultur for at studere potentielle rolle OMV'er i lungebetændelse. Det er afgørende at arbejde under sterile conditioner og for at udelukke kontaminering fra andre bakterier, for at opnå en ren L. pneumophila-afledt OMV præparat. Isoleringen af OMV'er omfatter et filtreringstrin gennem 0,22 um porer for at forhindre forurening af det opnåede OMV pellet med L. pneumophila, selvom dette reducerer OMV udbytte, eftersom de største OMV'erne er tabt ved denne filtreringstrin.
Desuden testede vi svaret fra humane og murine makrofager til disse isolerede vesikler og inficerede celler med L. pneumophila til tættere tilnærme situationen i legionella-pneumoni, hvor OMV'er frigives inde i LCV af ekstracellulære bakterier 15. De anvendte OMV doser er blevet estimeret i henhold til den frie OMV beløb i en in vitro-infektion af humane makrofager efter 24 timer inkubation (beskrevet i referenceeksempel 20). Til stimulering af andre recipientceller eller in vivo forsøg,andre OMV doser kan være nødvendigt, og skal etableres. Analysen af effekten af L. pneumophila OMV'er repræsenterer et avancement til protokollen beskrevet af Jager og Steinert 24.
Her, PMA-differentierede THP-1-celler tjener som en model for alveolære makrofager på grund af den begrænsede tilgængelighed af primære humane materiale. Tilsætningen af PMA adskiller de monocytiske THP-1 celler i makrofag-lignende celler 25. Endvidere er de en velkendt model cellelinie til L. pneumophila undersøgelser 26. Ud over dette human monocytisk cellelinie, der anvendes mBMDM celler. mBMDM er bredt accepteret for studiet af virkningerne af L. pneumophila 27, 28, 29. Muligheden for at anvende genetiske udslagsblanketter til forskellige TLRs eller andre proteiner gør dem et værdifuldt værktøj til at studere OMV effekter. I ordis for at sænke mængden af mus pr eksperimentet mBMDM anvendes i stedet for alveolære makrofager skyldes begrænsningerne af makrofager. Vigtige eksperimenter kan kræve alveolære makrofager til validering.
Udover den heri beskrevne protokol af ultracentrifugering til oprensning OMV'er, er det muligt at udføre en densitetsgradientcentrifugering, som er inkluderet i protokollen af Chutkan et al. 30. Dette kunne forbedre renheden af det opnåede OMV forberedelse og reducere mængden af co-oprenset protein aggregater, flagellin og LPS. Renheden af det opnåede OMV præparat kan analyseres ved transmissionselektronmikroskopi eller ved nanopartikel sporing analyse som et ekstra trin i kvalitetskontrol. Dette kan give et yderligere middel til kvantificering, ud over protein måleprocedure præsenteres her. Eventuelt kan koncentrationen LPS analyseres af en limulus amebocytlysat test. Hvis OMV Udbyttet er lavt, enyderligere koncentreringstrin via centrifugalfiltre kunne udføres, som ikke blev gjort her. Hvis udbyttet var lavere end forventet, blev OMV'erne kasseret.
Som en del af den løbende indsats for at belyse de biologiske mekanismer og funktioner bag OMV'er, kunne indflydelse forskellige stress betingelser på OMV produktion testes. Næringsstof afsavn, kan ændringer i inkubationstemperatur, eller udsættelse for skadelige stoffer have en indvirkning på OMV sekretion 31. Mulige stress betingelser diskuteres i protokollen af Klimentova og Stulik 32. Desuden kunne hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter genereres. De forskellige OMV-præparater kan derefter analyseres i infektionseksperimenter med makrofager, humane lunge vævseksplantater (beskrevet i Henvisning 17), eller endda i in vivo modeller. Udover rolle OMV'er i medfødte immunsystem signalering, deres indflydelse i bakteriel kommunikationkan behandles eksperimentelt. Desuden kan virkningen af forskellige medfødte immunsystem signalleringskaskader analyseres ved anvendelse af murine knockout-celler eller frembringelsen af CRISPR / Cas9 knockouts i humane cellelinier. Denne grundforskning i OMV'er vil bistå med udviklingen af nye vaccine strategier, som allerede eksisterer for meningitis B transmitteres af Neisseria meningitides 33.
Med udgangspunkt i protokollen om OMV isolering og karakterisering, kan man anvende dette til andre Gram-negative bakterier og andre værtsceller; skal den kun justeres til væksten af bakterierne i flydende kultur. Protokollen publiceret af Chutkan et al. indeholder detaljerede oplysninger om den generation af OMV'er fra Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bør ikke nå den sene stationære fase for at undgå stigninger i lyserede bakterier og forurenende proteiner og membraner. Derudover skal bestemmes i henhold til den mængde OMV'er stede under in vivo infektioner, mens du stadig sikrer en lav cytotoksicitet OMV dosis anvendt til stimulering af værtscellerne. På denne måde, den patologiske rolle OMV'er, deres indvirkning på inter-art kommunikation, og vært-patogen interaktioner kunne undersøges.
For yderligere at undersøge, hvilken rolle af L. pneumophila OMV'er i lungebetændelse, er der behov for standardiserede OMV præparater med tilstrækkelige udbytter og sammenlignelige infektion eksperimenter. Denne protokol vil bidrage til at standardisere isoleringsmetoder og at udvide OMV studier til andre Gram-negative bakterier og andre værtsceller. Herudover vil forskning drage fordel af den detaljerede in vitro viden, som kan bruges til at udvide forsøgene for in vivo indstillinger. I fremtiden kan denne protokol udvides til isolering af OMV'er fra primær biologisk materiale, såsom serum eller bronchoalveolær lowalder væske, at få indsigt i sammensætningen af OMV'er frigivet under fysiologiske betingelser. Dette vil bidrage til at bestemme de vigtigste parametre for OMV sammensætning og til at forstå egenskaber in vitro -generated OMV'er.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Dr. Markus Schnare for at give os TLR2 – / – og TLR2 / 4 – / – mus og Prof. Dr. Carsten Kirschning for Trif / MyD88 – / – mus. Dele af dette arbejde blev finansieret af Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), og Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003), http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alle til BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |