Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

doi: 10.3791/55146 Published: February 22, 2017

Summary

Her beskriver vi oprensningen af Legionella pneumophila (L. pneumophila) ydre membranvesikler (OMV'er) fra flydende kulturer. Disse oprensede vesikler anvendes derefter til behandling af makrofager til at analysere deres pro-inflammatoriske potentiale.

Introduction

Bakterier kan udskille virulensfaktorer via forskellige mekanismer 1. Udover de kendte sekretoriske systemer, kan gramnegative bakterier udveksle information og levere virulensfaktorer via ydre membranvesikler (OMV'er), som er små, sfæroide vesikler 10-300 nm i diameter, og med en dobbeltlagede membran struktur. De udskilles i forskellige vækstmiljøer (flydende kultur, fast kultur, og biofilm) og i alle vækstfaser 2, 3. OMV'er er et vigtigt middel til transport (fx for proteiner, adhæsiner, toksiner, og enzymer, samt for LPS, som findes på OMV overflade) 4. Den intraluminale gods er beskyttet mod proteolytisk nedbrydning, så det er i stand til at handle over lange afstande, og vesiklerne kan findes i kropsvæsker og fjerntliggende organer 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan ikke kun anerkendes og optages af eukaryote celler 9, 10, men de er desuden i stand til at lette bindingen af bakterier og deres invasion i værtsceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) er en Gram-negativ bakterie, der kan frigive OMV'er. I den menneskelige lunge, det inficerer primært alveolære makrofager, selv om dens naturlige vært er ferskvand amøber 11. En L. pneumophila infektion kan forårsage legionærsyge, en alvorlig form for lungebetændelse 12. Det blokerer fagosom-lysosom fusion i værtscellen. Det rekrutterer også vært organeller, hvorved en replikering niche, den legionella-holdige vakuolen (LCV), dannes 13, 14. Lysosomal nedbrydning inhiberes ikke kun af effektor protein translocation via type IV sekretion system, men også ved udgivelsen af OMV'er 15.

Oprensningen af ​​OMV'er fra bakteriekulturer er nødvendig for at analysere deres virkning på recipientceller. Tidligere undersøgelser fokuseret på indholdet af L. pneumophila OMV'er protein og om indflydelsen af vesiklerne på alveolære epitelceller 16, men senere undersøgelser med humane lunge vævstransplantater viste, at L. pneumophila OMV'er optages af alveolære makrofager 17.

Som OMV'er tilstedeværende patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) og andre bakterielle antigener, kan de have en indvirkning på infektion af eukaryote celler og modulere værtens immunrespons 18. L. pneumophila OMV'er hurtigt fusionerer med værten cellemembraner og desuden de aktiverer membranøs TLR2 19. Da det er kendt, at L. pneumophILA OMV'er stimulere makrofager og epitelceller i en pro-inflammatorisk måde 16, 17, analyserede vi virkningerne af OMV'er på infektionen proces i humane og murine makrofager.

Her beskriver vi en protokol for dyrkning af L. pneumophila i flydende kultur at isolere de secernerede OMV'erne ved differential ultracentrifugering og at vurdere virkningen af de blærer på eukaryote værtsceller, enten direkte eller efter en infektion.

Protocol

1. Forbered Medium og agarplader

  1. Forbered 1 L bouillon medium (YEB). Opløs 10 g ACES og 10 g gærekstrakt i 900 ml destilleret vand. PH justeres til 6,9 med KOH (5 N). Tilsæt 10 ml L-cystein (0,4 g i 10 ml destilleret vand) og 10 ml Fe (NO3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destilleret vand). Fyld op til 1 l med destilleret vand og filtreres sterilisere opløsningen (porestørrelse: 0,22 um). Opbevares ved 4 ° C.
  2. Forbered bufferet trækul gærekstrakt (BCYE) agarplader. Opløs 10 g ACES og 10 g gærekstrakt i 900 ml destilleret vand. PH justeres til 6,9 med KOH (5 N). Tilsættes 15 g agar og 2,5 g aktivt kul. Fyld op til 1 l med destilleret vand og autoklave.
    1. Tilsæt 10 ml L-cystein (0,4 g i 10 ml destilleret vand) og 10 ml Fe (NO3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destilleret vand, både steriliseret ved filtrering gennem 0,22 umporer) til afkølet BCYE (ca. 50 ° C). Hæld plader og opbevares ved 4 ° C.

2. Dyrk L. pneumophila

  1. Spred L. pneumophila stamme Corby (vildtype, WT) på BCYE agarplader og inkubere dem ved 37 ° C i 3 dage. Pode 10 ml YEB ved en OD 600 på 0,3 med L. pneumophila fra forkultur plade; inkubere bakterierne ved 37 ° C på en rotationsryster (150 rpm) i 6 timer.
  2. Verificer renheden af ​​flydende kultur ved at sprede 100 pi af suspensionen på en blodagarplade. Inkuber natten over ved 37 ° C.
  3. Tilsæt resterende flydende kultur til 90 ml frisk YEB medium og inkuberes på en roterende rysteapparat (37 ° C og 150 rpm) for at opnå en OD600 på 3,0-3,5, hvilket tager ca. 16-20 timer.

3. Forbered og kvantificere L. pneumophila OMV'er

BEMÆRK: Udfør alle følgende centrifugering trins under sterile betingelser og ved 4 ° C.

  1. Centrifugeres flydende kultur ved 4.000 xg i 20 min for at pelletere bakterierne. Overfør supernatanten til friske centrifugerør, kassere den bakterielle pellet, og gentag centrifugering (4000 xg i 20 min). Gentag dette trin én gang.
  2. Sterilt filter den resterende supernatant to gange (porestørrelse: 0,22 um). Overfør bakteriefrit supernatant til ultracentrifugerør og ultracentrifuge ved 100.000 xg i 3 timer.
  3. Dekanteres og kassér den. Resuspender OMV pellet i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) og ultracentrifuge (100.000 x g i 3 timer) for at fjerne kontaminerende proteiner og LPS.
  4. Supernatanten fjernes, og resuspender OMV pellet i 500 pi sterilt PBS. Streak 20 pi på en blodagarplade og på en BCYE agarplade at udelukke bakteriel kontaminering af de fremstillede vesikler. Inkubér blodagarpladen natten over, og BCYE agarplade i 3 dage (begge ved 376; C).
  5. Kvantificere proteinmængden opnået fra OMV præparat under anvendelse af en bicinchoninsyre assay ifølge producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Koncentrationen af 100 ml L. pneumophila kultur er sædvanligvis 1 ug / uL. Opbevar forberedt og kvantificerede OMV'er ved -20 ° C.

4. Pre-treat makrofager

  1. Forbered THP-1-celler.
    BEMÆRK: THP-1 er en monocytisk cellelinie afledt af en leukæmi patient.
    1. Tilføj 2x10 5 THP-1-celler per 24 brønde og differentiere dem ved tilsætning af 20 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) i makrofag-lignende celler. Inkuberes i 24 timer ved 37 ° C.
    2. Erstatte mediet med 500 pi frisk medium og inkuberes i yderligere 24 timer; den optimale medium til THP-1-celler består af RPMI 1640 med høj glucose suppleret med 10% føtalt kalveserum.
  2. Isolere de murine knoglemarvafledte makrofager (mBMDM), som beskrevet i Sening 20.
  3. Treat THP-1-afledte makrofager eller mBMDM med OMV'er.
    1. Optø OMV'erne fremstillet i trin 3 og tilføj dem efter deres proteinmængden (0,1, 1 og 10 ug / ml) til den humane eller murine makrofager. Inkubér makrofager med OMV'er ved 37 ° C i mindst 20 timer. Brug supernatanten til ELISA eller gå videre med trin 5.

5. inficere makrofager og Vurdere Bakteriel Replication med en kolonidannende enhed (CFU) Indhold

  1. Brug L. pneumophila fra trin 2.1, forbehandlet THP-1 celler eller mBMDM fra trin 4.3, og ikke forbehandlet makrofager som kontroller (2x10 5/24 brønde). Du må ikke udveksle mediet.
  2. Infect THP-1-celler med L. pneumophila Corby WT og mBMDM med en flagellin-mangler mutant af L. pneumophila Corby (begge med en infektionsmultiplicitet (MOI) på 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 brønde) og inkuberes i 24 og 48 t. Forbered both L. pneumophila Corby (WT eller flagellin-mangler mutant) som beskrevet i trin 2.1.
  3. Lysere cellerne i deres medium ved tilsætning af saponin (slutkoncentration: 0,1%) og inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
  4. Resuspendere bakterierne ved pipettering og overfør suspensionen til en reaktionsbeholder. Forbered serielle fortyndinger af L. pneumophila holdige medier i sterilt PBS.
  5. Streak 50 pi af de krævede fortyndinger på BCYE agarplader og inkuberes i 3 dage ved 37 ° C.
  6. Visuelt tælle de dannede kolonier. Beregn CFU ligning 1 Normalisere CFU tæller resultatet til ikke forbehandlet men inficerede makrofager, som indstilles til 100%.

Representative Results

Forsøgsopstillingen at fremstille L. pneumophila OMV'er og analysere deres indflydelse på den pro-inflammatoriske reaktion af makrofager efter infektion er vist i figur 1. Den pro-inflammatoriske potentiale af de fremstillede OMV'er kan analyseres på PMA-differentierede THP-1-celler, som er vist i figur 2. THP-1-celler reagerer med en tids- og dosisafhængig forøgelse af IL-8 og IL-6-sekretion. Derudover kan indflydelsen af forskellige TLRs på L. pneumophila OMV anerkendelse analyseres ved hjælp mBMDM fra forskellige genetiske baggrunde, som forelagt af CXCL1 ELISA i figur 3. mBMDM fra WT mus udskilte CXCL1 efter OMV stimulering, mens mBMDM TLR2 / 4 - / - udskilles betydeligt mindre. For at undersøge virkningen af L. pneumophila OMV'er om bakteriel replikation i THP-1 makrofager, celler blev præ-inkuberes med OMV'er og derefter yderligere inficeretmed L. pneumophila (figur 4 A). Præ-stimulation af THP-1-afledte makrofager reducerer først det bakterielle replikation efter 24 timers infektion, men den fører til en fordobling i CFU-tal i den senere tidspunkt (48 timer pi). Virkningen af Toll-lignende receptor (TLR) signalering på OMV anerkendelse efter infektion af makrofager kan vurderes ved mBMDM, som beskrevet i figur 4 B. Bakterielle replikering stiger med tifold i mBMDM fra WT dyr efter OMV præinkubation, mens TLR2 - / - og Trif / MyD88 - / - celler ikke udviser denne stigning i L. pneumophila replikation.

figur 1
Figur 1: Eksperimentel procedure. (A) L. pneumophila Corby WT fra 10-cm BCYE agarplader anvendes til at pode en lille flydende kultur (10 ml), som overføres til 90 ml frisk YEBmedium efter 6 timer. En lille volumen også udpladet på en blodagarplade at kontrollere for renhed. Bakterier inkuberes ved 37 ° C, indtil tidlig stationær fase (OD600 = 3,0-3,5). (B) Den flydende kultur centrifugeres og sterilfiltreret at fjerne bakterierne. Legionella -fri supernatant derefter ultracentrifugeret at opnå en OMV pellet, som resuspenderes i PBS og ultracentrifugeret igen. De isolerede vesikler resuspenderes, kontrolleres for renhed og kvantificeret for proteinmængden. Skalaen søjle repræsenterer 2,5 cm. (C) Human eller murine makrofager stimuleres med de kvantificerede OMV'er. Cellekultursupernatanten kan anvendes til ELISA eller makrofager kan inficeres med L. pneumophila at bestemme bakteriel replikation ved CFU assay på 10 cm BCYE agarplader. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Pro-inflammatoriske aktivering af THP-1-celler af L. pneumophila OMV'er. (A) Her er monocytiske THP-1-cellelinien anvendes som model for alveolære makrofager. PMA-differentierede THP-1-celler blev behandlet med stigende doser af L. pneumophila OMV'er (0,01-25 ug / ml) i 24 og 48 timer, hhv. Den cellefrie supernatant blev anvendt til IL-8 ELISA. Middelværdierne for tre uafhængige forsøg ± SEM er vist. THP-1-celler reagerede på så lidt som 0,01 ug / ml L. pneumophila OMV'er med signifikant IL-8 sekretion, som var tids- og dosisafhængig. (B) L. pneumophila OMV'er (0,1-10 ug / ml) blev anvendt til at stimulere PMA-differentierede THP-1-celler. Supernatanten blev opsamlet efter 24 og 48 timers inkubation, og den frigivne IL-6 blev målt i supernatanten via ELISA. Middelværdierne for tre uafhængige forsøg ± SEM er vist. THP-1-celler udskilte signifikante mængder af IL-6, selv med den laveste dosis af OMV'er (0,1 ug / ml). Sekretionen af ​​IL-6 steg med stigende OMV doser og med længere inkuberingstider. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 og ** p <0,01 sammenlignet med det tilsvarende 0 ug / ml OMV. Genoptrykt med tilladelse fra reference 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: pro-inflammatoriske aktivering af makrofager afhænger TLR2 / 4. mBMDM fra WT og TLR2 / 4 - / - mus blev inkuberet med L. pneumophila OMV'er (0,1 eller 1 ug / ml). CXCL1 sekretion blev analyseret ved ELISA efter 24 og 48 t. Detmiddelværdier ± SEM for tre uafhængige eksperimenter er vist. mBMDM fra WT mus reagerede med en dosisafhængig CXCL1 sekretion efter L. pneumophila OMV inkubation. TLR2 / 4 - / - mBMDM udskilles betydeligt mindre CXCL1 forhold til WT mBMDM, og denne sekretion steg ikke dosisafhængigt. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 sammenlignet med det tilsvarende 0 ug / ml OMV; #p <0,05 sammenlignet med en lige så behandlet WT prøve. Genoptrykt med tilladelse fra reference 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: L. pneumophila OMV præinkubation øger bakterielle replikation i makrofager. (A) Differentierede THP-1-celler blev præinkuberet med OMV'er (0,1, 1 eller 10 μG / ml) eller LPS / IFN-γ (200 ng / ml hver) eller forblev ubehandlede for kontrol. Efter præinkubation (20 timer), blev THP-1-celler inficeret med L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) i 2, 24 og 48 t. THP-1-celler blev lyseret ved tilsætning af saponin, og bakterierne blev udpladet på BCYE agarplader. CFU'er blev beregnet i forhold til 0 ug / ml OMV efter hver tidspunkt. Søjlerne repræsenterer middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg, som hver blev udført tekniske dubletter. Der var ingen forskelle i bakteriel optagelse (2 timer efter infektion (pi)) i sammenligning med ikke forbehandlet celler. blev bestemt Ændringer i bakteriel replikation efter 24 og 48 timer, hhv. LPS / IFN-γ forbehandlede THP-1-celler viste en reduktion i bakteriel belastning 24 timer pi Dette blev også observeret dosisafhængig for L. pneumophila OMV forbehandlede celler. På det senere tidspunkt (48 timer pi), viste OMV forbehandlede THP-1-celler en fordobling i L. pneumophila redelsen, mens LPS / IFN-y forbehandlede makrofager viste en yderligere reduktion af bakteriel belastning. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 og ** p <0,01 sammenlignet med det tilsvarende 0 ug / ml OMV. (B) mBMDM fra mus med forskellige genetiske baggrunde (WT, TLR2 - / -, og Trif / MyD88 - / -) blev præinkuberet med 0,1 ug / ml L. pneumophila OMV'er i 20 timer og blev derefter inficeret med en flagellin- deficient mutant af L. pneumophila Corby (MOI 0,5) i 48 timer. mBMDM blev lyseret ved tilsætning af saponin, og Legionella blev udpladet på BCYE agarplader. CFU blev beregnet i forhold til 0 ug / ml OMV, angivet ved den fuldt optrukne linie. Søjlerne repræsenterer middelværdier ±± SEM for tre uafhængige forsøg, som hver blev udført in duplo. mBMDM fra WT mus viste en stigning i L. pneumophila replikation efter OMV forbehandling. TLR2 - / - makrofager viste signifikant reduceret - / - mBMDM. Statistik: Mann-Whitney-test; p <0,05 i forhold til WT prøven. Genoptrykt med tilladelse fra reference 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De OMV'erne af bakterielle patogener og virkningen af ​​disse membranvesikler på deres målceller øjeblikket intensivt undersøgt. F.eks Clostridium perfringens-afledte OMV'er inducere cytokinsekretion i makrofager, kan B-lymfocytter aktiveres af OMV'er fra Borrelia burgdorferi, og Helicobacter pylori -released membranvesikler kan handle på gastriske epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, et intracellulært patogen, som kan fremkalde en alvorlig form for atypisk pneumoni, også frigiver OMV'er, der er i stand til at aktivere lungeepitelceller og makrofager 16, 19. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for lille skala isolering af L. pneumophila OMV'er fra flydende kultur for at studere potentielle rolle OMV'er i lungebetændelse. Det er afgørende at arbejde under sterile conditioner og for at udelukke kontaminering fra andre bakterier, for at opnå en ren L. pneumophila-afledt OMV præparat. Isoleringen af OMV'er omfatter et filtreringstrin gennem 0,22 um porer for at forhindre forurening af det opnåede OMV pellet med L. pneumophila, selvom dette reducerer OMV udbytte, eftersom de største OMV'erne er tabt ved denne filtreringstrin.

Desuden testede vi svaret fra humane og murine makrofager til disse isolerede vesikler og inficerede celler med L. pneumophila til tættere tilnærme situationen i legionella-pneumoni, hvor OMV'er frigives inde i LCV af ekstracellulære bakterier 15. De anvendte OMV doser er blevet estimeret i henhold til den frie OMV beløb i en in vitro-infektion af humane makrofager efter 24 timer inkubation (beskrevet i referenceeksempel 20). Til stimulering af andre recipientceller eller in vivo forsøg,andre OMV doser kan være nødvendigt, og skal etableres. Analysen af effekten af L. pneumophila OMV'er repræsenterer et avancement til protokollen beskrevet af Jager og Steinert 24.

Her, PMA-differentierede THP-1-celler tjener som en model for alveolære makrofager på grund af den begrænsede tilgængelighed af primære humane materiale. Tilsætningen af PMA adskiller de monocytiske THP-1 celler i makrofag-lignende celler 25. Endvidere er de en velkendt model cellelinie til L. pneumophila undersøgelser 26. Ud over dette human monocytisk cellelinie, der anvendes mBMDM celler. mBMDM er bredt accepteret for studiet af virkningerne af L. pneumophila 27, 28, 29. Muligheden for at anvende genetiske udslagsblanketter til forskellige TLRs eller andre proteiner gør dem et værdifuldt værktøj til at studere OMV effekter. I ordis for at sænke mængden af ​​mus pr eksperimentet mBMDM anvendes i stedet for alveolære makrofager skyldes begrænsningerne af makrofager. Vigtige eksperimenter kan kræve alveolære makrofager til validering.

Udover den heri beskrevne protokol af ultracentrifugering til oprensning OMV'er, er det muligt at udføre en densitetsgradientcentrifugering, som er inkluderet i protokollen af Chutkan et al. 30. Dette kunne forbedre renheden af ​​det opnåede OMV forberedelse og reducere mængden af ​​co-oprenset protein aggregater, flagellin og LPS. Renheden af ​​det opnåede OMV præparat kan analyseres ved transmissionselektronmikroskopi eller ved nanopartikel sporing analyse som et ekstra trin i kvalitetskontrol. Dette kan give et yderligere middel til kvantificering, ud over protein måleprocedure præsenteres her. Eventuelt kan koncentrationen LPS analyseres af en limulus amebocytlysat test. Hvis OMV Udbyttet er lavt, enyderligere koncentreringstrin via centrifugalfiltre kunne udføres, som ikke blev gjort her. Hvis udbyttet var lavere end forventet, blev OMV'erne kasseret.

Som en del af den løbende indsats for at belyse de biologiske mekanismer og funktioner bag OMV'er, kunne indflydelse forskellige stress betingelser på OMV produktion testes. Næringsstof afsavn, kan ændringer i inkubationstemperatur, eller udsættelse for skadelige stoffer have en indvirkning på OMV sekretion 31. Mulige stress betingelser diskuteres i protokollen af Klimentova og Stulik 32. Desuden kunne hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter genereres. De forskellige OMV-præparater kan derefter analyseres i infektionseksperimenter med makrofager, humane lunge vævseksplantater (beskrevet i Henvisning 17), eller endda i in vivo modeller. Udover rolle OMV'er i medfødte immunsystem signalering, deres indflydelse i bakteriel kommunikationkan behandles eksperimentelt. Desuden kan virkningen af ​​forskellige medfødte immunsystem signalleringskaskader analyseres ved anvendelse af murine knockout-celler eller frembringelsen af ​​CRISPR / Cas9 knockouts i humane cellelinier. Denne grundforskning i OMV'er vil bistå med udviklingen af nye vaccine strategier, som allerede eksisterer for meningitis B transmitteres af Neisseria meningitides 33.

Med udgangspunkt i protokollen om OMV isolering og karakterisering, kan man anvende dette til andre Gram-negative bakterier og andre værtsceller; skal den kun justeres til væksten af ​​bakterierne i flydende kultur. Protokollen publiceret af Chutkan et al. indeholder detaljerede oplysninger om den generation af OMV'er fra Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bør ikke nå den sene stationære fase for at undgå stigninger i lyserede bakterier og forurenende proteiner og membraner. Derudover skal bestemmes i henhold til den mængde OMV'er stede under in vivo infektioner, mens du stadig sikrer en lav cytotoksicitet OMV dosis anvendt til stimulering af værtscellerne. På denne måde, den patologiske rolle OMV'er, deres indvirkning på inter-art kommunikation, og vært-patogen interaktioner kunne undersøges.

For yderligere at undersøge, hvilken rolle af L. pneumophila OMV'er i lungebetændelse, er der behov for standardiserede OMV præparater med tilstrækkelige udbytter og sammenlignelige infektion eksperimenter. Denne protokol vil bidrage til at standardisere isoleringsmetoder og at udvide OMV studier til andre Gram-negative bakterier og andre værtsceller. Herudover vil forskning drage fordel af den detaljerede in vitro viden, som kan bruges til at udvide forsøgene for in vivo indstillinger. I fremtiden kan denne protokol udvides til isolering af OMV'er fra primær biologisk materiale, såsom serum eller bronchoalveolær lowalder væske, at få indsigt i sammensætningen af ​​OMV'er frigivet under fysiologiske betingelser. Dette vil bidrage til at bestemme de vigtigste parametre for OMV sammensætning og til at forstå egenskaber in vitro -generated OMV'er.

Acknowledgments

Vi takker Prof. Dr. Markus Schnare for at give os TLR2 - / - og TLR2 / 4 - / - mus og Prof. Dr. Carsten Kirschning for Trif / MyD88 - / - mus. Dele af dette arbejde blev finansieret af Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), og Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003), http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alle til BS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5% sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby --- --- kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA --- --- kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM --- --- kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7, (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74, (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181, (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19, (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154, (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65, (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275, (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29, (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437, (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23, (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12, (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13, (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74, (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76, (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82, (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78, (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12, (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304, (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61, (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71, (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73, (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11, (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195, (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. Novartis.com. Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).
<em>Legionella pneumophila</em> ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).More

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter