Здесь мы опишем очистку легионелл (L. pneumophila) везикул наружной мембраны (OMV , ) из жидких культур. Эти очищенные везикулы затем используются для лечения макрофагов, чтобы проанализировать их провоспалительного потенциала.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Бактерии могут секретировать факторы вирулентности с помощью различных механизмов 1. Помимо хорошо известных секреторных систем, грамотрицательные бактерии могут обмениваться информацией и доставлять факторы вирулентности через везикул наружной мембраны (OMV уровень), которые являются небольшими, сфероида везикулы 10-300 нм в диаметре и с двухслойных мембранной структурой. Они секретируются в различных средах роста (жидкая культура, тверда культура и биопленки) и во всех фазах роста 2, 3. OMV , являются важным средством передвижения (например, для белков, адгезинов, токсинов и ферментов, а также для LPS, который находится на поверхности OMV) 4. Внутриполостной груз защищен от протеолитической деградации, так что он способен действовать на большие расстояния, и везикулы можно найти в биологических жидкостях и отдаленных органах 5, 6,"Xref"> 7, 8. Они не могут быть признаны только и поглощается эукариотических клеток 9, 10, но , кроме того, они способны облегчить связывание бактерий и их вторжения в клетки – хозяева 4. Легионелл (L. pneumophila) является грамотрицательная бактерия , которая может освободить OMV уровень . В легких человека, он в первую очередь поражает альвеолярными макрофагами, хотя ее естественный хозяин пресноводные амебы 11. Pneumophila инфекция L. может вызвать болезнь легионеров, тяжелая форма пневмонии 12. Он блокирует фагосоме-лизосом слитый в клетке-хозяине. Он также вербует принимающих органелл, в результате чего ниша репликации, Legionella катио- вакуоль (LCV), образуется 13, 14. деградация Лизосомные тормозится не только эффекторные белка TRAnslocation через систему секреции типа IV, но и выпуском OMV , 15.
Очистка OMV, от бактериальных культур требуется проанализировать их влияние на клетки-реципиенты. Более ранние исследования были сосредоточены на содержание белка L. pneumophila OMV , и о влиянии везикул на альвеолярных эпителиальных клетках 16, но позже исследования с трансплантатами человеческой легочной ткани показало , что L. pneumophila OMVS поглощаются альвеолярными макрофагами 17.
Как OMV уровень нынешних молекулярных моделей патоген-ассоциированных (PAMPs) и другие бактериальные антигены, они могут оказывать воздействие на инфекцию эукариотических клеток и модулировать иммунный ответ на 18 – хозяина. L. pneumophila OMVS быстро сливаться с клеточными мембранами хозяина и, кроме того, они активируют перепончатый TLR2 19. Как известно , что Л. pneumophILA OMVS стимулируют макрофаги и эпителиальные клетки в провоспалительных образом 16, 17, мы проанализировали влияние OMV , на инфекционный процесс в человеческих и мышиных макрофагов.
Здесь мы опишем протокол для культивирования L. pneumophila в жидкой культуре , чтобы изолировать секретируемый OMVS с помощью дифференциального ультрацентрифугирования и для оценки влияния везикул на эукариотических клеток – хозяев, либо непосредственно или после инфекции.
В OMVS бактериальных патогенов и влияния этих мембранных везикул на их клетки-мишени в настоящее время интенсивно изучаются. Например, Clostridium Perfringens -derived OMVS индуцировать секрецию цитокинов в макрофагах, В – лимфоциты могут быть активированы с помощью OMV , от Borrelia burgdorferi, и Helicobacter Pylori -released мембранные везикулы могут действовать на эпителиальных клеток желудка 21, 22, 23. L. pneumophila, внутриклеточным патогеном , который может вызвать тяжелую форму атипичной пневмонии, также выпускает OMVS, которые способны активировать легких эпителиальные клетки и макрофаги 16, 19. Здесь мы представляем подробный протокол для малой изоляции L. pneumophila OMV , из жидкой культуры для изучения потенциальной роли OMV , при пневмонии. Крайне важно, чтобы работать в стерильных Conditионы и , чтобы исключить загрязнение от других бактерий , с тем , чтобы получить чистый L. pneumophila -derived препарат OMV. Изоляция OMV уровень включает стадию фильтрации через поры 0,22 мкм , с тем , чтобы предотвратить загрязнение полученного OMV окатышей с L. pneumophila, хотя это снижает выход OMV, так как большая OMVS теряются при этом стадии фильтрации.
Кроме того, мы проверили реакцию человека и мышиных макрофагов к этим изолированных везикул и инфицированных клеток с L. pneumophila более тесно приближают ситуацию в Legionella пневмонии, где OMV , высвобождаются внутри LCV внеклеточными бактериями 15. Подсчитано Используемые дозы OMV имеют в соответствии с количеством свободного OMV в инфекции в пробирке макрофагах человека после 24 ч инкубации ( как описано в Сравнительном 20). Для стимуляции других клеток реципиента или в экспериментах естественных условиях,другие дозы OMV могут быть необходимы и должны быть установлены. Анализ влияния L. pneumophila OMV , представляет собой продвижение к протоколу , описанному Jager и Steinert 24.
Здесь РМА-дифференцированные клетки ТНР-1 служат в качестве модели для альвеолярных макрофагов из-за ограниченной доступности первичного человеческого материала. Добавление РМА отличает моноцитов ТНР-1 в макрофаг-подобных клеток 25. Кроме того, они хорошо известная клеточная линия модель для L. pneumophila исследования 26. Помимо этой человеческой линии моноцитов клеток, используются клетки mBMDM. mBMDM широко приняты для изучения эффектов L. pneumophila 27, 28, 29. Показана возможность использования генетических нокаутов для различных TLRs или других белков делает их ценным инструментом для изучения эффектов OMV. В Ordэр, чтобы снизить количество мышей на эксперимент, mBMDM используются вместо альвеолярных макрофагов из-за ограничений макрофагов. Ключевые эксперименты могут потребовать альвеолярные макрофаги для проверки.
Кроме того, в данном документе описанный протокол ультрацентрифугирования для очистки OMVS, можно выполнить центрифугирования в градиенте плотности, который включен в протокол по Chutkan соавт. 30. Это может улучшить чистоту полученного препарата OMV и уменьшить количество коинтегри- очищено белковых агрегатов, флагеллином и LPS. Чистота полученного препарата OMV можно анализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии или путем анализа наночастицами отслеживания в качестве дополнительного шага в области контроля качества. Это может обеспечить дополнительные средства количественной оценки, помимо процедуры измерения белка, представленного здесь. Необязательно, концентрация LPS, могут быть проанализированы с помощью теста с лизатом Лаймулус амебоцит. Если выход OMV низкий,дополнительная стадия концентрирования с помощью центробежных фильтров могут быть выполнены, что не было сделано здесь. Если доходность была ниже, чем ожидалось, были отброшены в OMVS.
В рамках продолжающихся усилий по выяснению биологических механизмов и функций позади OMV, влияние различных стрессовых условиях на производстве OMV может быть проверена. Питательные лишение, изменения температуры инкубации, или воздействие вредных веществ может оказать влияние на секрецию OMV 31. Возможные стрессовые условия обсуждаются в протоколе по Klimentová и Стулик 32. Кроме того, гипер- или hypovesiculating pneumophila мутанты L. могли быть получены. Различные препараты OMV могут быть затем проанализированы в экспериментах с макрофагами инфекции, эксплантатах человеческих тканей легкого ( как описано в Сравнительном 17), или даже в моделях in vivo на . К тому же роль OMV, в врожденной иммунной сигнализации, их влияние в бактериальной коммуникацииможет быть экспериментально решены. Кроме того, влияние различных врожденных иммунных сигнальных каскадах могут быть проанализированы с использованием мышиных клеток нокаутных или генерации CRISPR / cas9 нокаутов в клеточных линиях человека. Это фундаментальные исследования в OMV , будет оказывать помощь в разработке новых стратегий вакцин, которые уже существуют для менингитом B переданной Neisseria менингитов 33.
Исходя из протокола о OMV изоляции и определения характеристик, можно применить это к другим грамотрицательных бактерий и других клеток-хозяев; она должна быть приспособлена к росту бактерий в жидкой культуре только. Протокол опубликованных Chutkan и др. предоставляет подробную информацию о генерации OMV , из кишечной палочки и синегнойной палочки 30. Культура не должна достигнуть поздней стационарной фазы, чтобы избежать увеличения лизированных бактерий и загр зн ющие протеины и MEMбран. Кроме того, доза ОМВ используется для стимуляции клеток – хозяев должно быть определено в соответствии с количеством OMVS , присутствующих во время инфекции в естественных условиях, в то время как по- прежнему обеспечивает низкий уровень цитотоксичности. Таким образом, патологическая роль OMV уровень их влияние на межвидовой связи, и хозяин-патоген взаимодействий могут быть рассмотрены.
Для дальнейшего изучения роли L. pneumophila OMV , при пневмонии, необходимы стандартизированные препараты OMV с достаточными выходами и сопоставимыми экспериментов инфекции. Этот протокол поможет стандартизировать процедуры изоляции и расширить исследования OMV для других грамотрицательных бактерий, а также других клеток-хозяев. Кроме того, исследования выиграют от детальное экстракорпоральное знаний, которые могут быть использованы для расширения экспериментов для установок в естественных условиях. В дальнейшем, этот протокол может быть продлен до выделения OMV, из первичного биологического материала, таких как сыворотка или бронхо LAVвозраст жидкости, чтобы получить представление о составе OMV, выпущенном в физиологических условиях. Это поможет определить основные параметры композиции OMV и понять свойства -порожденных OMV , в пробирке.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора доктора Маркуса Schnare за предоставленную нам TLR2 – / – и TLR2 / 4 – / – мышей и профессор д – р Карстен Kirschning для TRIF / MyD88 – / – мышей. Части этой работы была профинансирована Bundesministerium für Bildung унд Forschung (е: био miRSys – ФКЗ 0316175B, E: Med CAPSYS – ФКЗ 01X1304E; http://www.bmbf.de/~~HEAD=dobj), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) и Hessisches Ministerium für Wissenschaft унд Kunst (LOEWE Medical RNomics – ФКЗ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), все БС.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |