Här beskriver vi reningen av Legionella pneumophila (L. pneumophila) yttre membranvesiklar (OMV) från flytande kulturer. Dessa renade vesiklar används sedan för behandling av makrofager för att analysera deras pro-inflammatorisk potential.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Bakterier kan utsöndra virulensfaktorer via olika mekanismer 1. Förutom de välkända sekretoriska system kan gramnegativa bakterier utbyta information och leverera virulensfaktorer via yttre membranvesiklar (OMV), som är små, sfäroida blåsor 10-300 nm i diameter och med en dubbelskiktsmembranstruktur. De utsöndras i en mängd olika tillväxtmiljöer (flytande kultur, fast odling och biofilm) och i alla tillväxtfaser 2, 3. OMV är ett viktigt transportmedel (t.ex. för proteiner, adhesiner, toxiner och enzymer, liksom för LPS, som återfinns på OMV ytan) 4. Det intraluminala last skyddas från proteolytisk nedbrytning, så det är i stånd att agera över långa sträckor, och vesiklarna kan hittas i kroppsvätskor och avlägsna organ 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan inte bara kännas igen och tas upp av eukaryota celler 9, 10, men dessutom, de har möjlighet att underlätta bindning av bakterier och deras invasion i värdceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) är en gramnegativ bakterie som kan släppa OMV. I den mänskliga lungan, infekterar det främst alveolära makrofager, trots sin naturliga värd är sötvatten amöbor 11. En L. pneumophila infektion kan orsaka legionärssjuka, en allvarlig form av lunginflammation 12. Det blockerar phagosome-lysosom fusion i värdcellen. Det rekryterar också värdorgan, varvid en replikerings nisch, Legionella-innehållande vakuolen (LCV), bildas 13, 14. Lysosomal nedbrytning hämmas inte bara av effektor protein translocation via typ IV sekretionssystem, men också av frisättningen av OMV 15.
Reningen av OMV från bakteriekulturer krävs för att analysera deras effekt på mottagarceller. Tidigare studier fokuserade på innehållet i L. pneumophila OMV protein och på inverkan av blåsor på alveolära epitelceller 16, men senare studier med humana lungvävnadstransplantat visade att L. pneumophila OMV tas upp av alveolära makrofager 17.
Som OMV närvarande patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och andra bakteriella antigener, kan de ha en inverkan på infektion av eukaryota celler och modulera värdens immunsvar 18. L. pneumophila OMV snabbt smälta samman med värdcellmembran och dessutom de aktiverar membran TLR2 19. Eftersom det är känt att L. pneumophILA OMV stimulera makrofager och epitelceller i en pro-inflammatoriska sätt 16, 17, analyserade vi effekterna av OMV på infektionsprocessen i humana och murina makrofager.
Här beskriver vi ett protokoll för odling av L. pneumophila i flytande kultur för att isolera de utsöndrade OMV genom differentiell ultracentrifugering och bedöma effekterna av blåsor på eukaryota värdceller, antingen direkt eller efter en infektion.
De OMV av bakteriella patogener och effekterna av dessa membranvesiklar på sina målceller för närvarande intensivt studerat. Till exempel, Clostridium perfringens-avledda OMV inducera cytokinutsöndring i makrofager, kan B-lymfocyter aktiveras av OMV från Borrelia burgdorferi, och Helicobacter pylori -released membranvesiklar kan verka på gastriska epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, en intracellulär patogen som kan inducera en allvarlig form av atypisk lunginflammation, frigör också OMV som har möjlighet att aktivera lungepitelceller och makrofager 16, 19. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för småskalig isolering av L. pneumophila OMV från flytande kultur för att studera den potentiella rollen av OMV i lunginflammation. Det är kritiskt att arbeta under sterila conditjoner och att utesluta kontaminering från andra bakterier i syfte att erhålla en ren L. pneumophila härledda OMV förberedelse. Isolering av OMV innefattar ett filtreringssteg genom 0,22-im porer för att förhindra kontaminering av den erhållna OMV pelleten med L. pneumophila, även om detta minskar OMV utbyte, eftersom de största OMV går förlorade genom denna filtreringssteg.
Dessutom testade vi svaret av humana och murina makrofager till de isolerade blåsor och infekterade celler med L. pneumophila att närmare approximera situationen i Legionella lunginflammation, där OMV frigörs inuti LCV av extracellulära bakterier 15. De anställda OMV doser har uppskattats enligt den fria OMV beloppet i ett in vitro-infektion av humana makrofager efter 24 h inkubation (beskriven i referens 20). För stimulering av andra mottagarceller eller in vivo-experiment,andra OMV doser kan vara nödvändigt och måste fastställas. Analysen av effekten av L. pneumophila OMV representerar ett framsteg protokollet beskrivet av Jager och Steinert 24.
Här, PMA-differentierade THP-1-celler tjäna som modell för alveolära makrofager på grund av den begränsade tillgången på primära humana material. Tillsatsen av PMA skiljer de monocytiska THP-1-celler till makrofagliknande celler 25. Dessutom är de en välkänd modell cellinje för L. pneumophila studerar 26. Förutom denna humana monocytiska cellinjen, är mBMDM celler används. mBMDM är allmänt accepterade för att studera effekterna av L. pneumophila 27, 28, 29. Möjligheten att använda genetiska knockouts för olika TLR eller andra proteiner gör dem ett värdefullt verktyg för att studera OMV effekter. i Order att sänka mängden av möss per försök, är mBMDM används i stället för alveolära makrofager på grund av begränsningarna hos de makrofager. Nyckel experiment kan kräva alveolära makrofager för validering.
Förutom de häri beskrivna protokoll av ultracentrifugering för att rena OMV, är det möjligt att utföra en densitetsgradientcentrifugering, som ingår i protokollet av Chutkan et al. 30. Detta skulle kunna förbättra renheten av den erhållna OMV preparatet och minska mängden co-renat proteinaggregat, flagellin och LPS. Renheten hos den erhållna OMV preparatet kan analyseras genom transmissionselektronmikroskopi eller med nanopartiklar spårningsanalys som en kompletterande åtgärd i kvalitetskontroll. Detta kan ge ytterligare ett sätt att kvantifiera, utöver förfarandet proteinmätning som presenteras här. Eventuellt kan LPS-koncentrationen analyseras av en limulus amebocytlysat test. Om OMV avkastningen är låg, enytterligare koncentrationssteget via centrifugal filter skulle kunna utföras, vilket inte skedde här. Om utbytet var lägre än väntat, var OMV kasseras.
Som en del av det pågående arbetet för att belysa de biologiska mekanismer och funktioner bakom OMV, kunde inverkan av olika stressförhållanden på OMV produktion testas. Näringsämnen deprivation, förändringar i inkubationstemperatur, eller exponering för skadliga ämnen kan ha en inverkan på OMV sekre 31. Eventuella påfrestningar diskuteras i protokollet av Klimentova och Stulik 32. Dessutom kunde hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter genereras. De olika OMV preparaten kan sedan analyseras i infektionsexperiment med makrofager, humana lung vävnadsexplantat (beskrivna i referens 17), eller till och med i in vivo-modeller. Förutom rollen av OMV i medfödda immun signalering, deras inflytande i bakterie kommunikationkan ställas experimentellt. Dessutom kan effekterna av olika medfödda immunsignaleringskaskader analyseras genom användning av murina knockout celler eller generering av crispr / Cas9 knockouts i humana cellinjer. Denna grundforskning i OMV kommer att bidra till utvecklingen av nya vaccinstrategier, som redan finns för hjärnhinneinflammation B överförs av Neisseria meningitides 33.
Utgående från protokollet om OMV isolering och karakterisering kan man tillämpa detta på andra gramnegativa bakterier och andra värdceller; den behöver bara justeras till tillväxten av bakterierna i vätskekultur. Det protokoll som publiceras av Chutkan et al. ger detaljerad information om generering av OMV från Escherichia coli och Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bör inte nå den sena stationära fasen i syfte att undvika ökningar av lyserade bakterier och kontaminerande proteiner och membran. Dessutom OMV dos som användes för stimulering av värdcellerna måste bestämmas i enlighet med den mängd OMV närvarande under in vivo infektioner, samtidigt som man säkerställer en fortsatt låg cytotoxicitet. På detta sätt, den patologiska roll OMV, deras inverkan på inter-art kommunikation, och värd-patogen interaktioner skulle kunna undersökas.
För att ytterligare studera betydelsen av L. pneumophila OMV i lunginflammation, behövs standardiserade OMV beredningar tillräckliga avkastning och jämförbara infektionsförsök. Detta protokoll kommer att bidra till att standardisera isoleringsförfaranden och att utvidga OMV studier till andra gram-negativa bakterier och andra värdceller. Dessutom kommer forskningen att dra nytta av den detaljerade in vitro kunskap, som kan användas för att utvidga experiment in vivo inställningar. I framtiden kan detta protokoll utvidgas till att isoleringen av OMV från primär biologiskt material, såsom serum eller lung lavålder vätska, för att få insikt i sammansättningen av OMV släpptes under fysiologiska förhållanden. Detta kommer att hjälpa till att avgöra nyckelparametrar av OMV sammansättning och att förstå egenskaperna hos in vitro -generated OMV.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Dr. Markus Schnare för att förse oss med TLR2 – / – och TLR2 / 4 – / – möss och Prof. Dr. Carsten Kirschning för Trif / MyD88 – / – möss. Delar av detta arbete har finansierats av Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) och Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003), http://www.proloewe.de/medicalrnomics) alla till BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |