Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Legionella pneumophila yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager

doi: 10.3791/55146 Published: February 22, 2017

Summary

Här beskriver vi reningen av Legionella pneumophila (L. pneumophila) yttre membranvesiklar (OMV) från flytande kulturer. Dessa renade vesiklar används sedan för behandling av makrofager för att analysera deras pro-inflammatorisk potential.

Introduction

Bakterier kan utsöndra virulensfaktorer via olika mekanismer 1. Förutom de välkända sekretoriska system kan gramnegativa bakterier utbyta information och leverera virulensfaktorer via yttre membranvesiklar (OMV), som är små, sfäroida blåsor 10-300 nm i diameter och med en dubbelskiktsmembranstruktur. De utsöndras i en mängd olika tillväxtmiljöer (flytande kultur, fast odling och biofilm) och i alla tillväxtfaser 2, 3. OMV är ett viktigt transportmedel (t.ex. för proteiner, adhesiner, toxiner och enzymer, liksom för LPS, som återfinns på OMV ytan) 4. Det intraluminala last skyddas från proteolytisk nedbrytning, så det är i stånd att agera över långa sträckor, och vesiklarna kan hittas i kroppsvätskor och avlägsna organ 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan inte bara kännas igen och tas upp av eukaryota celler 9, 10, men dessutom, de har möjlighet att underlätta bindning av bakterier och deras invasion i värdceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) är en gramnegativ bakterie som kan släppa OMV. I den mänskliga lungan, infekterar det främst alveolära makrofager, trots sin naturliga värd är sötvatten amöbor 11. En L. pneumophila infektion kan orsaka legionärssjuka, en allvarlig form av lunginflammation 12. Det blockerar phagosome-lysosom fusion i värdcellen. Det rekryterar också värdorgan, varvid en replikerings nisch, Legionella-innehållande vakuolen (LCV), bildas 13, 14. Lysosomal nedbrytning hämmas inte bara av effektor protein translocation via typ IV sekretionssystem, men också av frisättningen av OMV 15.

Reningen av OMV från bakteriekulturer krävs för att analysera deras effekt på mottagarceller. Tidigare studier fokuserade på innehållet i L. pneumophila OMV protein och på inverkan av blåsor på alveolära epitelceller 16, men senare studier med humana lungvävnadstransplantat visade att L. pneumophila OMV tas upp av alveolära makrofager 17.

Som OMV närvarande patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och andra bakteriella antigener, kan de ha en inverkan på infektion av eukaryota celler och modulera värdens immunsvar 18. L. pneumophila OMV snabbt smälta samman med värdcellmembran och dessutom de aktiverar membran TLR2 19. Eftersom det är känt att L. pneumophILA OMV stimulera makrofager och epitelceller i en pro-inflammatoriska sätt 16, 17, analyserade vi effekterna av OMV på infektionsprocessen i humana och murina makrofager.

Här beskriver vi ett protokoll för odling av L. pneumophila i flytande kultur för att isolera de utsöndrade OMV genom differentiell ultracentrifugering och bedöma effekterna av blåsor på eukaryota värdceller, antingen direkt eller efter en infektion.

Protocol

1. Förbered Medium och agarplattor

  1. Förbereda ett L av buljongmedium (Yeb). Lös 10 g ACES och 10 g jästextrakt i 900 ml destillerat vatten. Justera pH till 6,9 med KOH (5 N). Tillsätt 10 ml av L-cystein (0,4 g i 10 ml destillerat vatten) och 10 ml av Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destillerat vatten). Fyll upp till 1 liter med destillerat vatten och filtrera sterilisera lösningen (porstorlek: 0,22 pm). Lagra vid 4 ° C.
  2. Förbereda buffrad träkol jästextrakt (BCYE) agarplattor. Lös 10 g ACES och 10 g jästextrakt i 900 ml destillerat vatten. Justera pH till 6,9 med KOH (5 N). Tillsätt 15 g agar och 2,5 g aktiverat träkol. Fyll upp till 1 liter med destillerat vatten och autoklav.
    1. Tillsätt 10 ml av L-cystein (0,4 g i 10 ml destillerat vatten) och 10 ml av Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destillerat vatten, både steriliseras genom filtrering genom 0,22 | imporer) och kyld BCYE (ca 50 ° C). Häll plattor och förvara vid 4 ° C.

2. Odla L. pneumophila

  1. Sprid L. pneumophila stam Corby (vildtyp, WT) på BCYE agarplattor och inkubera dem vid 37 ° C under 3 dagar. Ympa 10 ml av Yeb vid en OD 600 på 0,3 med L. pneumophila från förkulturen plattan; inkubera bakterierna vid 37 ° C på en roterande skakapparat (150 rpm) under 6 h.
  2. Kontrollera renheten hos den flytande kultur genom att sprida 100 | il av suspensionen på en blodagarplatta. Inkubera över natten vid 37 ° C.
  3. Tillsätt resten av flytande kultur till 90 ml av färskt Yeb medium och inkubera på en roterande skakapparat (37 ° C och 150 varv per minut) för att nå en OD 600 av 3,0 till 3,5, som tar ungefär 16 till 20 timmar.

3. Förbered och kvantifiera L. pneumophila OMV

OBS: Utför alla följande centrifugeringsstegs under sterila betingelser och vid 4 ° C.

  1. Centrifugera den flytande kulturen vid 4000 xg under 20 min för att pelletera bakterierna. Överför supernatanten till nya centrifugrör, kassera den bakteriella pellets och upprepa centrifugering (4000 x g under 20 min). Upprepa detta steg en gång.
  2. Sterilfilter återstående supernatanten två gånger (porstorlek: 0,22 pm). Överföra bakteriefria supernatant till ultracentrifugrör och ultracentrifug vid 100.000 xg under tre timmar.
  3. Dekantera supernatanten och kassera den. Resuspendera OMV pelleten i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och ultracentrifug (100000 x g under 3 h) för att avlägsna kontaminerande proteiner och LPS.
  4. Kassera supernatanten och resuspendera OMV pelleten i 500 mikroliter av steril PBS. Streak 20 mikroliter på en blodagarplatta och på en BCYE agarplatta att utesluta bakteriell kontaminering av de framställda vesiklar. Inkubera blodagarplattan över natten och BCYE agarplattan under 3 dagar (båda vid 376, C).
  5. Kvantifiera protein belopp som erhålls från OMV preparatet med hjälp av en bicinkoninsyra analys enligt tillverkarens anvisningar.
    OBS: Koncentrationen av 100 ml L. pneumophila kultur är vanligtvis ett pg / pl. Förvara förberedda och kvantifierbara OMV vid -20 ° C.

4. Förbehandla makrofager

  1. Förbereda THP-1-celler.
    OBS: THP-1 är en monocytisk cellinje härledd från en leukemipatient.
    1. Lägga 2x10 5 THP-1-celler per 24 brunnar och differentiera dem genom att lägga 20 nM forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) i makrofagliknande celler. Inkubera under 24 h vid 37 ° C.
    2. Ersätta mediet med 500 mikroliter av färskt medium och inkubera under ytterligare 24 h; det optimala mediet för THP-1 celler består av RPMI 1640 med hög glukoshalt kompletterat med 10% fetalt kalvserum.
  2. Isolera de murina benmärgshärledda makrofager (mBMDM), såsom beskrivs i SeENCE 20.
  3. Behandla THP-1-härledda makrofager eller mBMDM med OMV.
    1. Tina OMV som framställts i steg 3 och lägga till dem i enlighet med deras proteinmängden (0,1, 1, och 10 mikrogram / ml) till människa eller mus makrofager. Inkubera makrofager med OMV vid 37 ° C under minst 20 h. Använd supernatanten för ELISA eller gå vidare med steg 5.

5. infektera makrofager och bedöma bakteriell replikering med en kolonibildande enhet (CFU) -analys

  1. Använd L. pneumophila från steg 2,1, förbehandlat THP-1-celler eller mBMDM från steg 4,3, och inte förbehandlas makrofager som kontroller (2x10 5/24 brunnar). Inte byta mediet.
  2. Infect THP-1-celler med L. pneumophila Corby WT och mBMDM med en flagellin-saknar mutant av L. pneumophila Corby (båda med en infektionsmultiplicitet (MOI) av 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 brunnar) och inkubera i 24 och 48 h, respektive. förbereda both L. pneumophila Corby (WT eller flagellin-saknar mutant) som beskrivs i steg 2,1.
  3. Lyserar cellerna i deras medium genom tillsats av saponin (slutkoncentration: 0,1%) och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
  4. Resuspendera bakterier genom att pipettera och överföra suspensionen till ett reaktionskärl. Förbereda serieutspädningar av L. pneumophila -innehållande media i steril PBS.
  5. Streak 50 mikroliter av de erforderliga utspädning på BCYE agarplattor och inkubera under 3 dagar vid 37 ° C.
  6. Visuellt räkna de bildade kolonierna. Beräkna CFU ekvation 1 Normalisera CFU räkna resultatet till inte förbehandlas men infekterade makrofager, som är satt till 100%.

Representative Results

Den experimentuppställning för att förbereda L. pneumophila OMV och analysera deras inverkan på pro-inflammatoriska responsen av makrofager efter infektion visas i figur 1. Den pro-inflammatoriska potentialen hos de preparerade OMV kan analyseras på PMA-differentierade THP-1-celler, vilket visas i figur 2. THP-1-celler svarar med ett tids- och dosberoende ökning av IL-8 och IL-6 sekretion. Dessutom kan inverkan av olika TLR på L. pneumophila OMV erkännande analyseras med hjälp av mBMDM från olika genetisk bakgrund, som lades fram av CXCL1 ELISA i figur 3. mBMDM från WT möss utsöndrade CXCL1 efter OMV stimulering, medan mBMDM TLR2 / 4 - / - utsöndras betydligt mindre. För att studera effekten av L. pneumophila OMV på bakteriell replikering i THP-1 makrofager, celler förinkuberades med OMV och sedan dessutom infekterademed L. pneumophila (Figur 4 A). Pre-stimulering av THP-1-härledda makrofager minskar först den bakteriella replikation efter 24 h av infektion, men det leder till en fördubbling av CFU räkna vid senare tidpunkt (48 h pi). Effekterna av Toll-like receptor (TLR) signalering på OMV erkännande efter infektion av makrofager kan bedömas av mBMDM, enligt figur 4 B. Bakteriella replikerings ökar med tiofaldigt i mBMDM från WT djur efter OMV förinkubation, medan TLR2 - / - och trif / MyD88 - / - celler inte visar denna ökning av L. pneumophila replikering.

Figur 1
Figur 1: Experimentell procedur. (A) L. pneumophila Corby WT från 10-cm BCYE agarplattor användes för att inokulera en liten vätskekultur (10 ml), som överförs till 90 ml färskt Yebmediet efter 6 h. En liten volym är också pläteras på en blodagarplatta för att kontrollera med avseende på renhet. Bakterier odlades vid 37 ° C tills den tidiga stationära fasen (OD 600 = 3,0-3,5). (B) Den flytande kultur centrifugeras och sterilfiltreras för att avlägsna bakterier. Legionella -fri supernatanten sedan ultracentrifuger att erhålla en OMV pellet, som är suspenderade i PBS och ultracentrifuger igen. De isolerade vesiklar återsuspenderas, kontrolleras med avseende på renhet, och kvantifieras för proteinmängden. Skalstrecket representerar 2,5 cm. (C) humant eller murint makrofager stimuleras med de kvantifierade OMV. Cellkultursupernatanten kan användas för ELISA eller makrofager kan infekteras med L. pneumophila att bestämma bakteriell replikering av CFU-analys på 10-cm BCYE agarplattor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Pro-inflammatorisk aktivering av THP-1-celler av L. pneumophila OMV. (A) Här är den monocytiska THP-1-cellinjen användes som en modell för alveolära makrofager. PMA-differentierade THP-1-celler behandlades med ökande doser av L. pneumophila OMV (0,01-25 | ig / ml) under 24 och 48 h, respektive. Den cellfria supernatanten användes för IL-8 ELISA. Medelvärdena för tre oberoende experiment ± SEM visas. THP-1-celler svarade på så lite som 0,01 pg / ml L. pneumophila OMV med signifikant IL-8-utsöndring, som var tids- och dosberoende. (B) L. pneumophila OMV (0,1-10 | ig / ml) användes för att stimulera PMA-differentierade THP-1-celler. Supernatanten uppsamlades efter 24 och 48 h inkubering, och den frigjorda IL-6 mättes i supernatanten via ELISA. Medelvärdena för tre oberoende experiment ± SEM visas. THP-1-celler utsöndrade signifikanta mängder av IL-6, även med den lägsta dosen av OMV (0,1 | j, g / ml). Utsöndringen av IL-6 ökade med ökande OMV doser och med långvariga inkubationstider. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 och ** p <0,01 i förhållande till motsvarande 0 | j, g / ml OMV. Återgivet med tillstånd från referens 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Den pro-inflammatorisk aktivering av makrofager är beroende av TLR2 / 4. mBMDM från WT och TLR2 / 4 - / - möss inkuberades med L. pneumophila OMV (0,1 eller 1 | ig / ml). CXCL1 utsöndring analyserades genom ELISA efter 24 och 48 h, respektive. Demedelvärden ± SEM av tre oberoende experiment visas. mBMDM från WT möss svarade med en dosberoende CXCL1 utsöndring efter L. pneumophila OMV inkubation. TLR2 / 4 - / - mBMDM utsöndras betydligt mindre CXCL1 jämfört med WT mBMDM, och denna utsöndring ökade inte dosberoende. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 jämfört med den motsvarande 0 | j, g / ml OMV; #p <0,05 jämfört med en lika behandlad WT prov. Återgivet med tillstånd från referens 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: L. pneumophila OMV förinkubation ökar bakteriereplikation i makrofager. (A) Differentierade THP-1-celler förinkuberades med OMV (0,1, 1 eller 10 μ; G / ml) eller LPS / IFN-γ (200 ng / ml vardera) eller lämnades obehandlade för kontroll. Efter förinkubation (20 h), var THP-1 celler infekterade med L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) i 2, 24, och 48 timmar, respektive. THP-1 celler lyserades genom tillsats av saponin, och bakterierna ströks ut på BCYE agarplattor. CFU beräknades i förhållande till 0 mikrogram / ml OMV efter varje tidpunkt. Staplarna representerar medelvärdena ± SEM av tre oberoende försök, vardera utfört i tekniska dubbletter. Det fanns inga skillnader i bakterieupptag (2 h efter infektion (pi)) i jämförelse med inte pre-behandlade celler. Förändringar i bakteriellt replikation bestämdes efter 24 och 48 h, respektive. LPS / IFN-γ förbehandlade THP-1-celler visade en minskning av bakteriehalten 24 h pi Detta observerades också på ett dosberoende sätt för L. pneumophila OMV förbehandlade celler. Vid den senare tidpunkten (48 h pi), OMV förbehandlade THP-1-celler visade en fördubbling i L. pneumophila relämpning, medan LPS / IFN-y-förbehandlade makrofager uppvisade en ytterligare minskning av bakteriell belastning. Statistik: Mann-Whitney-test; * P <0,05 och ** p <0,01 i förhållande till motsvarande 0 | j, g / ml OMV. (B) mBMDM från möss med olika genetisk bakgrund (WT, TLR2 - / -, och trif / MyD88 - / -) förinkuberades med 0,1 mikrogram / ml L. pneumophila OMV under 20 h och infekterades sedan med en flagellin- deficient mutant av L. pneumophila Corby (MOI 0,5) under 48 timmar. mBMDM lyserades genom tillsats av saponin, och Legionella utströks på BCYE agarplattor. CFU beräknades relativt till 0 pg / ml OMV, som visas med den heldragna linjen. Staplarna representerar de medelvärden ±± SEM av tre oberoende experiment, vardera utfört i duplikat. mBMDM från WT möss visade en ökning av L. pneumophila replikering efter OMV förbehandling. TLR2 - / - makrofager visade signifikant reducerad - / - mBMDM. Statistik: Mann-Whitney-test; p <0,05 jämfört med WT provet. Återgivet med tillstånd från referens 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De OMV av bakteriella patogener och effekterna av dessa membranvesiklar på sina målceller för närvarande intensivt studerat. Till exempel, Clostridium perfringens-avledda OMV inducera cytokinutsöndring i makrofager, kan B-lymfocyter aktiveras av OMV från Borrelia burgdorferi, och Helicobacter pylori -released membranvesiklar kan verka på gastriska epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, en intracellulär patogen som kan inducera en allvarlig form av atypisk lunginflammation, frigör också OMV som har möjlighet att aktivera lungepitelceller och makrofager 16, 19. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för småskalig isolering av L. pneumophila OMV från flytande kultur för att studera den potentiella rollen av OMV i lunginflammation. Det är kritiskt att arbeta under sterila conditjoner och att utesluta kontaminering från andra bakterier i syfte att erhålla en ren L. pneumophila härledda OMV förberedelse. Isolering av OMV innefattar ett filtreringssteg genom 0,22-im porer för att förhindra kontaminering av den erhållna OMV pelleten med L. pneumophila, även om detta minskar OMV utbyte, eftersom de största OMV går förlorade genom denna filtreringssteg.

Dessutom testade vi svaret av humana och murina makrofager till de isolerade blåsor och infekterade celler med L. pneumophila att närmare approximera situationen i Legionella lunginflammation, där OMV frigörs inuti LCV av extracellulära bakterier 15. De anställda OMV doser har uppskattats enligt den fria OMV beloppet i ett in vitro-infektion av humana makrofager efter 24 h inkubation (beskriven i referens 20). För stimulering av andra mottagarceller eller in vivo-experiment,andra OMV doser kan vara nödvändigt och måste fastställas. Analysen av effekten av L. pneumophila OMV representerar ett framsteg protokollet beskrivet av Jager och Steinert 24.

Här, PMA-differentierade THP-1-celler tjäna som modell för alveolära makrofager på grund av den begränsade tillgången på primära humana material. Tillsatsen av PMA skiljer de monocytiska THP-1-celler till makrofagliknande celler 25. Dessutom är de en välkänd modell cellinje för L. pneumophila studerar 26. Förutom denna humana monocytiska cellinjen, är mBMDM celler används. mBMDM är allmänt accepterade för att studera effekterna av L. pneumophila 27, 28, 29. Möjligheten att använda genetiska knockouts för olika TLR eller andra proteiner gör dem ett värdefullt verktyg för att studera OMV effekter. i Order att sänka mängden av möss per försök, är mBMDM används i stället för alveolära makrofager på grund av begränsningarna hos de makrofager. Nyckel experiment kan kräva alveolära makrofager för validering.

Förutom de häri beskrivna protokoll av ultracentrifugering för att rena OMV, är det möjligt att utföra en densitetsgradientcentrifugering, som ingår i protokollet av Chutkan et al. 30. Detta skulle kunna förbättra renheten av den erhållna OMV preparatet och minska mängden co-renat proteinaggregat, flagellin och LPS. Renheten hos den erhållna OMV preparatet kan analyseras genom transmissionselektronmikroskopi eller med nanopartiklar spårningsanalys som en kompletterande åtgärd i kvalitetskontroll. Detta kan ge ytterligare ett sätt att kvantifiera, utöver förfarandet proteinmätning som presenteras här. Eventuellt kan LPS-koncentrationen analyseras av en limulus amebocytlysat test. Om OMV avkastningen är låg, enytterligare koncentrationssteget via centrifugal filter skulle kunna utföras, vilket inte skedde här. Om utbytet var lägre än väntat, var OMV kasseras.

Som en del av det pågående arbetet för att belysa de biologiska mekanismer och funktioner bakom OMV, kunde inverkan av olika stressförhållanden på OMV produktion testas. Näringsämnen deprivation, förändringar i inkubationstemperatur, eller exponering för skadliga ämnen kan ha en inverkan på OMV sekre 31. Eventuella påfrestningar diskuteras i protokollet av Klimentova och Stulik 32. Dessutom kunde hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter genereras. De olika OMV preparaten kan sedan analyseras i infektionsexperiment med makrofager, humana lung vävnadsexplantat (beskrivna i referens 17), eller till och med i in vivo-modeller. Förutom rollen av OMV i medfödda immun signalering, deras inflytande i bakterie kommunikationkan ställas experimentellt. Dessutom kan effekterna av olika medfödda immunsignaleringskaskader analyseras genom användning av murina knockout celler eller generering av crispr / Cas9 knockouts i humana cellinjer. Denna grundforskning i OMV kommer att bidra till utvecklingen av nya vaccinstrategier, som redan finns för hjärnhinneinflammation B överförs av Neisseria meningitides 33.

Utgående från protokollet om OMV isolering och karakterisering kan man tillämpa detta på andra gramnegativa bakterier och andra värdceller; den behöver bara justeras till tillväxten av bakterierna i vätskekultur. Det protokoll som publiceras av Chutkan et al. ger detaljerad information om generering av OMV från Escherichia coli och Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bör inte nå den sena stationära fasen i syfte att undvika ökningar av lyserade bakterier och kontaminerande proteiner och membran. Dessutom OMV dos som användes för stimulering av värdcellerna måste bestämmas i enlighet med den mängd OMV närvarande under in vivo infektioner, samtidigt som man säkerställer en fortsatt låg cytotoxicitet. På detta sätt, den patologiska roll OMV, deras inverkan på inter-art kommunikation, och värd-patogen interaktioner skulle kunna undersökas.

För att ytterligare studera betydelsen av L. pneumophila OMV i lunginflammation, behövs standardiserade OMV beredningar tillräckliga avkastning och jämförbara infektionsförsök. Detta protokoll kommer att bidra till att standardisera isoleringsförfaranden och att utvidga OMV studier till andra gram-negativa bakterier och andra värdceller. Dessutom kommer forskningen att dra nytta av den detaljerade in vitro kunskap, som kan användas för att utvidga experiment in vivo inställningar. I framtiden kan detta protokoll utvidgas till att isoleringen av OMV från primär biologiskt material, såsom serum eller lung lavålder vätska, för att få insikt i sammansättningen av OMV släpptes under fysiologiska förhållanden. Detta kommer att hjälpa till att avgöra nyckelparametrar av OMV sammansättning och att förstå egenskaperna hos in vitro -generated OMV.

Acknowledgments

Vi tackar Prof. Dr. Markus Schnare för att förse oss med TLR2 - / - och TLR2 / 4 - / - möss och Prof. Dr. Carsten Kirschning för Trif / MyD88 - / - möss. Delar av detta arbete har finansierats av Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) och Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003), http://www.proloewe.de/medicalrnomics) alla till BS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5% sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby --- --- kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA --- --- kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM --- --- kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7, (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74, (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181, (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19, (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154, (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65, (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275, (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29, (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437, (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23, (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12, (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13, (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74, (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76, (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82, (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78, (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12, (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304, (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61, (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71, (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73, (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11, (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195, (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. Novartis.com. Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).
<em>Legionella pneumophila</em> yttre membranvesiklar: Isolering och analys av deras pro-inflammatoriska Potential på makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).More

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter