Summary
細菌のエフェクタータンパク質は、成功した感染を確立するために重要です。このプロトコルは、その自然の植物宿主における細菌のエフェクタータンパク質のタンパク質性結合パートナーの実験的同定を記載します。酵母ツーハイブリッドスクリーニングを介してこれらのエフェクターの相互作用を同定することは、分子病原性戦略の解明に重要なツールとなっています。
Abstract
病気の症状の分子機構をUnravellingする植物科学における病理および症状の発展を理解することが重要です。細菌は、自分の利益のためにそれらの宿主代謝を操作するために異なる戦略を進化させてきました。この細菌の操作は、多くの場合、重度の症状の開発や影響を受けた植物の死に連結されています。ホスト操作を担当する特定の細菌の分子を決定することは、微生物学的研究の重要な分野となっています。呼ばれるこれらの細菌の分子の同定後、「エフェクター、「彼らの機能を解明することが重要です。エフェクターの機能を決定するための直接的なアプローチは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を介して、その自然宿主でのタンパク質性結合パートナーを同定することです。通常、ホストは、 インシリコのアルゴリズム内の任意により十分に予測できない多数の潜在的な結合パートナーを保有します。したがってperfoするための最良の選択であります表現宿主タンパク質のライブラリ全体に対して仮想的なエフェクターで画面をRM。原因物質は、ファイトプラズマのような耕せないであれば、特に困難です。このプロトコルは、ファイトプラズマ感染木本宿主植物、潜在的なエフェクターの増幅、およびY2Hスクリーンでの植物の分子相互作用パートナーのその後の識別からのDNA精製のためのステップバイステップの手順を説明します。 Y2Hスクリーンが一般的に使用されているにもかかわらず、コストでY2Hサービスを提供していますバイオテクノロジー企業にこの技術をアウトソーシングする傾向があります。このプロトコルは、標準的な実験室技術を使用して任意のまともな装備の分子生物学研究室でY2Hを実行する方法について説明します。
Introduction
酵母ツーハイブリッドスクリーニング（Y2H）は1約27年前に開発され、広く、特定のタンパク質-タンパク質相互作用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11を決定するために、様々な分野で利用されているので有しました。ホスト標的タンパク質と細菌のエフェクターの物理的相互作用は、多くの場合、この標的タンパク質の機能的操作のための前提条件です。これらの相互作用を分析して、感染生物学12、13、14、15の多くの異なるセクターの焦点に移動しました、"> 16、17、18。Y2Hスクリーンの原理は、2つのタンパク質の相互作用は、レポーター遺伝子の発現を駆動する機能的転写因子の再構成をもたらすことである。既知のエフェクター（「ベイト」）が翻訳的に融合させますDNA結合ドメイン転写因子（DBD）、および潜在的な相互作用パートナー（「プレイ」）の相互作用パートナーは、潜在的なライブラリ不明であるので、それぞれの転写因子の活性化ドメイン（AD）に融合されているに相互作用は、いわゆる中にクローン化された「プレイ・ライブラリー。」通常、このライブラリーはベイトベクターと互換性のDBDを符号化されている。相互作用の場合には、ADをコードする適切な獲物ベクター発現プラスミドにcDNAをクローニングすることによって作られ、再構成された転写因子は、一般的に、酵母の増殖選択を可能にする、レポーター遺伝子の発現を誘導します。相互作用物質の同定は、プラスミド特異的プライマーと獲物プラスミドを配列決定することによって達成されます。
細菌は、操作とその宿主の代謝を利用するか、防御機構を回避し、異なる細菌分泌系19、20、21を介してエフェクター分子を分泌するために様々な戦略を開発しました。これらの細菌のエフェクターの結合パートナーを決定することは、このようホストでの操作経路を特定するための最初のステップです。これは、特定の病原性のメカニズムの理解の向上につながります。
Y2Hスクリーンはphytoplasmoses中の細菌エフェクターの相互作用を同定するために実施され、多くの場合、Y2Hは、ファイトプラズマ研究22、23の分子病原性機構のさらなる特徴付けのための重要な最初の実験です。しかし、会いましたほとんどの出版物におけるHOD説明はかなり希少であり、これらの技術は、多くの場合、バイオテクノロジー企業に外注しています。この方法の実現可能性に注意を引くために、このプロトコルは、その自然宿主における細菌エフェクター分子の相互作用パートナーを識別するためのステップバイステップの情報を提供します。
幅広い用途とY2H画面の早送りアプローチにもかかわらず、それは特定の相互作用は酵母系で発生していない可能性があることを忘れてはなりません。これは、酵母細胞は、特定の生物学的な制限が「 インビボ反応容器」の一種として使用されるという事実によるものです。いくつかの著者は、Y2H及びその誘導体11、24、25、26、27の利点と欠点に対処しています。一般的な考慮事項は、酵母細胞は、適切なを提供しない場合があること、例えば、遺伝子発現、（後）の翻訳、またはそれぞれのタンパク質の転条件が検討されて。これは、画面内の偽陰性の結果につながることができます。正の相互作用は、順番にアーティファクトすることができ、（ すなわち、適切な宿主内でのエフェクターの場合には）自然な状況で発生していない可能性があります。より密接に関連する生物学的システムにおける独立した相互作用試験で異種酵母発現系の相互作用を確認することが不可欠です。
本研究では、非耕作植物病原体マリCandidatusファイトプラズマ（P.のマリ）からエフェクターATP_00189の結合パートナーを同定しました。結果は、リンゴの増殖28、欧州29に影響を受けたリンゴに成長している地域では高い経済的損失の原因となる疾患の症状の開発の根底にある分子メカニズムに重要な洞察を提供します。
Protocol
1.感染アップルの木から根と葉のサンプルを収集
注：病原体特異的DNAは、根または葉から精製することができます。次のセクションでは、両方のサンプリングのためのプロトコルを提供します。
- DNA調製のために
- 根からのサンプル採取および準備
- 無症状である「りんご増殖」特有の症状30、31および制御の木が感染した木を特定します。 1 cmから約5cmの長さ - クリーン剪定ばさみを使用して、0.5の直径を有する根サンプルを切断します。カット根系の三つの異なる、離れた部位からのサンプル、および適切に標識されたビニール袋に入れて。
- 冷蔵熱パックとコールドボックス内のサンプルを維持し、さらなる処理まで4℃で冷蔵庫に保管してください。
注：ルートアーキテクチャと構造が生理学的状態のOに対して変化することができます木F。 3つの異なる部位でサンプリングすると、薄すぎると根を取るしないことが重要です。サンプルを、4℃で数日間保存することができるが、より長い貯蔵時間は、成形品のリスクを高めます。カビの生えたサンプルは、DNA調製のために使用することができません。
- 冷蔵熱パックとコールドボックス内のサンプルを維持し、さらなる処理まで4℃で冷蔵庫に保管してください。
- 土壌を除去するために水で根サンプルをすすいでください。滅菌ペトリ皿に入れ、ルート表皮と皮質を除去するために滅菌メスを使用します。
- 70％（v / v）エタノール水溶液でそれを浸し、ワイプ、及び直火（ 例えば、ブンゼンバーナー）の上に、熱殺菌、清潔なリントフリーのティッシュでメスを清掃してください。滅菌した2.0 mLの反応管にみじん切り師部の100 mgの - 30、メスで師部を傷つけ小片にそれをチョップし、アリコート。数ヶ月のために-80℃でサンプルを保管してください。
- 無症状である「りんご増殖」特有の症状30、31および制御の木が感染した木を特定します。 1 cmから約5cmの長さ - クリーン剪定ばさみを使用して、0.5の直径を有する根サンプルを切断します。カット根系の三つの異なる、離れた部位からのサンプル、および適切に標識されたビニール袋に入れて。
- 葉からのサンプル採取および準備
- 、感染および無症候性のコントロールツリーを識別するsがステップ1.1.1.1に記載され、ツリーあたり10無傷の葉を選びます。条件ごとに一本の木で十分です。
- 水で葉を洗浄し、70％（v / v）のエタノール溶液を噴霧することにより表面を洗浄。滅菌ペトリ皿に葉を入れ、滅菌メスで各葉の中肋（中心静脈）を解剖。滅菌2.0 mLの反応管に主脈から表皮および皮質を外し、小片に中肋を切断し、中肋組織の一定量を100mg。数ヶ月のために-80℃でDNA調製や店舗のため、すぐにサンプルを使用してください。
注：100mgの部分に植物材料をアリコートにし、最終的にストレージのためにそれらを凍結すると便利です。各アリコートは、直接DNA調製のために使用することができます。凍結した植物材料が塊を形成する傾向があるので、冷凍植物材料を計量すると、面倒です。
- 根からのサンプル採取および準備
2.臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）は、DNAの調製をベース
32記載の修飾されたプロトコルに基づいて行われます。
- 以下の緩衝液を準備します。
- CTAB緩衝液：W / V臭化セチルトリメチルアンモニウム1％を溶解（CTAB、M rを：364.45グラム/モル）、100mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス、M rを：121.14グラム/ mL）を、1.4 M塩化ナトリウム（NaClのM個のR：58.44グラム/モル）、および20mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（のNaEDTA、M rを：372.24グラム/モル）を水で、それらは、pH 8.0に調整します。
- N-ラウロイルサルコシンバッファ：ワット/ V N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩33（M rを：293,38グラム/モル）10％を溶解し、100 mMトリス、および水中の20mMののNaEDTAとpHを8.0に調整します。
- トリスEDTA（TE）緩衝液：水とautoclに10 mMトリスおよび1mMのNaEDTAを溶かしますソリューションをaveの。
- 酢酸アンモニウム溶液：水に解決し、120℃で、それをオートクレーブし、20分間1.2バール：5 M酢酸アンモニウム（77,0825グラム/モルのM r）を準備します。
- CTAB緩衝液の300μL、N-ラウロイルサルコシンバッファの30μL、プロテイナーゼKの6μL（10μgの/μL）、及び12μLの新鮮なまたは冷凍みじん切り植物材料（ステップ1.1.2.2。）の100ミリグラム - 30ミックス2-メルカプトエタノール34（M rを：78,13 /モル）。 60℃で60分間振とうします。ミックスが進む前に室温まで冷却してみましょう。
- 酢酸アンモニウム溶液の360μLを加え、激しく混合します。溶液を5分間放置し、次いで室温で10分間、15,000×gで遠心分離してみましょう。きれいなバイアルに上清を移し、氷冷イソプロパノール35の720μLを追加します。 -20℃で少なくとも30分間、DNAを沈殿させます。
- 4で30分間、15,000×gでミックスを遠心Cを°、上清を捨てます。氷冷70％エタノールの500μLでペレットを洗浄し、4℃で5分間、15,000×gでスピンダウン。
- エタノール上清を捨て、すぐに残留する液滴を除去するために、清潔なペーパータオル上でバイアルを浸します。できるだけ多くの液体を除去することを確認します。真空濃縮機遠心機で15-20分間または2-3分間ペレットを空気乾燥します。過剰な加熱または拡張蒸着時間によってペレットを過剰乾燥させないでください。
- TE緩衝液700μLにペレットを再懸濁し、最終的に溶解を容易にするために、37°Cにそれをウォームアップ。 RNアーゼの10μL（10μgの/μL）を加え、300rpmで振とうしながら、37℃で15分間静置します。
- 36 24：イソアミルアルコール：クロロホルムの700μLを追加1、よく混ぜます。 4℃で10分間20,000×gでミックスを遠心して、新しい、きれいなバイアルに上澄み液の上相を転送します。
- 添加することによって、上清中のDNAを沈殿700μLの2-プロパノール35（イソプロパノール、M rを：60.1グラム/モル）および-20℃で少なくとも30分間インキュベートします。 4℃で30分間12,000×gでミックスを遠心し、上清を捨てます。
- 4℃で5分間、12,000×gで70％エタノールおよび遠心分離機の500μLでペレットを洗浄。ステップ2.5で説明したように、ペレットを乾燥させます。 TEの50μLでそれを溶解させます。
3. PCRによりCandidatusファイトプラズママリ特異的DNAの検出
- ヌクレアーゼフリー水で植物材料午前1時10分から精製したDNAを希釈し、病原体特異的プライマー37でPCRを実行します。
- P.マリファイトプラズマ37のためのプライマーおよび特異的なプローブを用いた定量的PCRプロトコルを使用して植物材料におけるP.マリ特異的DNAの存在を確認します。 CAの各プローブと同じPCRを行うことにより、他の16SrXのファイトプラズマのメンバーが存在しないことを確認してくださいND。 P.のprunorumとCANDのため。 P.ピリDNA 37。
注：非感染ツリーからのDNAは、このコントロールの病原体が存在しないことを確認するためにも同様にテストする必要があります。このステップでは、それは、Pのマリ以外ファイトプラズマ種からエフェクタを増幅するリスクを増大させるため、他の密接に関連ファイトプラズマ種からのDNAは、試料には存在しないことが重要です。別の密接に関連したP.マリ16SrXグループファイトプラズマとの混合感染は、各プローブで試料を分析することによって除外されます。予想される結果は、他の16SrXのファイトプラズマについて陰性でなければならないので、PCRの有効性を示す適切な陽性対照を含めることが重要です。
- P.マリファイトプラズマ37のためのプライマーおよび特異的なプローブを用いた定量的PCRプロトコルを使用して植物材料におけるP.マリ特異的DNAの存在を確認します。 CAの各プローブと同じPCRを行うことにより、他の16SrXのファイトプラズマのメンバーが存在しないことを確認してくださいND。 P.のprunorumとCANDのため。 P.ピリDNA 37。
4.潜在的なエフェクター遺伝子を増幅するとY2Hベイトベクターにサブクローニング
- プライマー5を用いマリP.のphytoplasmal遺伝子atp_00189（シグナルペプチド部分を含まない）を増幅-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3（順方向）及び5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3は、それぞれ、5 'および3'末端にEcoRIおよびSalIのための制限部位と、（逆）。列ベースのDNA精製方法を用いてPCR産物を精製します。
- EcoRIおよびSalIでライゲーションを介し Y2HベイトベクターpLexA-Nにアンプリコンを複製します。
注：ここでは、EcoRIおよびSalIでの100 ngがpLexA-Nベクターは、同様にPCRアンプリコンおよび1 UのT4リガーゼatp_00189消化の15 ngのと合わせた直線化。ライゲーションは、（25℃でのpHは7.9）、40 mMトリス-塩酸を含む緩衝液中で実施した、10mMのMgCl 2を、10mMのジチオスレイトール（DTT、M rを：154.25グラム/モル）、および0.5mMアデノシン三リン酸（ATP、M R：16°Cで一晩（14-20時間）で10.0μLの総容量で507.18グラム/モル）。 マルスのx domesticaに結合する非特異的プライマーを除外するために、同じプライマーを用いて、感染していない木からDNAを分析</ em>のDNA。 - 大腸菌エレクトロ細胞へのライゲーションミックスの1μLを変換および50μg/ mLのカナマイシン硫酸塩38を補充したルリア-ベルターニ（LB）プレート上のカナマイシン耐性クローンを選択。
- 製造者の指示に従ってカラムベースのプラスミドミニ調製キットと、選択した細菌クローンからプラスミドDNAを精製し、シークエンシング39によってインサートの統合を成功さや向きを確認してください。
潜在的なエフェクタータンパク質の自己活性化（自動起動）5.試験
- 以下の緩衝液および増殖培地を準備します。
注：酵母選択プレートのハイフネーションのための命名法とそれぞれの培地中で不足しているアミノ酸の略語「 - 」の略語の前に。例えば、SD-TRP-レイ-彼のプレートは、すべてのアミノ酸が、TRP、レイと彼が含まれています。- 10倍ドロップアウトミックス：計量L-アルギニン一塩酸塩200mgの（M rを：210.66グラム/モル）、L-イソロイシン300mgの（M rを：131.17グラム/モル）、L-リシン一水和物の269 mgの（M rを：164.21グラム/モル） L-メチオニン200mgの（M rを：149.21グラム/モル）、L-フェニルアラニン500mgの（M rを：165.19グラム/モル）、L-トレオニンを2g（M rを：119.12グラム/モル）、300mgのL-チロシンの（MR：181.19グラム/モル）、L-ウラシル（112.09グラム/モル）を200mg、およびL-バリン1.5gの（M rを：117.15グラム/モル）。二重蒸留水1Lにそれらを溶解し、溶液をオートクレーブ。 4℃で溶液を保管してください。
注：それぞれのドロップアウトミックスはまた、予混合を購入することができます。 - 10X L-アデニンサプリメント（ADE、M rを：184.17グラム/モル）L-アデニンヘミ硫酸塩100mgを秤量し、再蒸留水50mL中に溶解します。フィルターは、0.22μmの細孔フィルターで溶液を滅菌します。
- 10倍のL-ヒスチジン補足：L-ヒスチジン一塩酸塩一水和物100mgを秤量（HIS、M rを
- 10倍のL-ロイシン補足：0.22μmのポアフィルタでそれを滅菌二重蒸留水とフィルター50mL中：L-ロイシン（113.17グラム/モルレイ、M r）この500mgのを計量。
- 10倍のL-トリプトファンサプリメントは：二回蒸留水50mLに、フィルターは、0.22μmの細孔フィルターでそれを滅菌する：L-トリプトファン（204.23グラム/モルのtrp、MをR）100mgを秤量します。
- SD-TRP-レイ-彼-ADJ-培地とプレート：ダブルで：（アミノ酸を含まない）のV酵母窒素ベース/ wの0.67％を溶解し、2％のw / vのD-グルコース一水和物（198.17グラム/モルのM R）蒸留水とオートクレーブ。寒天プレートのために、オートクレーブ処理に先立って、V寒天（微生物学的グレード）/ wの2％を追加します。
- 選択プレートを製造するために、オートクレーブしたSD-TRP-レイ-彼-ADE培地にアミノ酸原液の1倍を追加します。プレートを調製する場合、追加する前に寒天を〜50℃に冷却されていることを確認しますアミノ酸。無菌のストック溶液を保管してください。
- YPAD培地：にW / Vグルコース一水和物、2％、Vペプトン（微生物学的グレード）/ wの2％W / V酵母抽出物0.004重量/容量％のアデニンヘミ硫酸塩（184.17グラム/モルのM r）を 1％溶解二重蒸留水とオートクレーブ。 YPAD寒天プレートのために、オートクレーブの前にV寒天/ wの2％を追加します。 2倍YPADを準備するには、上記の成分の倍の濃度を使用しています。
注：（オプション）により培地中のグルコースの高濃度に、2倍YPAD培地はオートクレーブ処理した後、暗褐色になります。代替として、（w / v）のグルコースストック溶液を40％が0.22ミクロンフィルターに通すことにより調製し、滅菌することができます。フィルター滅菌グルコースストック溶液を滅菌条件下でオートクレーブ2×YPAD（欠くグルコース）に添加します。ボリュームのエラーを回避するために、2倍YPADは10倍のグルコース溶液が続いて添加されていることを念頭に置いて、準備しなければなりません。その手段は、例えば、代わりに、1 L oをそのF培地は、唯一の900 mLの（グルコースを除く全ての成分を含有する）を調製し、オートクレーブ処理し、次いでグルコースストック溶液の100mLを添加します。
- 10倍ドロップアウトミックス：計量L-アルギニン一塩酸塩200mgの（M rを：210.66グラム/モル）、L-イソロイシン300mgの（M rを：131.17グラム/モル）、L-リシン一水和物の269 mgの（M rを：164.21グラム/モル） L-メチオニン200mgの（M rを：149.21グラム/モル）、L-フェニルアラニン500mgの（M rを：165.19グラム/モル）、L-トレオニンを2g（M rを：119.12グラム/モル）、300mgのL-チロシンの（MR：181.19グラム/モル）、L-ウラシル（112.09グラム/モル）を200mg、およびL-バリン1.5gの（M rを：117.15グラム/モル）。二重蒸留水1Lにそれらを溶解し、溶液をオートクレーブ。 4℃で溶液を保管してください。
- テストの自己活性化のための酢酸リチウム媒介酵母形質転換
- ストリークサッカロマイセス・セレビシエレポーター株NMY51 40（NMY51：MATahis3Δ200trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2：:( lexAop）4-HIS3、URA3：:( lexAop）8-lacZをADE2：:( lexAop）8-ADE2 GAL4）からYPAD寒天プレート上のグリセロールストックを凍結し、30℃で48時間静置します。このプレートからコロニーを選択し、YPAD培地50 mLの接種。酵母が成長し、成長を監視するために定期的にOD 600を測定してみましょう。
- 酵母は0.5〜0.8の最終OD 600に成長しましょう。 5分間、700×gで、それらを遠心分離して細胞をペレット化し、二重蒸留、オートクレーブ処理水2.5 mL中に再懸濁します。
- 酵母懸濁液100μLで6アリコートを準備し、50の240μLを追加％w / vでポリエチレングリコール4000（PEG、M rを：3,500-4,000グラム/モル）、1 M酢酸リチウム二水和物の36μL（LiOAc、M rを：102.02グラム/モル）、およびw / vで2％の25μLサケ精子DNA（溶解）。二重蒸留、滅菌水で全ての試薬を準備します。
- "" "F"から酵母懸濁液を含む6バイアルにラベルを付けて、次のプラスミドベクターDNA追加：ネガティブコントロールを：エフェクター（pLexA-N-atp00189 28）と餌プラスミドの（a）の1.5μgの、（b）は（c）は、空のベイトベクターpLexA-N 41、及び（d）の1.5μgの空のベイトベクターpLexA-N1.5μgの空獲物プラスミドpGAD-HA1.5μgの空の獲物プラスミドpGAD-HA 41、1.5μgの。陽性対照：（e）のポジティブコントロールベイトプラスミドDNA pLexA-p53の41と正獲物プラスミドPACT-largeT 411.5μgの1.5μgの。自己活性化試験：（f）はBAの1.5μgのそれは、空の獲物プラスミドpGAD-HAのエフェクター（pLexA-N-atp00189）と1.5μgのプラスミド。
- 激しく反応を混合し、水浴中で42℃で45分間それをインキュベートします。 700×gで5分間、細胞をペレット化し、上清を捨てます。以下の選択プレート上で50μLを広める：（48.44グラム/モルのNaCl、Mのr）と：0.9％の250μL（w / v）の塩化ナトリウム溶液中で細胞を再懸濁SD-TRP、SD-Leuで、SD-trp-レイ、SD-TRP-レイ - 彼、およびSD-TRP-レイ-彼エイド。
- 30℃で4日間 - 3用のプレートをインキュベートします。インキュベーションの最初の日の後、乾燥からプレートを防止するために、プラスチック製のパラフィンフィルムでプレートをシール。
- プレート上の酵母の増殖を確認してください。
6.テストエフェクターの発現
- エフェクターときのN末端に結合されているLexのタグに対する抗体を用いてウェスタンブロット42によるエフェクターの発現をテストpLexA-Nから発現。
注：翻訳的に融合Lexのタグが目的のタンパク質の実際の重量は約24キロダルトンを追加することを検討してください。ウェスタンブロットでのタンパク質のサイズを特定する際に重要です。
7. Y2Hスクリーン
- ストリークpLexA-atp00189（エフェクター）は、新鮮なSD-TRPプレート上NMY51を-transformed、それは2のために成長させ - 赤いコロニーが出現するまで、30℃で3日間。
- 寒天プレートからの赤色コロニーと小さな揺れフラスコにSD-TRP培地の3ミリリットルを接種し、120で振とうしながら30℃で一晩インキュベート - 150 rpmで。
- 一晩培養物1mlで振とうフラスコ中のSD-TRPの20ミリリットルを接種し、それが8時間増殖してみましょう。
- SD-TRP媒体を追加することで、600 = 0.2をODとスターター培養各10mLで振盪フラスコ中で2回100ミリリットルを接種するために文化を調整します。 30℃で振盪しながら一晩増殖。
注：酵母がOD 6に成長していないことを確認します00> 0.5、新鮮なSD-TRPで希釈します。 - OD 600とペレット120 OD 600測定」を単位にしています。」 1.2のOD 600が測定されている場合、100ミリリットルをスピンダウンし、上清を捨て、および磁気攪拌棒を備えた振とうフラスコに予熱した2倍YPADの800 mL中にペレットを再懸濁。
- 2-mLのアリコートをスピンダウンし、上清を除去し、水にペレットを再懸濁。酵母懸濁液のOD 600が 0.15と0.2の間であることを確認してください。そうでない場合、2倍YPADで調整するか、一晩培養物からより多くの酵母を追加します。
注：2倍YPADは暗褐色であり、OD測定の結果に影響を与えることができます。したがって、ODを決定する前に水で酵母細胞を再懸濁することが必要です。代替として、2×YPAD媒体の暗い着色を防止するステップ5.1.8ノートに記載されているように、個別にグルコースを滅菌することにより調製することができます。
- 2-mLのアリコートをスピンダウンし、上清を除去し、水にペレットを再懸濁。酵母懸濁液のOD 600が 0.15と0.2の間であることを確認してください。そうでない場合、2倍YPADで調整するか、一晩培養物からより多くの酵母を追加します。
- アプリ内に残っている酵母培養液をインキュベートropriately（2Lのシェーカーフラスコ中で800mLのか、2 1Lのシェーカーフラスコに2×400ミリリットルを分割）振とうフラスコをサイズにし、30℃、120でインキュベート - 150 rpmで。 OD 0.6の600に到達するまで、すべての1.5時間から約OD 600を測定します （4とり- 6時間）。一方で、次のステップで説明するソリューションを用意。
- 酢酸リチウム媒介形質転換
- 水中でのw / vのサケ精子DNAを2％を溶解し、100℃の水浴中で5分間、500μLを沸かします。 2分間チューブを氷上に置き、加熱工程を繰り返します。さらに使用するまで氷上にDNAを保管してください。
- 以下のミックスを準備します。
- TE / LiOACミックス：、および無菌の二重蒸留水21.84ミリリットル：1 M LiOACの3.08ミリリットル、100 mMトリス/ 10mMのEDTA（7.5のpH）の3.08ミリリットルを混ぜます。
- PEG / LiOAcミックス：PEG 4000（w / v）であり、50％の33.6 mLの1 M LiOAcの4.2 mLを、mMトリス/ 10mMのEDTA（7.5のpH）の4.2ミリリットルを組み合わせます。
- 遠心分離機800-mLの酵母培養（OD 600 = 0.6）細胞をペレット化するため5分間、700×gで。上清を除去し、無菌の二重蒸留水200mLにペレットを再懸濁。 5分間、700×gで再び細胞をペレット化し、上清を捨てます。注：遠心操作するためのいくつかのバイアルに分周サスペンション必要な場合。 7.7.3内の液体のボリューム。および7.7.4。 800 mLの懸濁液から誘導されたペレット全体を参照してください。
- TE / LiOAcミックスの16ミリリットルでペレットを再懸濁（ステップ7.7.1.1を参照）。 5分間、700×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 TE / LiOACミックスの9.6 mL中にペレットを再懸濁。
- pGAD-HA-cDNAライブラリーのベクトルの7μgの12バイアル、2％のサケ精子DNAの100μL（ステップ7.7を参照）、およびPEG / LiOAcミックスの2.5 mLの次の反応は、適切なサイズの反応ポリプロピレン容器を中に混合する準備します。 12バイアルの各々にステップ7.10から酵母細胞懸濁液600μLを加え、1分間激しく混合します。
- 水浴ANに30℃で45分間反応ミックスをインキュベート勢いよく15分毎に混ぜるdは。すべてのバイアルにDMSOの160μLを加え、激しく混合します。 42℃でさらに20分間混合物をインキュベートします。
- 、5分間700×gで細胞をペレット上清を捨て、そして2倍YPAD 3mLに各ペレットを再懸濁します。プールの100mLの振とうフラスコ内（12バイアルから36ミリリットルの合計）は、すべての細胞および30℃、120 rpmで90分間、酵母を培養すること。
- 700×gで5分間、細胞をペレット化し、上清を捨てます。滅菌0.9％の4.5ミリリットル（w / v）のNaCl中でペレットを再懸濁し、慎重に10-mLの血清学的ピペットで上下にピペッティングによりよく混ぜます。 50μLを撤回し、1までの午前1時10分から0.9％NaCl中の十倍希釈液を準備：1,000。 SD-TRP-レイ寒天を含む90 mmのペトリ皿上の各希釈のプレート100μL。
- SD-TRP-レイ-彼-ADE寒天で16×150 mmの直径のペトリ皿上で希釈されていない酵母の再懸濁の残りの部分を広げます。自己活性化を低減するために培地に3-ATを追加します。 SD-TRP-レイをインキュベート30℃で4日間、3日間のプレートとSD-TRP-レイ-彼エイドプレート。
注：選択プレート上に表示されたクローンは、（潜在的な）相互作用ペアであり、餌相互作用パートナーのためのpGAD-HAプラスミドコーディングを運びます。 - SD-TRP-レイ選択プレート上の異なる連続希釈液のコロニーをカウントすることにより、トランスフェクション効率を決定します。新鮮なSD-TRP-レイ-彼-ADJ-選択プレート上で無菌ピペットチップでコロニーをピッキングし、ストリーキングによって各クローンを転送します。 30℃で24時間プレートをインキュベートします。 5通路の合計に達するまで毎日、この手順を繰り返します。
選択プレートからのクローンの8解析
- 無菌フードの下で各クローンのためのSD-TRP-レイ-彼-ADE 1mLで1滅菌2ミリリットルの反応管を準備します。ホット針で各チューブに穴をパンチし、ガス透過性シーラーの切れ端で穴をカバーしています。新鮮なコロニーメイトとの各バイアルに接種一つのクローン（ステップ7.17; 5 回目の通過後にクローンを使用）からのリアルさせ、回転数150rpmで振盪しながら、30℃で24時間インキュベート。
注：4℃で数日間保存されたプレートから採取した酵母は、液体培地中で24時間以内に十分に増殖しないので、それは新鮮なプレートからのクローンを取ることが重要です。 - 4,000×gで5分間、酵母をペレット化し、上清を捨てます。 （それぞれのプラスミドDNAミニプレップキットからの）適切な再懸濁緩衝液中にペレットを再懸濁し、新鮮な2.0 mLの反応管に移します。酸洗浄したガラスビーズ（425- 600ミクロンまでの直径）の100μLを加え、5分間激しく混合します。
- それぞれの溶解バッファーを追加し、製造者の指示に従ってプラスミド調製ミニキットを用いてプラスミド精製を進めます。 50μLの水でプラスミドDNAを溶出します。
- 獲物プラスミド特異的プライマー、GAL4ADseqとの配列決定反応のためのステップ8.3からDNAを使用しますREF "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3」。
- 同時変換デノボによって相互作用43、44ベイトおよびプレイベクターを確認します。 SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プレート上で形質転換した酵母を選択します。
Representative Results
実際Y2H画面を行うことができる前に、餌は、自己活性化のためにテストする必要があります。これは、空の餌ライブラリーベクターと共にベイト発現ベクターを形質転換し、選択プレート上での増殖を検査することによって達成されます。
ベイトプラスミドはTRPを補完し、獲物がS.セレビシエ NMY51 40のレイの栄養要求性をプラスミド部5で説明したようにphytoplasmalタンパク質ATP_00189が自己活性化であるか否かを分析するために、自己活性化試験を行いました。成功した同時形質転換は、このようにtrpおよびロイシンを欠く選択プレート上での増殖によって特徴づけられます。ベイトおよびプレイタンパク質の相互作用は、NMY51の彼とADEの栄養要求性の相補性につながります。相互作用の非存在下での餌による自己活性化が表示された場合、酵母は彼とADEを欠く選択プレート上で成長します。強者と弱者の自己活性化が発生する可能性があります。餌の強い自己活性化は、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上で同時形質転換した酵母の増殖を特徴とします。弱い自己活性化はなく、TRP-レイ-彼-ADE枯渇選択プレート上のtrp-leuへ-彼の成長につながります。適切な陽性対照は、自己活性化アッセイの結果を解釈するために不可欠です。自己活性化アッセイおよびそれらの解釈の期待される結果の概要を表1に提供され、 図1に可視化されます。
図1：Y2H スクリーンを実行する前に、ベイトのベイト自己活性化テストの例 。 、弱い自己活性化に加えて、空の獲物天秤座：S.セレビシエ NMY51はポジティブコントロール（AC左パネル ）として（PLEX-p53の）および獲物（PACT-largeT）餌を相互作用で同時形質転換しました。RYベクトル（ 中央のパネル：DF）とされない自己活性化餌プラス空の獲物のライブラリーベクター（ 右パネル：GI）。 、TRP、レイと彼：同時形質転換した酵母は、trpおよびレイ（、D、G上のパネル ）欠けているSDプレート上で培養した（ 中央のパネルを：B、E、H）とのtrp、レイ、彼とADE（ 下パネル：C、F、I）。ベイトベクターはNMY51のレイの栄養要求性（SD-TRP-レイ上での成長）のtrp栄養要求性と獲物のベクトルを補完するようtrpおよびレイを欠く培地上での選択は、同時形質転換の成功のための陽性対照です。ベイトおよびプレイや餌の自己活性化の間の相互作用の場合には、NMY51のレポーター発現がオンになり、彼とADEの栄養要求性（SD-TRP-レイ-彼-ADE上での成長）を補完します。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼のプレート上で成長することを特徴とする（ 中央のパネルは、df）。餌の弱い自己活性化は、前に餌を分析するために減少されなければなりませんY2H画面において、選択培地に3-ATを添加することによって、例えば 。アミノ酸の枯渇がで示されている「 - 」それぞれのメディア名に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| pLexA-N-atp00189 | なし | コロニー | 全く成長しません | 全く成長しません | 全く成長しません | 全く成長しません |
| なし | pGAD-HA | 全く成長しません | コロニー | 全く成長しません | 全く成長しません | 全く成長しません |
| pLexA-N | なし | コロニー | 全く成長しません | 全く成長しません | 全く成長しません | 全く成長しません |
| pLexA-N | pGAD-HA | コロニー | コロニー | 全く成長しません | 全く成長しません | |
| pLexA-p53を | PACT-largeT | コロニー | コロニー | コロニー | コロニー | コロニー |
| pLexA-N-atp00189 | pGAD-HA | コロニー | コロニー | コロニー | 全く成長しません | 全く成長しません |
表1：ベイト自己活性化アッセイで予想される結果。 S.セレビシエ NMY51の変換は、同時形質転換ベイトおよびプレイの特性に基づいて選択培地上の差動の成長にもたらします。選択プレート上での増殖は、30℃で72時間のインキュベーション後の異なるベクターの組合せ（AF）の形質転換の際に評価しました。弱い自己活性化は、SD-TRP-レイ-彼-ADE選択プラット上の成長によってSD-TRP-レイ - 彼との強い自己活性化に酵母増殖によって特徴付けられます相互作用パートナーの不在下でES。 pLexA-N符号化されたphytoplasmalエフェクターATP_00189はNMY51が彼とADEの非存在下で増殖するように形質転換された餌ベクトルのできないことによって特徴づけられる自己活性化を示しません。
餌に応じて、Y2H画面は選択プレート上で増殖する多数の酵母クローンを得ることができます。全てのクローンを分析し、可能な冗長性をチェックする必要があります。正規化されたcDNAライブラリーが使用された場合でも、インタラクターは、多くの異なるクローンで表される可能性が高いです。ライブラリーのクローニング技術によって、完全な遺伝子の断片のみが、いくつかの餌ベクターに挿入することも可能です。 （cDNAから）を増幅し、相互作用物質の完全長遺伝子をサブクローニングし、1対1 Y2H分析（ 図2）での相互作用をテストするために新たにすることが賢明です。
図2：Y2H 実験で、ベイトとプレイとの間の相互作用の例。酵母ツーハイブリッド（Y2H）画面を実施し、陽性の相互作用因子のクローンからプラスミドを精製しました。獲物ベクターは、配列決定したとマルスのx domesticaホスト相互作用パートナーMdTCP24とMdTCP25が同定されました。 （何の相互作用因子がY2Hライブラリ画面で確認されなかったために）ネガティブコントロールMdTCP34として並列にサブクローニングしました。完全長遺伝子は、餌ベクター（共cistronically活性化ドメインADを発現する）およびデノボ DNA結合ドメイン（BD）に接続された細菌のエフェクターATP_00189を発現ベイトベクターで同時形質転換にサブクローニングリンゴのcDNAから増幅しました。この数字は28から取得されます。 拡大表示するにはここをクリックしてください。この図のバージョン。
Discussion
Y2H画面では、潜在的なエフェクタータンパク質は、異なる仮想的な相互作用するタンパク質（ステップ7）と共発現です。各成長酵母クローンは、餌が、（潜在的に）異なる相互作用物質が含まれています。相互作用するタンパク質は、獲物プラスミド中にクローニングされたcDNAライブラリーでエンコードされています。ベイトとプレイは、酵母転写因子の一部は、各共同cistronicallyコードをプラスミド。ベイト（エフェクター）と獲物プラスミドにコードされた相互作用物質の間の物理的相互作用の場合には、2つの転写因子部分（DNA結合ドメインおよび活性化ドメイン）が一体化され、そしてレポーター遺伝子の発現が誘導されます。酵母はヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で増殖することができます。獲物cDNAライブラリーの種類をスクリーニングエフェクターに依存し、それに応じて選択されなければなりません。獲物とベイトベクター、ならびに酵母株は、互換性がなければなりません。この画面では、LexAのDNA結合ドメインとGAL4活性化domainは互換性のある酵母転写因子単位として使用しました。 cDNAライブラリーは、個別にカスタム得商業製、又は、構成することができます。 cDNAの獲物ライブラリーの調製は、このプロトコルの一部ではありません。このプロトコルでは、 マリュス第X domestica葉のRNAからの自己構築し、正規化されたcDNAライブラリーを使用し、pGAD-HA 41にクローニングしました。酵母株を発現性エフェクター（ベイト）は獲物ライブラリーで形質転換し、クローンはヒスチジンおよびアデニン枯渇SD選択プレート上で選択しました。酵母コロニーからプラスミドDNAを抽出するには、細菌の列ベースのDNAプラスミドミニキットは、酵母溶解（ステップ8）を改善するために、ガラスビーズを用いて機械的破壊のステップと組み合わせてお勧めします。このプラスミド精製では、ベイトおよびプレイベクターは、比較的低濃度で同時に精製されるであろう。しかしながら、プラスミドDNAの量は、配列決定ウィット介して相互作用パートナーを同定するために十分ですハウト前プラスミド増殖（ステップ8.4）。別の方法として、ステップ8.4で精製されたDNAは、コンピテント大腸菌に形質転換することができ、（ 例えば、pGAD-HAの場合にはアンピシリン）獲物ベクター媒介抗生物質耐性により選択します。選択された大腸菌コロニーは、pGAD-HAライブラリープラスミドを運び、かつ高収率プラスミド精製は、これらのクローンを用いて行うことができます。
pLexA-NとpGAD-HA構築物を形質転換の成功はNMY51のトリプトファンおよびロイシン栄養要求性を補完します。エフェクターおよびタンパク質（pGAD-HAにコードされる）との間の相互作用はNMY51株におけるレポーターシステムの活性化をもたらします。自己活性化の場合には、NMY51が原因NMY51レポーター系の望ましくない活性化にpGAD-HAは、TRP-レウ-彼-ADEを欠く選択プレート上で成長し、空のライブラリーベクターと組み合わせてpLexA-Nを発現するエフェクターで形質転換します40。自己活性化は、ワットすることができますEAKおよびTrp-Leuの-彼の不在下で発生する可能性があります、または活性化が強くなるとのtrp-leuへ-彼-ADEプレート41上に成長することを特徴とすることができます。自己活性化は、実際のY2H画面における偽陽性クローンの大規模なバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これを回避するために、ベイト自己活性化試験を実施しなければならない、エフェクター発現ベクターは空のライブラリーベクターで同時形質転換しました。この実験設定では、レポーター遺伝子の発現が誘導されてはなりません。自己活性化（ すなわち、選択プレート上で成長）試験で表示されている場合、媒体は、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール45（3-AT）の種々の濃度で補充することができます。 3-ATはimidazoleglycerolリン酸デヒドラターゼ（HIS3）、ヒスチジン生合成46の間に重要な酵素の阻害剤です。 3-ATの補充は、Y2Hスクリーン47の間に自己活性化の弱い影響を低減することができます48。 3-ATの異なる濃度の試験すべきです。このプロトコルでは - 1 40mMの3-ATを使用しました。自己活性化の抑制につながる最低濃度は、その後Y2H画面で使用されるべきです。同時形質転換のSD-TRP-Leuのプレートは、クローンの十分な数が含まれている場合、自己活性化アッセイの選択プレートのみを評価することができます。表示≥として90ミリメートル（直径）ペトリ皿当たり500コロニーが十分です。正確なトランスフェクション効率を決定するために、同時形質転換した酵母の連続希釈液を準備し、SD-TRP-Leuのプレート上にそれらを広げることをお勧めします。
自己活性化を減少させるために、エフェクターはpLexA-C、タンパク質のC末端へのLexAタグを融合ベイト発現ベクターにクローニングすることができます。レックスタグの向きは、自己活性化24を減衰させることができます。しかし、自己活性化を低減または廃止するすべての場合には不可能です。の形成赤色系のコロニーが弱いまたは偽陽性の相互作用を示しています。それは、タンパク質間相互作用に来るときNMY51のADE2レポーター遺伝子のみが活性化されるターンブロックで、この酵母株40における赤色色素の蓄積。強力な相互作用を運ぶコロニーは白色である一方で相互作用が存在しない場合には、NMY51は、赤みを帯びています。選択プレート上のコロニーの色の観察は、このようにそれぞれのコロニーが真陽性または偽陽性相互作用しているかどうかを判断するために、さらに重要なヒントを提供します。
適応や餌の性質と相互作用特性に関して、特定のアッセイの設定を変更することが最終的に必要です。今では、改善と共通Y2Hの派生技術の数が異なるホスト・システムではなく、困難なタンパク質相互作用の分析を可能にするために確立されています。 Stynen らによるレビュー。 49アドレスNDはY2H、その改善、および適応のさまざまな側面を説明し、このようにして、適切な相互作用アッセイを選択する方法についての有益な情報を提供しています。
Y2Hスクリーン派生技術が広くバイナリタンパク質相互作用の同定が必要とされる限り、異なる研究分野で使用されるようになっています。重要なコントロールが、そのような餌の自己活性化試験および同定相互作用タンパク質の一対一の再変換のように、実行された場合でも、Y2Hは誤った結果26、50、51を生成しやすいです。モデルとしての酵母は、すべての相互作用の研究には適していません。酵母は、必ずしもすべてのタンパク質24のための適切な翻訳後修飾や折りたたみをサポート細胞環境を構成するものではありません。また、Y2H設定で、タンパク質が過剰発現され、それらの発現は、コントロールではありませんその天然のプロモーターが率います。 Y2Hは、必ずしもそれらの自然の細胞内宛先ではない核へのタンパク質性相互作用パートナーを強制します。相互作用のネイティブの細胞の状況は、このように酵母によって反映されない場合がありますと、偽陰性または偽陽性結果につながる可能性があります。ほとんどのY2Hは、選択原則として酵母栄養要求性の相補性に基づいています。この栄養選択は、高感度によって特徴づけられるが、他に比べて減少した選択性を犠牲にして（ 例えば、発色性レポーター）が49をアッセイされます。非還元自己活性化（上記参照）または他の制限は、特定のエフェクターのために発生した場合、Y2Hは、適切なアッセイ25ではありません。 表1及び図1に、自己活性化試験の予想結果が与えられています。実際の相互作用（ すなわち、偽陰性）の不在は、タンパク質の毒性、誤った翻訳タンパク質によって引き起こされる可能性が処理、相互作用の立体障害、過小評価獲物ライブラリ内の相互作用パートナー、餌の膜局在化、または相互作用24のために必要な不足しているコンポーネント。
餌を発現への構築、cDNAから同定された相互作用するタンパク質の完全長遺伝子を増幅pGAD-HAにそれをサブクローニングし、生成されたpGAD-HAを変換することにより、1対1の相互作用アッセイを行うデノボに推奨されますNMY51株。獲物ライブラリーに存在する観測された相互作用因子だけより大きなタンパク質の断片であるかもしれないので、これは必要です。しかし、それぞれの完全長遺伝子の情報がかなりのゲノムおよびトランスクリプトーム配列データが利用可能である場合にのみアクセス可能です。ここに記載の自己活性化アッセイのための形質転換プロトコールは、一対一のアッセイに適用することができ、かつ餌と相互作用因子との間の相互作用が再現可能でなければなりません。
マリュスののx domesticaが ニコチアナベンタミアナで二分子蛍光相補性（BIFC）と植物体で確認されたのTCP転写因子との相互作用は、28（このプロトコルの一部ではない）をプロトプラスト。エフェクタータンパク質のATP_00189は、植物病原体のP.マリから派生しました。 プランタ BIFC ではこのようにマルスのx domesticaの転写因子とのATP_00189相互作用を確認するために選ばれました 以前Y2H 28で識別されました。 BIFCは、レポーター系を活性化するために、核への相互作用するタンパク質の細胞内移行を必要としない、タンパク質 - タンパク質相互作用アッセイです<SUPクラス= "外部参照"> 52。さらに、 植物体の発現および変形例では機械がその植物宿主中の植物細菌のエフェクター間の自然の相互作用の環境を模倣します。しかし、BIFCを使用してグローバル画面は現実的ではありません。
慎重に対処しなければならないプロトコルにはいくつかのステップがあります。関心（ステップ4）の遺伝子を増幅する場合には、プライマーは、植物DNAに結合することを排除することが重要です。このように、非感染植物からのDNAは、陰性対照として含まれている必要があります。目的の遺伝子の配列は、インサートの方向性クローニングのために使用されたEcoRIおよびSalI制限部位を含んではなりません。シーケンスは、これらのサイトが含まれている場合は、クローニングのための異なる制限酵素を選択する必要があります。酵母の形質転換は、このプロトコル中の中心的なメソッドです。トランスフェクション効率は、酵母細胞、それらの生存率、増殖状態、およびトランスフェクションの質の能力に依存REAGENT 53、54。提案されたプロトコルの場合、非常に変換を実行するときに2週間（4℃で保存）よりも古くない新鮮なプレートから酵母を使用することをお勧めします。選択液体培養が古い寒天プレートからコロニーを接種されたとき、多くの場合、形質転換酵母の成長が遅れています。プレートから直接酵母を使用するように、実際の実験のための接種物としての液体スターター培養物を使用しないためにも有用です。低効率は、ベイトを発現する酵母に獲物をトランスフェクトするときは、特定の獲物タンパク質（潜在的な相互作用）の過少につながることができますので、画面全体を歪曲することができます。このプロトコルでは、Y2Hで〜15万のcfu /μgでトランスフェクトされたDNAの酵母トランスフェクション効率はよく働きました。
Y2H技術の欠陥や欠点を知り、重要かつ適切な方法で結果を解釈すると、CORRを描画することが不可欠です電気ショック療法の結論。 Y2Hアッセイおよび誘導体は、長年使用されており、異なる餌特性に対して多くの改良及び適応を受けた、相互作用の細胞内局在性は、相互作用のために必要とされるかもしれない期待結合パートナー、およびその他の要因が（参照しますY3H 55、56、57）。最近では、アレイベースのY2Hスクリーンは獲物58の何百万人に対する多数の餌の自動化、ハイスループット分析を可能にするように開発されてきました。今後は、最も可能性の高い別の研究分野における複雑なシグナル伝達経路とインタラクトームの解明を可能にするために、このアッセイに自動化と高スループットのアプローチです。
Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、原稿を校正するための技術支援のためのDualsystemsバイオテックAGとジュリアシュトローブルからLaimburg研究センターとMirelleボルヘスディアスSchnetzerからクリスティンKerschbamer、トーマスLetschka、ザビーネOettl、マーゴットラファイナー、フロリアンSenonerに感謝します。この作品はAPPL2.0プロジェクトの一環として実施し、部分的にボルツァーノ/ボルツァーノ、イタリアの自治州と南チロルアップルコンソーシアムによって資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Applichem | A6284 | for DNA preparation |
| Trishydroxymethylaminomethane (Tris) | Applichem | A2264 | for media and buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | for media and buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) | Applichem | A2937 | for media and buffer |
| N-Lauroylsarcosin sodium salt | Applichem | A7402 | for DNA preparation |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich (Fluka) | 9688 | for DNA preparation |
| 2-mercaptoethanol | Applichem | A1108 | for DNA preparation |
| Isopropanol (2-Propanol) | Applichem | A3928 | for DNA preparation |
| Ethanol | Sigma-Aldrich (Fluka) | 51976 | for DNA preparation |
| RNAse | Applichem | A2760 | for DNA preparation |
| Chloroform:Isoamyl 24:1 | Applichem | A1935 | for DNA preparation |
| Proofreading Polymerase (e.g. iProof) | Bio-Rad | 203433 | for PCR |
| EcoRI | Thermo Scientific | ER0271 | for cloning |
| SalI | Thermo Scientific | ER0641 | for cloning |
| Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) | Qiagen | 28104 | for cloning |
| Kanamycin Sulfate | Applichem | A1493 | for microbiological selection |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | for self-activation assay |
| L-Arginine Monohydrochloride | Applichem | A3680 | for yeast culture |
| L-Isoleucine | Applichem | A3642 | for yeast culture |
| L-lysine Monohydrate | Applichem | A3448 | for yeast culture |
| L-Methionine | Applichem | A3897 | for yeast culture |
| L-Phenylalanine | Applichem | A3464 | for yeast culture |
| L-Threonine | Applichem | A3946 | for yeast culture |
| L-Tyrosine | Applichem | A3401 | for yeast culture |
| L-Uracile | Applichem | A0667 | for yeast culture |
| L-Valine | Applichem | A3406 | for yeast culture |
| L-Adenine Hemisulfate Salt | Applichem | A1596 | for yeast culture |
| 0.22 µm Pore Filter | Sartorius | 16541 | for sterile filtration |
| L-Histidine Monohydrochloride | Applichem | A3719 | for yeast culture |
| L-Leucine | Applichem | A3496 | for yeast culture |
| L-Tryptophane | Applichem | A3410 | for yeast culture |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | 51483 | for yeast culture |
| D-Glucose Monohydrate | Applichem | A1349 | for yeast culture |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641-1 | for yeast and bacteria culture |
| Peptone | Applichem | A2208 | for yeast culture |
| Polyethylene Glycol 4000 (PEG) | Applichem | A1249 | for yeast transformation |
| Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) | Applichem | A3478 | for yeast transformation |
| Salmon Sperm DNA | Applichem | A2159 | for yeast transformation |
| Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) | Millipore | 06-719 | for Western blot |
| Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) | Sigma-Aldrich | PLN350 | for plasmid purification from yeast and bacteria |
| Acid Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | for plasmid purification from yeast |
| Ampicillin Sodium Salt | Applichem | A0839 | for microbiological selection |
| Yeast Extract | Applichem | A1552 | for yeast culture |
| Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) | Eppendorf | Z368245 (Sigma) | for DNA preparation |
| Bait vector (e.g. pLexA-N) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Prey vector (e.g. pGAD-HA) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control prey vector (e.g. pLexA-p53) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control bait vector (e.g. pACT-largeT) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) | Invitrogen | C640003 | for cloning |
| Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | for yeast and bacteria culture |
| Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) | Greiner | 676 051 | for yeast culture |
| PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) | Bio-Rad | 1861096 | for PCR |
| quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) | Bio-Rad | 1855195 | for quantitative PCR |
| Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) | Eppendorf | 5417 R | general lab equipment |
| Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) | Eppendorf | 5804 R | general lab equipment |
| Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) | 5Prime | 2500010 | for PCR and DNA works |
| Scalpell | Swann-Morton | 0301 | for DNA preparation |
| Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) | VWR-International | 514-0073 (European Catalogue number) | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 90 mm | Greiner Bio-One | 633180 | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 150 mm | Greiner Bio-One | 639161 | for yeast culture |
| Photometer (e.g. BioPhotometer) | Eppendorf | 550507804 | for yeast culture |
| Photometer Cuvettes | Brand | 759015 | for yeast culture |
| Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) | Memmert | WB7 | for yeast transformation |
| Western Blot Equipment | Bio-Rad | diverse | for protein detection |
| dNTPs | 5Prime | 2201210 | for cloning |
| Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) | Sigma Aldrich | Z232793, Z232858, Z232866 | for yeast and bacteria culture |
| Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) | GFL | 3031 | for yeast and bacteria culture |
| Incubator | Binder | KB 53 (E3.1) | for yeast and bacteria culture |
| Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) | Omniwash | IF 825 | general lab equipment |
| 0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) | Eppendorf | 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) | general lab equipment |
| Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) | Eppendorf | diverse | general lab equipment |
| Spreader | Sigma-Aldrich | SPR-L-S01 | for yeast and bacteria culture |
| Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) | IKA | 3617000 | general lab equipment |
| T4-Ligase | Thermo Fisher | EL0011 | for cloning |
| Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) | Liebherr | 81.767.580.4 | general lab equipment |
| Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) | Liebherr | G5216 | general lab equipment |
| Graduated Cylinder (e.g. Brand) | Sigma Aldrich | Z327352; Z327417; Z327441 | general lab equipment |
| Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) | Thermo Fisher | S55701 | for yeast and bacteria culture |
| Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) | Integra-Biosciences | 155000 | general lab equipment |
| Cuvettes for Electroporation (1 mm) | Molecular Bio Products | 5510-11 | for bacteria transformation |
| Electroporator (e.g. Eporator) | Eppendorf | 4309000019 | for bacteria transformation |
| Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) | Bio-Rad | 1708280 | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) | VWR-International | 525-0403 (European Catalogue number) | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) | BD Falcon | 352096 | general lab equipment |
| Dithiothreitol (DTT; 1 M) | Thermo Scientific | P2325 | for ligation |
| adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) | Ambion | AM8110G (distributed by Thermo Scientific) | for ligation |
| Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) | Sigma-Aldrich | Y2021 Sigma | for yeast culture (ready-made mix) |
References
- Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
- Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
- Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
- Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
- Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
- Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
- Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
- Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
- Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
- Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
- Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
- McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
- Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
- Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
- Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
- Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
- MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
- Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
- van Criekinge, W., Beyaert, R.
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
- Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
- Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
- Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
- Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
- Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
- Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
- Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
- Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
- Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
- Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
- Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
- Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
- Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
- Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
- Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
- Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
- Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
- Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
- Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
- Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
- Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
- Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
- Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
- Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
- Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
