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Immunology and Infection

एक गैर-कृषि योग्य संयंत्र पैथोजन से एक जीवाणु प्रेरक के फंक्शन Unravelling एक खमीर दो संकर स्क्रीन का उपयोग

Published: January 20, 2017 doi: 10.3791/55150
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

Summary

बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन सफल संक्रमणों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल अपनी प्राकृतिक संयंत्र की मेजबानी में एक जीवाणु प्रेरक प्रोटीन की प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की प्रयोगात्मक पहचान का वर्णन है। खमीर दो संकर स्क्रीन के माध्यम से इन प्रेरक बातचीत की पहचान आणविक pathogenicity रणनीतियों को उजागर करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है।

Abstract

बीमारी अभिव्यक्तियों के आणविक तंत्र Unravelling संयंत्र विज्ञान के क्षेत्र में विकृतियों और लक्षण विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरिया अपने स्वयं के लाभ के लिए अपने मेजबान चयापचय में हेरफेर करने के लिए अलग रणनीति विकसित किया है। यह जीवाणु हेरफेर अक्सर गंभीर लक्षण विकास या प्रभावित पौधों की मौत के साथ युग्मित है। मेजबान हेरफेर के लिए जिम्मेदार विशिष्ट जीवाणु अणुओं का निर्धारण सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गया है। इन बैक्टीरिया के अणुओं कहा जाता है, की पहचान करने के बाद "प्रभावोत्पादक," यह उनके कार्य को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक स्पष्ट दृष्टिकोण निर्धारित करने के लिए एक प्रेरक का कार्य एक खमीर दो संकर (Y2H) स्क्रीन के माध्यम से अपनी प्राकृतिक मेजबानी में अपने प्रोटीन बाध्यकारी साथी की पहचान है। आम तौर पर मेजबान कई संभावित बंधन भागीदारों कि सिलिको एल्गोरिथ्म में से किसी ने पर्याप्त भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, बंदरगाहों। यह इस प्रकार perfo करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हैमेजबान व्यक्त प्रोटीन की एक पूरी पुस्तकालय के खिलाफ काल्पनिक प्रेरक के साथ एक स्क्रीन RM। यह विशेष रूप से चुनौती दे रहा है, तो प्रेरणा का एजेंट phytoplasma तरह अकृष्य है। इस प्रोटोकॉल एक phytoplasma संक्रमित वुडी मेजबान संयंत्र, संभावित प्रेरक के प्रवर्धन, और एक Y2H स्क्रीन के साथ पौधे की आणविक बातचीत साथी के बाद पहचान से डीएनए शुद्धि के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। हालांकि Y2H स्क्रीन आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ जैव प्रौद्योगिकी कंपनियों को लागत से Y2H सेवा की पेशकश करने के लिए इस तकनीक को आउटसोर्स करने के लिए एक प्रवृत्ति है। इस प्रोटोकॉल कैसे किसी भी शालीनता से सुसज्जित आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला मानक प्रयोगशाला तकनीक का उपयोग कर एक Y2H प्रदर्शन करने पर निर्देश प्रदान करता है।

Introduction

खमीर दो संकर स्क्रीन (Y2H), 11 के बारे में 27 साल पहले 1 विकसित और के बाद से व्यापक रूप से विशिष्ट प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 निर्धारित करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है रहे थे । एक मेजबान के लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक जीवाणु प्रेरक के भौतिक बातचीत अक्सर इस लक्ष्य प्रोटीन के कार्यात्मक हेरफेर के लिए पूर्व शर्त है। इन मुलाकातों का विश्लेषण संक्रमण जीव विज्ञान 12, 13, 14, 15 के कई अलग अलग क्षेत्रों का ध्यान केंद्रित करने के लिए ले जाया गया है,"> 16, 17, 18। Y2H स्क्रीन का सिद्धांत है कि दो प्रोटीन की बातचीत एक कार्यात्मक प्रतिलेखन कारक है कि रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव के पुनर्गठन की ओर जाता है। जाना जाता प्रेरक (" चारा ") translationally जुड़े हुए है डीएनए बाध्यकारी डोमेन प्रतिलेखन कारक की (DBD), और संभावित बातचीत भागीदारों ( "शिकार") संबंधित प्रतिलेखन कारक की सक्रियता के डोमेन (ई) से जुड़े हुए हैं। चूंकि बातचीत साथी अज्ञात, क्षमता का एक पुस्तकालय है interactors एक उपयुक्त शिकार वेक्टर अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में cDNAs क्लोनिंग विज्ञापन है कि चारा-वेक्टर इनकोडिंग DBD के साथ संगत है एन्कोडिंग द्वारा तथाकथित में क्लोन है "शिकार पुस्तकालय।" आम तौर पर, इस पुस्तकालय बना है। एक बातचीत के मामले में, पुनर्गठन प्रतिलेखन कारक रिपोर्टर जीन है, जो आम तौर पर खमीर के विकास चयन सक्षम की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित। Theinteractors की पहचान प्लाज्मिड विशिष्ट प्राइमरों के साथ शिकार प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा हासिल की है।

बैक्टीरिया में हेरफेर और अपने मेजबान की चयापचय शोषण या सुरक्षा तंत्र से बचने और विभिन्न जीवाणु स्राव सिस्टम 19, 20, 21 के माध्यम से प्रेरक अणुओं का स्राव करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को विकसित किया है। इन बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक के बंधन भागीदारों का निर्धारण इस प्रकार की मेजबानी में चालाकी से मार्ग की पहचान करने में पहला कदम है। इस विशिष्ट pathogenicity तंत्र का एक बेहतर समझ की ओर जाता है।

Y2H स्क्रीन phytoplasmoses दौरान बैक्टीरियल प्रेरक बातचीत की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं, और अक्सर, Y2H phytoplasma अनुसंधान 22, 23 में आणविक pathogenicity तंत्र के आगे लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक प्रयोग है। हालांकि, मुलाकातसबसे प्रकाशनों में विभागाध्यक्ष विवरण नहीं बल्कि दुर्लभ है, और इन तकनीकों अक्सर बायोटेक कंपनियों को आउटसोर्स कर रहे हैं। इस विधि की व्यवहार्यता की ओर ध्यान आकर्षित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल कदम-दर-कदम जानकारी अपनी प्राकृतिक मेजबान में एक जीवाणु प्रेरक अणु की बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए प्रदान करता है।

व्यापक उपयोग और Y2H स्क्रीन के तेजी से आगे दृष्टिकोण के बावजूद, यह नहीं भूलना चाहिए कि कुछ बातचीत खमीर प्रणाली में घटित नहीं हो सकता है। यह सच है कि खमीर सेल कुछ जैविक सीमाओं के साथ "इन विवो प्रतिक्रिया पोत" का एक प्रकार के रूप में प्रयोग किया जाता है के कारण है। कई लेखकों फायदे और Y2H और उसके डेरिवेटिव 11, 24, 25, 26, 27 के नुकसान को संबोधित किया है। जनरल विचार उदाहरण के लिए, कर रहे हैं, कि खमीर सेल उचित नहीं प्रदान कर सकता हैजीन अभिव्यक्ति, (पोस्ट) translational, या संबंधित प्रोटीन के लिए translocational की स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है। इस स्क्रीन में झूठी नकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सकारात्मक बातचीत के बदले में कलाकृतियों हो सकता है और (उचित मेजबानी में यानी, प्रभावोत्पादक के मामले में) प्राकृतिक स्थिति में होते नहीं हो सकता है। इस प्रकार यह एक अधिक बारीकी से संबंधित जैविक प्रणाली में एक स्वतंत्र बातचीत परीक्षण के साथ heterologous खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली से बातचीत की पुष्टि के लिए अपरिहार्य है।

इस अध्ययन में, गैर-कृषि योग्य संयंत्र रोगज़नक़ Candidatus Phytoplasma माली (पी माली) से प्रेरक ATP_00189 के बंधन भागीदारों की पहचान की गई। परिणाम सेब प्रसार 28, एक रोग है कि यूरोप में 29 प्रभावित सेब उत्पादक क्षेत्रों में उच्च आर्थिक नुकसान का कारण बनता है के लक्षण विकास अंतर्निहित आणविक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Protocol

1. संक्रमित एप्पल के पेड़ से रूट और पत्ती के नमूने इकट्ठा

नोट: पैथोजन विशिष्ट डीएनए जड़ों या पत्तियों से शुद्ध किया जा सकता है। निम्न अनुभाग दोनों का नमूना लेने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

  1. डीएनए तैयारी के लिए
    1. नमूना संग्रह और जड़ों से तैयारी
      1. "एप्पल प्रसार" विशिष्ट लक्षण 30, 31 और नियंत्रण पेड़ है कि लक्षण मुक्त हैं साथ संक्रमित पेड़ को पहचानें। 1 सेमी और के बारे में 5 सेमी की लंबाई - स्वच्छ करतनी का प्रयोग, 0.5 की एक व्यास है कि रूट नमूने काटा। तीन अलग-अलग, जड़ प्रणाली के दूर साइटों से कट नमूने, और उन्हें पर्याप्त रूप से लेबल प्लास्टिक बैग में डाल दिया।
        1. ठंडा थर्मल पैक के साथ एक ठंडा बॉक्स में नमूने रखें और आगे की प्रक्रिया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में उन्हें दुकान।
          नोट: रूट वास्तुकला और संरचना शारीरिक स्थिति ओ के संबंध में भिन्न हो सकते हैंपेड़ च। यह तीन अलग-अलग स्थलों पर नमूने के लिए और भी पतली rootlets लेने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है, लेकिन लंबे समय तक भंडारण बार ढलाई के जोखिम को बढ़ा सकते हैं। खोटा के नमूने डीएनए तैयारी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।
      2. पानी के साथ जड़ नमूने कुल्ला मिट्टी हटाने के लिए। उन्हें एक बाँझ पेट्री डिश में डाल दिया और जड़ एपिडर्मिस और कोर्टेक्स को हटाने के लिए एक निष्फल छुरी का उपयोग करें।
        1. एक साफ, प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक के साथ छुरी साफ साफ, 70% (v / v) इथेनॉल पानी के घोल में डुबाकर, और इस पर एक खुला लौ (जैसे, लेम्प बर्नर) गर्मी बाँझ। एक बाँझ 2.0 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में कटा हुआ फ्लोएम के 100 मिलीग्राम - छुरी के साथ फ्लोएम स्क्रैच, छोटे टुकड़ों में काट, और विभाज्य 30। कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहित करें।
    2. नमूना संग्रह और पत्तियों से तैयारी
      1. एक संक्रमित और एक स्पर्शोन्मुख नियंत्रण पेड़, एक को पहचानेंरों कदम 1.1.1.1 में वर्णित है, और पेड़ प्रति दस पूरा हुआ पत्ते उठाओ। शर्त के अनुसार एक पेड़ के लिए पर्याप्त है।
      2. पानी के साथ पत्तियों कुल्ला और 70% (v / v) इथेनॉल समाधान छिड़काव द्वारा सतहों को साफ। एक बाँझ पेट्री डिश में पत्ते डाल दिया है और एक बाँझ छुरी के साथ प्रत्येक पत्ती के midrib (केंद्रीय नस) काटना। midrib से एपिडर्मिस और कोर्टेक्स निकालें, छोटे टुकड़ों में midrib में कटौती, और एक बाँझ 2.0 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में midrib ऊतक के विभाज्य 100 मिलीग्राम। नमूने के लिए कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए तैयारी या दुकान के लिए तुरंत प्रयोग करें।
        नोट: यह 100 मिलीग्राम के कुछ भागों में संयंत्र सामग्री विभाज्य के लिए सुविधाजनक है और अंततः उन्हें भंडारण के लिए फ्रीज करने के लिए। प्रत्येक विभाज्य सीधे डीएनए की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के बाद से जमे हुए संयंत्र सामग्री हिस्सा के रूप में करने के लिए जाता है वजनी गहरे जमी संयंत्र सामग्री, बोझिल है।

2. Cetyltrimethylammonium ब्रोमाइड (CTAB) आधारित डीएनए की तैयारी

32 में वर्णित एक संशोधित प्रोटोकॉल पर आधारित किया जाता है।

  1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
    1. CTAB बफर: (: 364.45 जी / मोल CTAB, एम आर), 100 मिमी trishydroxymethylaminomethane (Tris, एम आर: 121.14 जी / एमएल), 1.4 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl, एम आर: 58.44 छ 1% w / v cetyltrimethylammonium ब्रोमाइड भंग पानी में 372.24 जी / मोल) और उन्हें पीएच 8.0 करने के लिए समायोजित: / मोल), और 20 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक (NaEDTA, एम आर।
    2. एन Lauroylsarcosine बफर: 100 मिमी Tris, और पानी में 20 मिमी NaEDTA और 8.0 पीएच को समायोजित: 10% w / वी एन lauroylsarcosine सोडियम नमक 33 (293,38 जी / मोल एम आर) भंग।
    3. Tris EDTA (ते) बफर: पानी और autocl में 10 मिमी Tris और 1 मिमी NaEDTA भंगसमाधान AVE।
    4. अमोनियम एसीटेट समाधान: पानी में घोल और 120 डिग्री सेल्सियस पर यह आटोक्लेव और 20 मिनट के लिए 1.2 बार: एक 5 एम अमोनियम एसीटेट (77,0825 जी / मोल एम आर) तैयार करें।
  2. CTAB बफर के 300 μL, एन Lauroylsarcosine बफर के 30 μL, proteinase कश्मीर के 6 μL (10 माइक्रोग्राम / μL), और 12 की μL के साथ ताजा या फ्रोजन कटा संयंत्र सामग्री (कदम 1.1.2.2।) के 100 मिलीग्राम - 30 मिक्स 2-मर्केप्टोइथेनाल 34 (एम आर: 78,13 जी / मोल)। 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए हिला। मिश्रण आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान को ठंडा होने दें।
  3. अमोनियम एसीटेट समाधान के 360 μL जोड़ें और सख्ती मिश्रण। समाधान 5 मिनट के लिए बैठते हैं, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर यह अपकेंद्रित्र करते हैं। एक साफ शीशी स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और ठंडा isopropanol 35 की 720 μL जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए डीएनए वेग।
  4. 4 पर 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्रसी ° और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ठंडा 70% इथेनॉल के 500 μL के साथ गोली धो लें और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर नीचे स्पिन।
  5. इथेनॉल सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तुरंत अवशिष्ट बूंदों को दूर करने के लिए एक साफ कागज तौलिया पर शीशी डुबकी। जितना संभव हो उतना तरल को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। 15-20 मिनट के लिए या एक वैक्यूम concentrator सेंट्रीफ्यूज में 2-3 मिनट के लिए गोली हवा शुष्क। नहीं अतिरिक्त हीटिंग या बढ़ाया वाष्पीकरण बार से गोली ओवर-सूखी है।
  6. ते बफर के 700 μL में गोली Resuspend और अंत में यह 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म भंग की सुविधा के लिए। (10 माइक्रोग्राम / μL) RNAse के 10 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते, 300 rpm पर मिलाते हुए।
  7. क्लोरोफॉर्म के 700 μL जोड़ें: isoamyl शराब 36 24: 1 और अच्छी तरह मिलाएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र और एक नया, साफ शीशी के लिए सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी चरण हस्तांतरण।
  8. जोड़कर सतह पर तैरनेवाला में डीएनए वेग(: 60.1 जी / मोल isopropanol, एम आर) और -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए incubating 2-propanol 35 के 700 μL। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के 500 μL के साथ गोली धो लें। 2.5 कदम के रूप में वर्णित गोली सूखी। ते के 50 μL में भंग।

3. पता लगाने Candidatus Phytoplasma माली विशिष्ट पीसीआर द्वारा डीएनए

  1. डीएनए nuclease मुक्त पानी में संयंत्र सामग्री 1:10 से शुद्ध पतला और रोगज़नक़ विशिष्ट प्राइमरों 37 के साथ एक पीसीआर चला रहे हैं।
    1. प्राइमर और पी माली phytoplasma 37 के लिए विशेष जांच के साथ एक मात्रात्मक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके सामग्री संयंत्र में पी माली विशिष्ट डीएनए की उपस्थिति को सत्यापित करें। सीए के लिए संबंधित जांच के साथ ही पीसीआर के प्रदर्शन से अन्य 16SrX phytoplasma सदस्यों की अनुपस्थिति की जांचएन डी। पी prunorum और Cand के लिए। पी pyri डीएनए 37।
      नोट: एक गैर संक्रमित पेड़ से डीएनए इस पर नियंत्रण में एक रोगज़नक़ के अभाव पुष्टि करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण किया जाना चाहिए। इस चरण में, यह महत्वपूर्ण है कि अन्य निकट से संबंधित phytoplasma प्रजातियों से डीएनए नमूने में अनुपस्थित है कि जब से पी माली के अलावा किसी अन्य प्रजातियों से phytoplasma प्रेरक amplifying का खतरा बढ़ जाएगा। एक और बारीकी से संबंधित पी माली 16SrX समूह phytoplasma के साथ एक मिश्रित संक्रमण संबंधित जांच के साथ नमूना विश्लेषण करके की संभावना से इनकार किया है। चूंकि अपेक्षित परिणाम अन्य 16SrX phytoplasma के लिए नकारात्मक होना चाहिए, यह उचित सकारात्मक नियंत्रण है कि पीसीआर प्रभावकारिता का संकेत शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. संभावित प्रेरक जीन amplifying और Y2H चारा वेक्टर में subcloning

  1. पी के phytoplasmal जीन atp_00189 (संकेत पेप्टाइड हिस्सा शामिल नहीं) बढ़ाना प्राइमरों 5 का उपयोग कर माली-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (आगे) और 5 TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (रिवर्स), 5 'और 3' समाप्त होता है, क्रमशः EcoRI और साली के लिए प्रतिबंध साइटों के साथ। एक स्तंभ आधारित डीएनए शुद्धि विधि के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध।
  2. Y2H चारा वेक्टर pLexA-एन EcoRI और साली बंधाव माध्यम में amplicon क्लोन।
    नोट: यहाँ, EcoRI और साली के 100 एनजी linearized pLexA-एन वेक्टर इसी तरह पीसीआर amplicon और 1 यू टी -4 ligase atp_00189 पच के 15 एनजी के साथ जोड़ दिया गया था। बंधाव (25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.9) 40 मिमी Tris एचसीएल युक्त बफर में प्रदर्शन किया गया था, 10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, एम आर: 154.25 जी / मोल), और 0.5 मिमी adenosine triphosphate (एटीपी, एम r: 507.18 जी / मोल) 16 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (14-20 ज) में 10.0 μL की कुल मात्रा में। Unspecific प्राइमर Malus domestica एक्स के लिए बाध्य बाहर शासन करने के लिए एक ही प्राइमरों के साथ असंक्रमित पेड़ से डीएनए का विश्लेषण करें </ Em> डीएनए।
  3. ई कोलाई electrocompetent कोशिकाओं में बंधाव मिश्रण का 1 μL रूपांतरण और Luria-Bertani पर केनामाइसिन प्रतिरोधी क्लोन के लिए चयन (पौंड) प्लेटों 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन सल्फेट 38 के साथ पूरक।
  4. एक स्तंभ आधारित प्लाज्मिड मिनी तैयारी किट निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ चयनित बैक्टीरियल क्लोन से प्लास्मिड डीएनए शुद्ध, और अनुक्रमण 39 से डालने के सफल एकीकरण और अभिविन्यास की जाँच करें।

5. संभावित effector प्रोटीन की स्व-सक्रियण (ऑटो सक्रियण) के लिए टेस्ट

  1. निम्नलिखित buffers और विकास मीडिया तैयार:
    नोट: खमीर चयनात्मक प्लेटों hyphenates के लिए नामकरण के साथ संबंधित माध्यम में लापता अमीनो एसिड के संक्षिप्त रूपों एक "-" संक्षिप्त नाम करने से पहले। उदाहरण के लिए, एसडी टीआरपी-Leu-उसकी प्लेटें सभी एमिनो एसिड लेकिन टीआरपी, लियू और उसकी होते हैं।
    1. 10x छोड़ने वालों मिक्स: वजनएल arginine monohydrochloride के 200 मिलीग्राम (एम आर: 210.66 जी / मोल), एल isoleucine के 300 मिलीग्राम (एम आर: 131.17 जी / मोल), एल Lysine monohydrate के 269 मिलीग्राम (एम आर: 164.21 जी / मोल), एल methionine के 200 मिलीग्राम (एम आर: 149.21 जी / मोल), एल फेनिलएलनिन के 500 मिलीग्राम (एम आर: 165.19 जी / मोल), एल threonine के 2 जी (एम आर: 119.12 जी / मोल), 300 मिलीग्राम एल tyrosine की (श्री: 181.19 जी / मोल), एल uracil (112.09 जी / मोल) की 200 एमजी, और एल valine के 1.5 ग्राम (एम आर: 117.15 जी / मोल)। उन्हें डबल आसुत जल का 1 एल में भंग और समाधान आटोक्लेव। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
      नोट: संबंधित छोड़ने वालों मिश्रण भी खरीदा premixed हो सकता है।
    2. 10x एल adenine पूरक: एल-adenine hemisulfate नमक (एडीई, एम आर: 184.17 जी / मोल) के 100 मिलीग्राम वजन और डबल आसुत जल के 50 एमएल में भंग। फ़िल्टर 0.22 माइक्रोन ताकना फिल्टर के साथ समाधान बाँझ।
    3. 10x एल हिस्टिडीन पूरक: एल-हिस्टिडीन monohydrochloride monohydrate के 100 मिलीग्राम वजन (अपने, एम आर
    4. 10x एल leucine पूरक: डबल आसुत जल के 50 एमएल में और फिल्टर 0.22 माइक्रोन ताकना फिल्टर के साथ यह बाँझ: एल leucine (113.17 जी / मोल लियू, एम आर) के 500 मिलीग्राम वजन।
    5. 10x एल tryptophan के पूरक: डबल आसुत जल के 50 एमएल में और फिल्टर 0.22 माइक्रोन ताकना फिल्टर के साथ यह बाँझ: एल tryptophan (204.23 जी / मोल टीआरपी, एम आर) के 100 मिलीग्राम वजन।
    6. एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई-मध्यम और प्लेट्स: 0.67% w / वी खमीर नाइट्रोजन बेस (अमीनो एसिड के बिना) को भंग करने और 2% w / वी डी ग्लूकोज monohydrate (एम आर: 198.17 जी / मोल) डबल में आसुत जल और आटोक्लेव। अगर प्लेट के लिए, 2% w / वी अगर (सूक्ष्मजीवविज्ञानी ग्रेड) autoclaving करने से पहले जोड़ें।
    7. चयनात्मक प्लेटें तैयार करने के लिए, autoclaved एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई माध्यम के लिए एमिनो एसिड स्टॉक समाधान की 1x जोड़ें। जब प्लेटों की तैयारी कर रहा है, यकीन है कि अगर जोड़ने से पहले ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा है सुनिश्चित करेंअमीनो एसिड। स्टॉक समाधान बाँझ रखें।
    8. YPAD मध्यम: (: 184.17 जी / मोल एम आर), और 2% w / v ग्लूकोज monohydrate 1% w / v खमीर निकालने, 2% w / v peptone (सूक्ष्मजीवविज्ञानी ग्रेड), 0.004% w / वी adenine hemisulfate नमक भंग डबल आसुत जल और आटोक्लेव। YPAD अगर प्लेट के लिए, w / वी अगर autoclaving करने से पहले 2% जोड़ें। 2x YPAD तैयार करने, सामग्री उपर्युक्त दो बार सांद्रता का उपयोग करें।
      नोट: (वैकल्पिक) के माध्यम में ग्लूकोज के उच्च एकाग्रता के कारण, 2x YPAD मध्यम autoclaving के बाद अंधेरा-भूरा हो जाता है। एक विकल्प, एक 40% के रूप में (डब्ल्यू / वी) ग्लूकोज शेयर समाधान तैयार है और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा निष्फल किया जा सकता है। फिल्टर निष्फल ग्लूकोज शेयर समाधान तो बाँझ शर्तों के तहत autoclaved 2x YPAD (कमी ग्लूकोज) को जोड़ा गया है। मात्रा त्रुटियों से बचने के लिए, 2x YPAD तैयार रहना चाहिए, मन में रखते हुए कि एक 10x ग्लूकोज समाधान बाद में जोड़ा गया है। इसका मतलब है कि, उदाहरण के लिए, के बजाय 1 एल ओएफ मध्यम, केवल 900 एमएल तैयार किया जाता है (ग्लूकोज को छोड़कर सभी अवयवों से युक्त) और autoclaved, और फिर ग्लूकोज शेयर समाधान के 100 एमएल जोड़ा जाता है।
  2. परीक्षण आत्म सक्रियण के लिए लिथियम एसीटेट की मध्यस्थता खमीर परिवर्तन
    1. स्ट्रीक Saccharomyces cerevisiae संवाददाता तनाव NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( lexAop) 4 HIS3 ura3: :( lexAop) 8-lacZ ade2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) एक से एक YPAD अगर प्लेट पर जमे हुए ग्लिसरॉल शेयर और 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए यह सेते हैं। इस थाली से कालोनियों उठाओ और YPAD माध्यम के 50 एमएल टीका लगाना। खमीर बढ़ने और आयुध डिपो के 600 नियमित रूप से मापने के विकास पर नजर रखने के लिए करते हैं।
    2. खमीर एक अंतिम आयुध डिपो 0.5-0.8 के 600 करने के लिए विकसित करते हैं। 5 मिनट के लिए 700 XG पर उन्हें centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं और उन्हें डबल आसुत, autoclaved पानी की 2.5 एमएल में resuspend।
    3. खमीर निलंबन के 100 μL के साथ छह aliquots तैयार है और 50 के 240 μL जोड़ने% W / वी पॉलीथीन ग्लाइकोल 4000 (खूंटी, एम आर: 3,500-4,000 जी / मोल), 1 एम लिथियम एसीटेट dihydrate के 36 μL (LiOAc, एम आर: 102.02 जी / मोल), और डब्ल्यू / वी 2% का 25 μL सामन शुक्राणु डीएनए (भंग)। डबल आसुत, बाँझ पानी के साथ सभी अभिकर्मकों तैयार करें।
    4. 'ए' को 'एफ' से खमीर निलंबन युक्त छह शीशियों लेबल और जोड़ने के बाद प्लाज्मिड वेक्टर डीएनए: नकारात्मक नियंत्रण: (क) 1.5 प्रेरक (pLexA-एन-atp00189 28) के साथ चारा प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम, (ख) 1.5 माइक्रोग्राम खाली शिकार प्लाज्मिड के pGAD हा 41, (ग) 1.5 माइक्रोग्राम खाली चारा वेक्टर के pLexA-एन 41, और (घ) खाली चारा वेक्टर pLexA-एन के 1.5 माइक्रोग्राम और खाली प्लाज्मिड शिकार pGAD हा के 1.5 माइक्रोग्राम; सकारात्मक नियंत्रण: (ई) सकारात्मक नियंत्रण चारा प्लास्मिड डीएनए pLexA-P53 41 और 1.5 माइक्रोग्राम प्रति सकारात्मक-प्लाज्मिड शिकार संधि-larget 41 की 1.5 माइक्रोग्राम; और आत्म सक्रियण परीक्षण: (च) बीए के 1.5 माइक्रोग्रामयह प्रेरक (pLexA-एन-atp00189) और 1.5 माइक्रोग्राम खाली प्लाज्मिड शिकार pGAD-हा के साथ प्लाज्मिड।
    5. सख्ती प्रतिक्रियाओं मिलाएं और एक पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं। 700 XG पर 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 0.9% की 250 μL (डब्ल्यू / वी) सोडियम क्लोराइड समाधान में कोशिकाओं resuspend (NaCl, एम आर: 48.44 जी / मोल) और निम्न चयनात्मक प्लेटों पर 50 μL फैल: एसडी टीआरपी, एसडी लियू, एसडी trp- लियू, एसडी-टीआरपी-Leu-अपने, और एसडी-टीआरपी-Leu-his-एडीई।
    6. 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिन - 3 के लिए प्लेटें सेते हैं। ऊष्मायन के पहले दिन के बाद, बाहर सुखाने से प्लेटों को रोकने के लिए प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ प्लेटों सील।
    7. प्लेटों पर खमीर विकास की जाँच करें।

6. टेस्ट प्रेरक की अभिव्यक्ति

  1. पश्चिमी धब्बा 42 से प्रेरक की अभिव्यक्ति का परीक्षण लेक्स-एक टैग है कि प्रेरक जब के एन टर्मिनस पर युग्मित है के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथpLexA-एन से व्यक्त किया।
    नोट: विचार करना है कि translationally जुड़े हुए लेक्स-ए टैग ब्याज की प्रोटीन की वास्तविक वजन के बारे में 24 केडीए कहते हैं। यह महत्वपूर्ण है जब पश्चिमी धब्बा में प्रोटीन आकार की पहचान है।

7. Y2H स्क्रीन

  1. स्ट्रीक pLexA-atp00189 (प्रेरक) एक ताजा एसडी टीआरपी प्लेट पर NMY51 -transformed और यह 2 के लिए बढ़ने - 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन, जब तक लाल कालोनियों दिखाई देते हैं।
  2. अगर थाली से एक लाल कॉलोनी के साथ एक छोटे से मिलाते फ्लास्क में एसडी टीआरपी मध्यम 3 एमएल टीका लगाना और 120 पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते - 150 आरपीएम।
  3. रातोंरात संस्कृति के 1 एमएल के साथ एक मिलाते हुए फ्लास्क में एसडी टीआरपी 20 एमएल टीका लगाना और यह 8 घंटे के लिए बढ़ता है।
  4. एसडी टीआरपी मध्यम जोड़कर 600 = 0.2 आयुध डिपो और स्टार्टर संस्कृति प्रत्येक के 10 एमएल के साथ बोतल मिलाते में 2x 100 एमएल टीका लगाना संस्कृति को समायोजित करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ रात भर के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि खमीर 6 ओवर ड्राफ्ट के लिए नहीं उगते बनाओ00> 0.5 और ताजा एसडी टीआरपी के साथ पतला।
  5. आयुध डिपो के 600 और गोली 120 600 आयुध डिपो उपाय "इकाइयों।" उदाहरण के लिए, यदि 1.2 की 600 एक आयुध डिपो मापा जाता है, 100 एमएल नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक प्रकार के बरतन फ्लास्क में पूर्व गर्म 2x YPAD के 800 एमएल में गोली resuspend।
    1. एक 2 एमएल विभाज्य स्पिन, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और पानी में गोली resuspend। सुनिश्चित करें कि खमीर निलंबन के आयुध डिपो के 600 0.15 और 0.2 के बीच है। यदि नहीं, तो 2x YPAD के साथ समायोजित या रात संस्कृति से अधिक खमीर जोड़ें।
      नोट: 2x YPAD गहरे भूरे रंग है और आयुध डिपो माप के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, यह आयुध डिपो निर्धारित करने से पहले पानी में खमीर कोशिकाओं resuspend करने के लिए आवश्यक है। एक विकल्प के रूप में, 2x YPAD कदम 5.1.8 ध्यान दें, जो मध्यम के अंधेरे रंग रोकता में वर्णित के रूप में, ग्लूकोज अलग स्टरलाइज़ द्वारा तैयार किया जा सकता है।
  6. एक app में शेष खमीर संस्कृति सेतेropriately (एक प्रकार के बरतन एल 2 फ्लास्क में 800 एमएल या दो 1 एल प्रकार के बरतन बोतल में 2 x 400 एमएल विभाजित) एक प्रकार के बरतन कुप्पी आकार और 30 डिग्री सेल्सियस, 120 पर सेते - 150 आरपीएम। एक आयुध डिपो के 600 0.6 पर पहुंच गया है (- 6 घंटे लग जाते हैं 4) जब तक हर 1.5 घंटे के बारे में 600 आयुध डिपो उपाय। इस बीच में, समाधान अगले चरण में वर्णित तैयार करते हैं।
  7. लिथियम एसीटेट की मध्यस्थता परिवर्तन
    1. पानी में 2% w / v सामन शुक्राणु डीएनए भंग और 100 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए 500 μL फोड़ा। बर्फ पर ट्यूब 2 मिनट के लिए रखें और हीटिंग कदम दोहराएँ। आगे उपयोग करें जब तक बर्फ पर डीएनए रखें।
    2. निम्नलिखित घोला जा सकता है तैयार:
      1. ते / LiOAC मिक्स:, और बाँझ डबल आसुत जल का 21.84 एमएल: 1 एम LiOAC की 3.08 एमएल, 100 मिमी Tris के 3.08 एमएल / 10 मिमी EDTA (7.5 पीएच) मिक्स।
      2. खूंटी / LiOAc मिक्स:, और 50% की 33.6 एमएल (डब्ल्यू / वी) खूंटी 4000: 1 एम LiOAc के 4.2 एमएल, मिमी Tris के 4.2 एमएल / 10 मिमी EDTA (7.5 पीएच) का मिश्रण।
    3. अपकेंद्रित्र 800 एमएल खमीर संस्कृति (600 आयुध डिपो = 0.6)700 XG पर 5 मिनट गोली कोशिकाओं के लिए। तैरनेवाला निकालें और बाँझ डबल आसुत पानी की 200 मिलीलीटर में गोली resuspend। 5 मिनट के लिए 700 XG पर फिर गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। नोट: आवश्यक विभाजित है centrifugation के लिए कई शीशियों में निलंबन। 7.7.3 में तरल संस्करणों। और 7.7.4। पूरे गोली 800 एमएल निलंबन से निकाली गई लिए देखें।
    4. ते / LiOAc मिश्रण के 16 एमएल में गोली Resuspend (कदम 7.7.1.1 देखें); 5 मिनट के लिए 700 XG पर नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ते / LiOAC मिश्रण के 9.6 एमएल में गोली Resuspend।
    5. तैयार निम्नलिखित प्रतिक्रिया में घोला जा सकता है उचित आकार प्रतिक्रिया polypropylene वाहिकाओं: pGAD-हा-सीडीएनए पुस्तकालय वेक्टर के 7 माइक्रोग्राम प्रति के साथ 12 शीशियों, 2% सामन शुक्राणु डीएनए (कदम 7.7 देखें) के 100 μL, और खूंटी / LiOAc मिश्रण के 2.5 एमएल। खमीर सेल निलंबन के 600 μL 12 शीशियों में से प्रत्येक के लिए कदम 7.10 से जोड़ें और 1 मिनट के लिए सख्ती मिश्रण।
    6. एक पानी के स्नान में एक 30 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेतेसख्ती हर 15 मिनट मिश्रण घ। DMSO के 160 μL हर शीशी में जोड़ें और सख्ती मिश्रण। 42 डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
    7. 5 मिनट के लिए 700 XG पर गोली कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 2x YPAD के 3 एमएल में प्रत्येक गोली resuspend। पूल एक 100 एमएल प्रकार के बरतन फ्लास्क में सभी कोशिकाओं (12 शीशियों से 36 मिलीलीटर की कुल के साथ) और 30 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट और 120 आरपीएम के लिए खमीर सेते हैं।
    8. 700 XG पर 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बाँझ 0.9% (w / v) NaCl के 4.5 एमएल में गोली Resuspend और एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ सावधानी से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 50 μL वापस लेने और तैयार दस गुना 1 अप करने के लिए 1:10 से 0.9% NaCl में dilutions: 1,000। 90 मिमी पेट्री युक्त एसडी टीआरपी-लियू अगर बर्तन पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्लेट 100 μL।
    9. साथ एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई अगर 16- x 150 मिमी व्यास पेट्री डिश पर undiluted खमीर मेजबान के बाकी बिखरा हुआ है। मध्यम करने के लिए 3-AT आत्म-सक्रियण कम करने के लिए। एसडी टीआरपी-लियू सेते30 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए प्लेटें और चार दिन के लिए SD-टीआरपी-Leu-his-एडीई प्लेटें।
      नोट: क्लोन है कि चयनात्मक प्लेटों पर दिखाई देते हैं (संभावित) बातचीत के दौरान जोड़े हैं और चारा बातचीत साथी के लिए pGAD हा प्लाज्मिड कोडिंग ले।
    10. एसडी टीआरपी-लियू चयन प्लेटों पर विभिन्न धारावाहिक dilutions की कालोनियों की गणना के द्वारा अभिकर्मक दक्षता का निर्धारण करें। उठा और ताजा एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई चयनात्मक प्लेटों पर एक बाँझ विंदुक टिप के साथ कॉलोनी streaking द्वारा प्रत्येक क्लोन स्थानांतरण। 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं। हर दिन इस चरण को दोहराएँ जब तक पाँच मार्ग की कुल पहुँच जाता है।

चयनात्मक प्लेटों से क्लोन का विश्लेषण 8.

  1. एक बाँझ हुड के नीचे के प्रत्येक क्लोन के लिए SD-टीआरपी-Leu-his-एडीई 1 एमएल के साथ एक बाँझ 2-एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब तैयार करें। एक गर्म सुई के साथ प्रत्येक ट्यूब में एक छेद पंच और गैस पारगम्य मुहर के एक टुकड़े के साथ छेद को कवर किया। ताजा कॉलोनी दोस्त के साथ प्रत्येक शीशी टीका लगाना और 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं, 150 rpm पर मिलाते हुए, एक क्लोन (5 वें पारित होने के बाद क्लोन का उपयोग कदम 7.17) से रियाल।
    नोट: यह एक ताजा थाली से क्लोन लेने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए संग्रहीत प्लेटों से लिया खमीर तरल माध्यम में 24 घंटे के भीतर पर्याप्त हो जाना नहीं है।
  2. 4000 XG पर 5 मिनट के लिए खमीर गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। उचित मेजबान बफर में गोली (संबंधित प्लास्मिड डीएनए miniprep किट से) Resuspend और एक ताजा 2.0 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब को हस्तांतरण। एसिड धोया कांच के मोती (425- 600 माइक्रोन व्यास) के 100 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए सख्ती मिश्रण।
  3. संबंधित lysis बफर जोड़ें और एक प्लाज्मिड तैयारी मिनी निर्माता के निर्देशों का पालन किट का उपयोग प्लाज्मिड शुद्धि के साथ आगे बढ़ें। पानी की 50 μL के साथ प्लास्मिड डीएनए Elute।
  4. प्लाज्मिड शिकार विशिष्ट प्राइमर, GAL4ADseq के साथ एक अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए कदम 8.3 से डीएनए का प्रयोग करेंरेफरी "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '।
  5. द्वारा बातचीत सत्यापित करें नए सिरे से सह बदलने 43, 44 चारा और शिकार वेक्टर। एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई चयन प्लेटों तब्दील खमीर का चयन करें।

Representative Results

पहले वास्तविक Y2H स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता चारा आत्म सक्रियण के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए। यह खाली शिकार पुस्तकालय वेक्टर के साथ मिलकर चारा अभिव्यक्ति वेक्टर बदलने और चयनात्मक प्लेटों पर विकास की जाँच करके हासिल की है।

कि क्या phytoplasmal प्रोटीन ATP_00189 आत्म सक्रिय है का विश्लेषण करने के लिए, आत्म सक्रियण परीक्षण खंड 5. चारा प्लाज्मिड टीआरपी के पूरक है और शिकार एस cerevisiae NMY51 40 के लियू auxotrophy प्लाज्मिड में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था। एक सफल सह-परिवर्तन इस प्रकार टीआरपी और लियू कमी चयनात्मक प्लेटों पर विकास की विशेषता है। चारा और शिकार प्रोटीन की बातचीत NMY51 के बारे में उनकी और एडीई auxotrophy की एक पूरक की ओर जाता है। एक बातचीत के अभाव में आत्म सक्रियण चारा द्वारा प्रकट होता है, खमीर और उसकी एडीई कमी चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ता है। मजबूत और कमजोर आत्मसक्रियण हो सकता है। चारा की मजबूत आत्म सक्रियण टीआरपी-Leu-his-एडीई समाप्त चयन प्लेटों पर सह तब्दील खमीर के विकास की विशेषता है। उसकी टीआरपी-Leu-नहीं बल्कि टीआरपी-Leu-his-एडीई समाप्त चयन प्लेटों पर कमजोर आत्म सक्रियण पर विकास की ओर जाता है। उचित सकारात्मक नियंत्रण आत्म सक्रियण परख के परिणामों की व्याख्या के लिए अपरिहार्य हैं। और आत्म सक्रियण परख की उम्मीद परिणामों के एक सारांश उनकी व्याख्या तालिका 1 में प्रदान की है और चित्रा 1 में कल्पना की है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक Y2H स्क्रीन प्रदर्शन से पहले एक चारा का चारा स्व-सक्रियण टेस्ट का उदाहरण है। , एक कमजोर आत्म को सक्रिय करने के साथ साथ एक खाली शिकार तुला: एस cerevisiae NMY51 चारा बातचीत (Plex-P53) और एक सकारात्मक नियंत्रण (एसी बाएं पैनल) के रूप में शिकार (संधि-larget) के साथ सह तब्दील हो गया थाRY वेक्टर (मध्यम पैनल: DF) और एक नहीं स्वयं को सक्रिय चारा प्लस एक खाली शिकार पुस्तकालय वेक्टर (सही पैनल: सैनिक)। , टीआरपी, लियू और उसके (मध्यम पैनल: बी, ई, एच): सह तब्दील खमीर एसडी टीआरपी और लियू (ए, डी, जी ऊपरी पैनल) की कमी प्लेटों पर सुसंस्कृत थे और टीआरपी, लियू, उसके और एडीई (कम पैनल: सी, एफ, i)। चारे के रूप में वेक्टर टीआरपी auxotrophy और शिकार वेक्टर NMY51 (एसडी टीआरपी-लियू विकास) के लियू auxotrophy पूरक मध्यम कमी टीआरपी और लियू पर चयन, सफल सह-परिवर्तन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है। चारा और शिकार या प्रलोभन के एक स्वयं सक्रियण के बीच एक संवाद के मामले में, NMY51 के संवाददाता अभिव्यक्ति पर बदल दिया और उसकी और एडीई auxotrophy (एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई विकास) का पूरक है। एक कमजोर आत्म सक्रियण पर एसडी टीआरपी-Leu-अपने प्लेटों विकास की विशेषता है (मध्यम पैनल, डीएफ)। एक चारा की कमजोर आत्म सक्रियण चारा का विश्लेषण करने के लिए पूर्व में कम किया जाना चाहिएएक Y2H स्क्रीन में, चयनात्मक मीडिया के लिए 3-एटी जोड़कर उदा। संबंधित मीडिया नाम पर - एमिनो एसिड depletions के साथ संकेत कर रहे हैं। "" यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

pLexA-एन-atp00189 कोई नहीं कालोनियों कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
कोई नहीं pGAD हा कोई विकास नहीं कालोनियों कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
pLexA-एन कोई नहीं कालोनियों कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
pLexA-एन pGAD हा कालोनियों कालोनियों कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं
pLexA-P53 समझौता-larget कालोनियों कालोनियों कालोनियों कालोनियों कालोनियों
pLexA-एन-atp00189 pGAD हा कालोनियों कालोनियों कालोनियों कोई विकास नहीं कोई विकास नहीं

तालिका 1: एक चारा स्व-सक्रियण परख में अपेक्षित परिणाम। एस cerevisiae NMY51 के परिवर्तन के सह-बदल चारा और शिकार की विशेषताओं के आधार पर चयनात्मक मीडिया पर अंतर विकास में अर्जित करता है। चयनात्मक प्लेटों पर वृद्धि 30 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न संयोजनों वेक्टर (वायुसेना) 72 ज ऊष्मायन के बाद के परिवर्तन पर मूल्यांकन किया गया था। कमजोर आत्म सक्रियण पर खमीर विकास की विशेषता है एसडी टीआरपी-Leu-अपने और मजबूत आत्म सक्रियण पर एसडी टीआरपी-Leu-his-एडीई चयन बेनी विकास द्वाराएक बातचीत साथी के अभाव में es। pLexA-एन इनकोडिंग phytoplasmal प्रेरक ATP_00189 आत्म सक्रियण, जो चारा वेक्टर तब्दील NMY51 उसकी और एडीई के अभाव में विकसित करने के लिए असमर्थता द्वारा विशेषता है प्रदर्शन नहीं करता है।

चारा पर निर्भर करता है, एक Y2H स्क्रीन चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ रही है कई खमीर क्लोन हासिल कर सकते हैं। सभी क्लोन का विश्लेषण किया और संभव redundancies के लिए जाँच की जानी चाहिए। यहां तक ​​कि अगर एक सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय इस्तेमाल किया गया है, यह बहुत संभावना है कि एक interactor कई अलग अलग क्लोन में प्रतिनिधित्व किया है। पुस्तकालय क्लोनिंग तकनीक पर निर्भर करता है, यह भी संभव है कि पूर्ण जीन के ही टुकड़े कुछ शिकार वैक्टर में डाला जाता है। यह इस प्रकार नए सिरे से (सीडीएनए से) बढ़ाना और interactor की पूरी लंबाई जीन subclone और एक एक-से-एक Y2H विश्लेषण (चित्रा 2) में बातचीत का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है।

चित्रा 2: एक Y2H प्रयोग में चारा और शिकार के बीच एक संवाद का उदाहरण है। एक खमीर दो संकर (Y2H) स्क्रीन प्रदर्शन किया गया था और सकारात्मक interactor क्लोन से plasmids शुद्ध किया गया। शिकार वेक्टर अनुक्रम किया गया था और Malus domestica एक्स मेजबान बातचीत भागीदारों के MdTCP24 और MdTCP25 पहचान की गई। एक नकारात्मक नियंत्रण MdTCP34 (जिसके लिए कोई interactor Y2H पुस्तकालय स्क्रीन में पहचान की गई थी) के रूप में समानांतर में subcloned था। पूरी लंबाई जीन सेब सीडीएनए से परिलक्षित कर रहे थे, शिकार वेक्टर (सह cistronically सक्रियण डोमेन ई व्यक्त) और में subcloned नए सिरे से चारा वेक्टर बैक्टीरियल प्रेरक ATP_00189 डीएनए बाध्यकारी डोमेन (बी) के लिए मिलकर व्यक्त के साथ सह-बदल दिया। यह आंकड़ा 28 से लिया जाता है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

Discussion

Y2H स्क्रीन में, संभावित प्रेरक प्रोटीन अलग काल्पनिक बातचीत प्रोटीन (चरण 7) के साथ सह व्यक्त की है। प्रत्येक बढ़ती खमीर क्लोन चारा लेकिन एक (संभावित) अलग interactor शामिल हैं। बातचीत के दौरान प्रोटीन है कि शिकार plasmids में क्लोन है एक सीडीएनए पुस्तकालय में इनकोड किया गया है। चारा और शिकार एक खमीर प्रतिलेखन कारक के एक भाग के लिए प्रत्येक सह cistronically कोड plasmids। चारा (प्रेरक) और एक प्लाज्मिड शिकार इनकोडिंग interactor के बीच शारीरिक बातचीत के मामले में दो प्रतिलेखन कारक भागों (डीएनए बाध्यकारी डोमेन और सक्रियण डोमेन) एकजुट हो रहे हैं, और पत्रकार जीन अभिव्यक्ति प्रेरित है। खमीर histidine- और adenine समाप्त एसडी चयन प्लेटों पर विकसित करने के लिए सक्षम है। शिकार सीडीएनए पुस्तकालय की तरह जांच की प्रेरक पर निर्भर है और उसके अनुसार चुना जाना चाहिए। शिकार और चारा वेक्टर, साथ ही खमीर तनाव, संगत होना चाहिए। इस स्क्रीन में, एक LexA डीएनए बाध्यकारी डोमेन और Gal4 सक्रियण domain संगत खमीर प्रतिलेखन कारक इकाइयों के रूप में इस्तेमाल किया गया। सीडीएनए पुस्तकालय को व्यक्तिगत रूप से निर्माण किया जा सकता है, कस्टम बनाया है, या व्यावसायिक रूप से प्राप्त की। सीडीएनए शिकार पुस्तकालय की तैयारी इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है। इस प्रोटोकॉल में, एक आत्म-निर्माण किया है, Malus domestica एक्स के पत्तों की शाही सेना से सामान्यीकृत सीडीएनए पुस्तकालय का इस्तेमाल किया और pGAD हा 41 में क्लोन किया गया था। प्रेरक (चारा) खमीर तनाव -expressing शिकार पुस्तकालय के साथ तब्दील हो गया था, और क्लोन histidine- और adenine समाप्त एसडी चयन प्लेटों पर चयन किया गया था। खमीर कालोनियों से प्लास्मिड डीएनए निकालने के लिए, बैक्टीरिया के लिए एक स्तंभ आधारित डीएनए प्लाज्मिड मिनी किट ग्लास मनकों का उपयोग खमीर सेल (चरण 8) में सुधार के लिए एक यांत्रिक व्यवधान कदम के साथ संयोजन में सिफारिश की है। इस प्लाज्मिड शुद्धि में, चारा और शिकार वेक्टर अपेक्षाकृत कम मात्रा में एक साथ शुद्ध हो जाएगा। हालांकि, प्लास्मिड डीएनए की मात्रा पर्याप्त है अनुक्रमण बुद्धि के माध्यम से बातचीत करने के लिए भागीदार की पहचानHout से पहले प्लाज्मिड प्रचार (कदम 8.4)। एक विकल्प के रूप में, डीएनए कदम 8.4 में शुद्ध सक्षम ई कोलाई के रूप में तब्दील और शिकार वेक्टर की मध्यस्थता एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ चयनित (जैसे, pGAD हा के मामले में एम्पीसिलीन) हो सकता है। चुने गए ई कोलाई कालोनियों केवल pGAD हा पुस्तकालय प्लाज्मिड ले, और उच्च उपज प्लाज्मिड शुद्धि इन क्लोन के साथ किया जा सकता है।

pLexA-एन और pGAD हा निर्माणों के सफल परिवर्तन NMY51 की नियासिन और leucine auxotrophy पूरक। प्रेरक और एक प्रोटीन (pGAD हा पर इनकोडिंग) के बीच एक संवाद NMY51 उपभेदों में संवाददाता प्रणाली की सक्रियता के लिए होता है। आत्म सक्रियण के मामले में, NMY51 NMY51 संवाददाता प्रणाली के अवांछित सक्रियण के कारण प्रेरक खाली पुस्तकालय वेक्टर pGAD-हा-टीआरपी लियू-his-एडीई, कमी चयनात्मक प्लेटों पर बढ़ता के साथ संयोजन में pLexA-एन को व्यक्त करने के साथ बदल 40। आत्म सक्रियण w हो सकता हैउसकी टीआरपी-Leu-, या सक्रियण मजबूत और टीआरपी-Leu-his-एडीई प्लेटें 41 पर विकास द्वारा होती जा सकता eak और के अभाव में हो सकता है। स्व-सक्रियण वास्तविक Y2H स्क्रीन में झूठी सकारात्मक क्लोन के एक बड़े पैमाने पर पृष्ठभूमि पैदा कर सकता है। इससे बचने के लिए, चारे के साथ एक आत्म सक्रियण परीक्षण किया जाना चाहिए, जिसमें प्रेरक व्यक्त वेक्टर सह तब्दील खाली पुस्तकालय वेक्टर के साथ है। इस प्रयोगात्मक सेटिंग में, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित नहीं किया जाना चाहिए। यदि स्वयं सक्रियण (यानी, चयनात्मक प्लेटों पर विकास) की परीक्षा में दिख रहा है, मध्यम 3-अमीनो-1,2,4-triazole 45 (3-एटी) के विभिन्न सांद्रता के साथ पूरक हो सकते हैं। 3-एटी imidazoleglycerol-फॉस्फेट dehydratase (HIS3), एक एंजाइम हिस्टिडीन जैवसंश्लेषण 46 के दौरान महत्वपूर्ण के एक अवरोध है। 3-साथ पूरकता Y2H स्क्रीन 47 के दौरान स्वयं सक्रियण के कमजोर प्रभाव को कम कर सकते हैं,48। 3-एटी के विभिन्न सांद्रता परीक्षण किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, 1 - 40 मिमी 3-में इस्तेमाल किया गया। सबसे कम एकाग्रता कि स्वयं सक्रियण के दमन की ओर जाता है बाद में Y2H स्क्रीन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। आत्म सक्रियण परख के चुनिंदा प्लेटें ही मूल्यांकन किया जा सकता है, तो सह-परिवर्तन के एसडी टीआरपी-लियू प्लेटों क्लोन के लिए पर्याप्त संख्या में होते हैं। एक संकेत के रूप में ≥ प्रति 90 मिमी (व्यास) पेट्री डिश 500 कालोनियों के लिए पर्याप्त हैं। सटीक अभिकर्मक दक्षता का निर्धारण करने के लिए, यह सह-बदल खमीर के धारावाहिक dilutions तैयार करने के लिए और एसडी टीआरपी-लियू प्लेटों उन्हें प्रसार करने के लिए सिफारिश की है।

आत्म सक्रियण को कम करने के लिए, प्रेरक pLexA-सी, एक चारा अभिव्यक्ति वेक्टर कि प्रोटीन के सी-टर्मिनस तक LexA टैग फ़्यूज़ में क्लोन किया जा सकता है। लेक्स-एक टैग के उन्मुखीकरण आत्म सक्रियण 24 attenuate कर सकते हैं। हालांकि, यह हर मामले में कम या समाप्त आत्म सक्रियण के लिए संभव नहीं है। रचनालाल या लाल कालोनियों एक कमजोर या झूठी सकारात्मक बातचीत इंगित करता है। NMY51 की ade2 पत्रकार जीन केवल सक्रिय जब यह एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने के लिए आता है, जो बारी ब्लॉकों में इस खमीर तनाव 40 में एक लाल रंग का संचय। एक बातचीत के अभाव में, NMY51 जबकि मजबूत interactors ले जाने कालोनियों सफेद होते हैं, लाल कर रहे हैं। चयन प्लेटों पर कॉलोनी रंग का अवलोकन इस प्रकार का न्याय करने के लिए अगर संबंधित कालोनियों true- या झूठी सकारात्मक interactors हैं एक और महत्वपूर्ण संकेत है।

यह अंततः अनुकूलन या चारा की प्रकृति और बातचीत विशेषताओं के संबंध में कुछ परख सेटिंग में बदलाव करने के लिए आवश्यक है। अब तक, सुधार और आम Y2H के व्युत्पन्न तकनीकों का एक नंबर अलग मेजबान सिस्टम में नहीं बल्कि मुश्किल प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए स्थापित किया गया है। Stynen एट अल द्वारा एक समीक्षा। 49 पतों एकएन डी Y2H, अपने में सुधार, और रूपांतरों के विभिन्न पहलुओं का वर्णन है, और इस तरह कैसे उचित बातचीत परख का चयन करने के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।

Y2H स्क्रीन और ली गई तकनीक का व्यापक रूप से विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में, जहाँ भी बाइनरी प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए आवश्यक है में इस्तेमाल हो गए हैं। महत्वपूर्ण नियंत्रण तरह के प्रलोभन के आत्म सक्रियण परीक्षण और पहचान बातचीत प्रोटीन की एक-से-एक फिर से परिवर्तनों के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं यहां तक कि अगर, Y2H झूठी परिणाम 26, 50, 51 का उत्पादन होने का खतरा है। एक मॉडल के रूप में खमीर सभी बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है। खमीर जरूरी एक सेलुलर पर्यावरण उचित बाद translational संशोधन और हर प्रोटीन 24 के लिए तह का समर्थन करता है कि गठन नहीं है। इसके अलावा, Y2H की स्थापना में, प्रोटीन अधिक व्यक्त कर रहे हैं, और उनकी अभिव्यक्ति पर नियंत्रण नहीं हैउनके प्राकृतिक प्रमोटर के नेतृत्व में। Y2H नाभिक है, जो जरूरी उनके प्राकृतिक subcellular गंतव्य नहीं है करने के लिए प्रोटीन बातचीत में भागीदारों मजबूर करता है। बातचीत का मूल निवासी सेलुलर परिस्थितियों इस प्रकार खमीर से परिलक्षित नहीं किया जा सकता है और झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। अधिकांश Y2H एक चयनात्मक सिद्धांत के रूप में खमीर auxotrophy पूरक पर आधारित हैं। इस पोषण चयन उच्च संवेदनशीलता के द्वारा होती है, लेकिन अन्य की तुलना में कमी आई है चयनात्मकता की कीमत पर (जैसे, chromogenic संवाददाता) 49 assays। अगर unreducible आत्म सक्रियण (ऊपर देखें) या अन्य सीमाओं के एक निश्चित प्रेरक के लिए होते हैं, Y2H एक उपयुक्त परख 25 नहीं है। 1 टेबल और चित्रा 1 में, आत्म-सक्रियण परीक्षण के परिणाम की उम्मीद दिया जाता है। वास्तविक बातचीत (यानी, झूठी नकारात्मक) की अनुपस्थिति प्रोटीन विषाक्तता, गलत translational प्रोटीन की वजह से हो सकता हैबातचीत 24 के लिए आवश्यक संसाधन, बातचीत का steric बाधा, शिकार पुस्तकालय में underrepresented बातचीत भागीदारों, चारा की झिल्ली स्थानीयकरण, या लापता घटकों।

यह नए सिरे से करने की सिफारिश की है सीडीएनए से पहचान बातचीत प्रोटीन की पूरी लंबाई जीन बढ़ाना, pGAD हा में subclone, और उत्पन्न pGAD हा में निर्माण बदलने से एक एक-से-एक बातचीत परख प्रदर्शन चारा व्यक्त NMY51 तनाव। के बाद से मनाया interactor शिकार पुस्तकालय में मौजूद केवल एक बड़ा प्रोटीन का एक टुकड़ा हो सकता है यह आवश्यक है। हालांकि, संबंधित पूर्ण लंबाई जीन के लिए जानकारी केवल सुलभ यदि काफी जीनोमिक और transcriptomic अनुक्रम डेटा उपलब्ध है। आत्म सक्रियण यहाँ वर्णित परख के लिए परिवर्तन प्रोटोकॉल इस तरह के एक एक-से-एक परख के लिए लागू किया जा सकता है, और चारा और interactor के बीच बातचीत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए।

Malus domestica एक्स के टीसीपी प्रतिलेखन कारक के साथ बातचीत निकोटियाना benthamiana में bimolecular फ्लोरोसेंट पूरक (BiFC) के साथ संयंत्र में सत्यापित किया गया था 28 (इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं) Protoplasts। प्रेरक प्रोटीन ATP_00189 संयंत्र रोगज़नक़ पी माली से निकाली थी। Planta BiFC में इस प्रकार Malus domestica एक्स प्रतिलेखन कारक के साथ बातचीत ATP_00189 सत्यापित करने के लिए चुना गया था पहले से Y2H 28 में पहचान की। BiFC एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत परख है कि आदेश संवाददाता प्रणाली <सक्रिय करने के नाभिक के लिए बातचीत प्रोटीन की subcellular translocation की आवश्यकता नहीं होती हैसमर्थन वर्ग = "xref"> 52। इसके अलावा, में संयंत्र अभिव्यक्ति और संशोधन मशीनरी mimics अपने संयंत्र की मेजबानी में संयंत्र बैक्टीरियल प्रेरक के बीच प्राकृतिक बातचीत का माहौल है। हालांकि, एक वैश्विक स्क्रीन BiFC का उपयोग संभव नहीं है।

वहाँ प्रोटोकॉल है कि ध्यान से संबोधित किया जाना चाहिए में कई कदम उठाए हैं। जब ब्याज (चरण 4) के जीन amplifying, यह है कि प्राइमरों संयंत्र डीएनए के लिए बाध्य बाहर शासन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, गैर संक्रमित पौधों से डीएनए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए। ब्याज की जीन के अनुक्रम EcoRI और साली प्रतिबंध साइटों कि डालने की दिशात्मक क्लोनिंग के लिए उपयोग किया जाता है शामिल नहीं करना चाहिए। अनुक्रम इन साइटों को नियंत्रित करता है, तो क्लोनिंग के लिए अलग-अलग प्रतिबंध एंजाइमों चुना जाना चाहिए। खमीर परिवर्तन इस प्रोटोकॉल के दौरान एक केंद्रीय विधि है। अभिकर्मक दक्षता खमीर कोशिकाओं की योग्यता, उनकी व्यवहार्यता, विकास राज्य, और अभिकर्मक REAG की गुणवत्ता पर निर्भर करता हैईएनटी 53, 54। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के लिए, यह अत्यधिक जब परिवर्तनों प्रदर्शन ताजा प्लेटों से खमीर दो सप्ताह (4 डिग्री सेल्सियस पर रखा) से अधिक पुराना नहीं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। अक्सर, तब्दील हो खमीर के विकास को जब चयनात्मक तरल संस्कृतियों वर्ष अगर प्लेट से कालोनियों के साथ inoculated हैं देरी हो रही है। यह भी वास्तविक प्रयोगों के लिए एक inoculum के रूप में एक तरल स्टार्टर संस्कृति का उपयोग करें और थाली से सीधे खमीर का उपयोग नहीं करने के लिए उपयोगी है। जब चारा व्यक्त खमीर में शिकार परासंक्रमित कम दक्षता निश्चित शिकार प्रोटीन (संभावित interactors) की underrepresentation को जन्म दे सकता है और इस तरह पूरे स्क्रीन तिरछा कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, ~ 150,000 CFU / माइक्रोग्राम Y2H में ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए के एक खमीर अभिकर्मक दक्षता अच्छी तरह से काम किया।

खामियों और Y2H तकनीक की कमियों को जानने और एक गंभीर और उचित तरीके से परिणामों की व्याख्या CORR ड्राइंग के लिए अपरिहार्य हैect निष्कर्ष। Y2H assays और डेरिवेटिव कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है और विभिन्न चारा विशेषताओं के संबंध में कई सुधार और रूपांतरों आया है, बातचीत के subcellular स्थानीयकरण, उम्मीद बंधन भागीदारों, और अन्य कारकों है कि बातचीत के लिए आवश्यक हो सकता है (देखें Y3H 55, 56, 57)। हाल ही में, सरणी आधारित Y2H स्क्रीन विकसित किया गया है कि preys 58 के लाखों लोगों के खिलाफ कई फँसाना के स्वचालित, उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। भविष्य की संभावना सबसे अधिक जटिल संकेत दे रास्ते और विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में interactomes की व्याख्या के लिए अनुमति देने के लिए इस परख करने के लिए स्वचालन और उच्च throughput दृष्टिकोण में निहित है।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि proofreading के लिए Laimburg रिसर्च सेंटर और तकनीकी सहायता के लिए Dualsystems बायोटेक एजी और जूलिया Strobl से Mirelle बोर्जेस डायस Schnetzer से क्रिस्टीन Kerschbamer, थॉमस Letschka, सबीन Oettl, मार्गोट Raffeiner, और फ्लोरियन Senoner धन्यवाद। इस काम APPL2.0 परियोजना के हिस्से के रूप में प्रदर्शन किया गया था और आंशिक रूप से Bozen / बोलजानो, इटली के स्वायत्त प्रांत और दक्षिण Tyrolean एप्पल कंसोर्टियम द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodium chloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 mL; 1,000 mL; 2,000 mL) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 mL, 1.5 mL and 2.0 mL Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10 - 1,000 µL) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4 °C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20 °C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 mL) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 mL) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT; 1 M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)

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References

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संक्रमण अंक 119 खमीर दो संकर Y2H बैक्टीरिया phytoplasma आत्म सक्रियण प्रेरक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत
एक गैर-कृषि योग्य संयंत्र पैथोजन से एक जीवाणु प्रेरक के फंक्शन Unravelling एक खमीर दो संकर स्क्रीन का उपयोग
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Janik, K., Schlink, K. Unravelling… More

Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).

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