Summary
Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.
Abstract
preparati fetta verticali sono ben stabiliti per studiare i circuiti e la trasmissione del segnale nella retina dei mammiferi adulti. Il piano di sezionamento in queste preparazioni è perpendicolare alla superficie della retina, che lo rende ideale per lo studio dei neuroni orientate radialmente come fotorecettori e cellule bipolari. Tuttavia, le grandi pergole dendritiche di cellule orizzontali, cellule amacrine in tutto il campo, e le cellule gangliari sono per lo più troncati, lasciando marcatamente ridotta attività sinaptica in queste cellule. Mentre le cellule gangliari e le cellule amacrine sfollati possono essere studiati in un preparato tutto montato della retina, cellule orizzontali e le cellule amacrine situate nello strato nucleare interno sono solo scarsamente accessibili per gli elettrodi in tutto il tessuto della retina.
Per ottenere la massima accessibilità e l'integrità sinaptica, abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di topo, e studiato la trasmissione del segnale alla sinapsi tra i fotorecettori e orizzontalecellule. sezionamento orizzontale consente (1) facile e univoca identificazione visiva dei corpi cellulari orizzontali per l'elettrodo il targeting, e (2) la conservazione dei campi dendritiche cellule orizzontale estesa, come un prerequisito per integro e funzionale cono di ingresso sinaptico a dendriti delle cellule orizzontali.
cellule orizzontali da fette orizzontali esposte attività sinaptica tonica nel buio, e hanno risposto a brevi lampi di luce, con una riduzione di attività sinaptica verso l'interno attuale e diminuita. evidenza immunocitochimica indica che quasi tutti i coni nel campo dendritica di una cella orizzontale stabiliscono sinapsi con i dendriti periferici. La preparazione fetta orizzontale è quindi adatto per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni della retina distese orizzontalmente, nonché la trasmissione del segnale sensoriale e l'integrazione attraverso le sinapsi selezionati.
Introduction
informazioni visive è codificata come un modello dinamico spazio-temporale dell'attivazione fotorecettori, e la sinapsi nastro tra fotorecettori e neuroni di secondo ordine determina il trasferimento valle di informazioni visive. La preparazione fetta verticale della retina dei mammiferi è uno strumento molto utile per studiare l'elaborazione del segnale nei percorsi verticali, cioè tra fotorecettori e cellule bipolari, e tra le cellule bipolari e alcuni tipi di cellule amacrine 1, 2, 3, 4.
Tuttavia, sezionamento verticale determina sempre gravi troncamento dei campi dendritiche di molti neuroni della retina, con conseguente notevole perdita di contatti sinaptici. Soprattutto nella retina esterna, cellule orizzontali sono colpiti a causa delle loro campi dendritiche estesi lateralmente diffondersi e sistemi terminali assone 5. In verticalepreparazione fetta, l'ingresso sinaptico di centinaia di terminali cono fotorecettori ai dendriti di una cellula orizzontale è così ridotto a un paio di contatti sparsi. Questo potrebbe essere sufficiente per studiare le proprietà delle singole sinapsi, ma lo fa in nessun modo rappresentano le capacità di elaborazione del segnale alla base l'attivazione sincronizzata delle sinapsi nastro fotorecettori.
Abbiamo quindi sviluppato una preparazione fetta orizzontale, che lascia quasi tutto il fotorecettore cono di ingresso sinaptica di dendriti di cellule orizzontali intatte e funzionali. Il piano di piste sezionamento parallela alla superficie della retina, idealmente taglio attraverso lo strato nucleare interno tra cellule orizzontali e le cellule amacrine. Così, fette orizzontali della retina esterna vengono creati contenenti, sul sito presinaptica, fotorecettori con segmenti interni ed esterni, nonché terminali sinaptici, e cellule orizzontali e cellule bipolari sul sito postsinaptico. Questa preparazione è adatto to indagare ingressi sinaptici coordinati in dendriti delle cellule orizzontali da tutti i fotorecettori cono all'interno del suo campo dendritiche. E quindi potrebbe rivelarsi utile per comprendere meglio il funzionamento della sinapsi nastro fotorecettore, che è cruciale per il trasferimento di informazioni visive dalla matrice di attivazione dei fotorecettori in una risposta post-sinaptica.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali emessi dalla Repubblica federale di Germania.
Nota: Poiché il tessuto retinico sarà privo di ossigeno durante prolungate parti di questa procedura, tutti i passaggi devono essere eseguiti più velocemente possibile. I topi dovrebbero essere adattata al buio di almeno 3 ore prima della dissezione. Per evitare la luce adattamento della retina, la preparazione e taglio deve essere effettuata sotto la luce rossa fioca.
1. Preparazione di media e altre sostanze chimiche
- Preparare Ames 'Medium 6. Dopo la dissezione, immergere il tessuto retinico in Medio Ames 'in ogni momento.
- Sciogliere 2,2 g di Ames 'Medium e 298 mg HEPES in 250 ml di acqua distillata. La concentrazione di HEPES sarà di 5 mM. Mescolare delicatamente fino a quando tutte le particelle sono dissolti.
- Bubble Ames 'Piano a temperatura ambiente con CarboGen (95% di ossigeno, 5% autoanidride bon) per almeno 5 minuti. CarboGen di alimentazione con una pipetta Pasteur di vetro alla soluzione. Collegare la pipetta Pasteur tramite tubazione appropriata all'uscita del regolatore di gas.
- Aggiungere 475 mg di bicarbonato di sodio alla soluzione. L'aggiunta di bicarbonato dopo gorgogliamento impedisce la precipitazione di carbonato di calcio.
- Preparare a bassa temperatura agarosio gelificazione. Agarosio è necessaria per l'integrazione del tessuto retinico durante vibratome sezionamento.
- Sciogliere 180 mg agarosio in 9 ml di Ames 'Medium e 1 ml di acqua distillata. Utilizzare un forno a microonde per riscaldare lentamente la soluzione di agarosio fino a quando tutti i solidi sono dissolti. Il calore in 5 - 10 sec incrementi per evitare l'overflow. Soluzione deve essere chiara e trasparente.
- Conservare disciolto agarosio a bagnomaria a 37 ° C per la durata della procedura.
2. Impostazione del Vibratome
NOTA: Tutti sezionamento è stata effettuata con ilvibratome elencati nella tabella materiali. Le date impostazioni si riferiscono a questo tipo di solo vibratome. Per ulteriori dettagli su vibratomo sezionamento del tessuto neurale si rimanda per fare riferimento a 7.
- Posizionare vibratome lama iniettore nella porta lama.
- Misurare deflessione verticale della lama con il dispositivo "Vibrocheck". Utilizzare la vite di regolazione sul portalama per inclinare la lama finché non è parallela al piano di taglio. L'esatto posizionamento della lama è necessario per prevenire effetti veneziane sulla superficie sezione e per produrre un tratto piano che contiene cellule viventi sulla sua superficie.
- Impostare vibratome alle seguenti impostazioni: ampiezza, 1.00; Velocità, 0.20; spessore 180 - 200 micron.
3. La dissezione del mouse Retina
- Anestetizzare adulti C57BL / 6 del mouse per la vaporizzazione di circa 1 ml di isoflurano in un contenitore a tenuta d'aria. Quando l'anestesia è completa, l'eutanasia degli animali da dislocazione cervicale. Ilmouse non dovrebbe essere più di 3 mesi, altrimenti la qualità delle fette peggiorerà.
- Rimuovere bulbo oculare mettendo una pinza curva sotto l'occhio. Delicatamente sollevare il bulbo oculare esporrà il nervo ottico. Tagliare il nervo ottico, con una forbice molla e trasferire la palla occhio di una capsula di Petri 35 millimetri contenente 2 ml di Ames 'Medium.
- Eseguire tutti i passaggi successivi sul palco di un microscopio stereo. Regolare l'ingrandimento ad un valore che consente il controllo visivo ottimale delle seguenti procedure (passi 3.4 - 3.9) si.
- Forare la cornea al passaggio alla sclera con una pinza a punta o con un ago 20 G. Durante questa fase, ferma la palla con un altro occhio pinze. Fare attenzione a non danneggiare la retina con il dispositivo punzonamento.
- Inserire le forbici primavera nel piccolo foro praticato nel punto 3.3 e tagliare un cerchio intorno alla cornea. Anche in questo caso, ferma la palla occhio con una pinza durante il taglio. Mantenere l'incisione molto vicino alla superficie per non cut nella retina.
- Rimuovere con attenzione cornea, lenti e corpo vitreo con una pinza. Il corpo vitreo comprende uno strato sottile trasparente nella parte posteriore dell'occhio. Tuttavia, è essenziale per vibratome sezionamento che il corpo vitreo è completamente rimosso.
- Nella capsula di Petri, posizionare l'oculare in modo che si guarda attraverso il foro in basso sulla retina. Il bordo dell'apertura dovrebbe consistere soltanto il tessuto sclerale. Se il taglio circolare (passo 3.4) è stata effettuata troppo vicino all'equatore del oculare, tessuto retinico sarà presente anche vicino all'incisione. Fate attenzione quindi a non danneggiare la retina al punto 3.8.
- Afferra la sclera con una pinza e strappare con cura il tessuto a parte. È essenziale non rottura retina durante questa fase. Se necessario, staccare la retina dalla serrata per stabilizzare la parte sclerale del tessuto con le pinze e con attenzione si staccava la retina con le altre pinze. Mantenere la pinza chiusi; mai gestire il retina con una pinza in quanto il tessuto è molto morbido e darà atto immediatamente.
NOTA: A questo punto, la retina e il resto della conchiglia oculare sarà collegato solo alla testa del nervo ottico. - Tagliare il sito di attacco alla testa del nervo ottico con le forbici a molla. La retina dovrebbe ora essere liberamente fluttuante in un unico pezzo di tessuto in media Ames '.
- Tagliare la retina in 4 - 6 piccoli rettangoli di circa 23 mm con una lama di bisturi curvo tenendo retina lungo i bordi con la pinza, per manipolare in posizione. Evitare di pizzicare il tessuto retinico all'interno dei rettangoli. Dai pezzi delle parti centrali della retina, non la periferia lontano.
- Trasferimento pezzi retinici con un grande diametro plastica pipetta Pasteur ad un piatto di plastica Petri 35 mm, il cui fondo è stato sostituito da una maglia con dimensione della griglia inferiore a 1 mm. Fissare la piastra di Petri nel terzo superiore di un matraccio becher o conica e immergere pezzi retiniche in bu Piano Ames 'bbled con CarboGen.
4. Integrazione di retina Pezzi in Agarosio
- Trasferire accuratamente 2 - 3 pezzi della retina in 35 mm piatto di plastica Petri insieme con alcuni dei Ames 'Medium. È più conveniente usare un grande diametro di plastica pipetta Pasteur per il trasferimento. In questa fase, l'orientamento esatto dei pezzi retiniche non importa.
- Rimuovere il più possibile del Piano rimanente Ames 'con una pipetta Pasteur di vetro. Non appena il liquido è stato rimosso procedere con passo 4.3. Non lasciare che la retina asciugare il tessuto.
- coprire immediatamente pezzi della retina con 2 ml di agarosio disciolto (37 ° C). Date le dimensioni di cui al punto 3.10, i pezzi non rannicchiarsi all'interno agarosio.
- All'interno agarosio liquido, spingere delicatamente pezzi retina al fondo della capsula di Petri. Lo strato di cellule gangliari deve essere rivolto verso il basso. Utilizzare un microscopio stereo per la sentenza della posizione esatta. Per il posizionamento, gestire pi retinaECE con una piccola spatola. Posizionare la retina più veloce e preciso possibile poiché l'agarosio solidifica rapidamente.
- Disporre pezzi retinici paralleli al fondo del piatto di vetro; altrimenti sezioni saranno tangenziale o oblique. Singoli pezzi non dovrebbero toccare l'un l'altro, ma anche non dovrebbero essere troppo distanti. Prova a mettere pezzi della retina più o meno sullo stesso livello orizzontale.
- Mettere in vetro capsula di Petri con pezzi della retina incorporati in frigorifero (4-6 ° C) per almeno 2 minuti. Questo si indurisce rapidamente l'agarosio per l'ulteriore elaborazione. Non appena l'agarosio si è polimerizzato procedere con il passaggio successivo.
5. Montaggio della retina Pezzi
- Rimuovere con attenzione il blocco di agarosio contenente pezzi retina dalla capsula di Petri. Utilizzare una spatola o un dispositivo simile per sollevare il blocco agarosio dal vetro. A causa di forze adesive, questo può rivelarsi molto difficile. Tuttavia, evitare di rompere ilblocco agarosio. Eseguire questo e tutti i successivi passaggi a temperatura ambiente.
- Posizionare il blocco di agarosio su un vetrino di vetro e regolarne le dimensioni con una lama di bisturi. Lasciare 1 - 2 mm di agarosio su ciascun lato dei pezzi retiniche. La dimensione finale del blocco dovrebbe essere di circa 1.066 millimetri (10 mm si riferisce all'altezza del blocco, 6 mm per la lunghezza bordo).
- Incollare il blocco di agarosio al titolare del campione del vibratome utilizzando un adesivo istantaneo. pezzi retiniche dovrebbero essere collocati nella parte superiore del blocco di alta 10 mm e orientata parallelamente alla sua superficie, mentre la parte inferiore è fissata al supporto.
- Coprire il blocco immediatamente versando Media precedentemente bollito Ames 'nel cassetto del buffer della vibratome.
6. Preparazione orizzontale vibratome Sezioni
- Inizia sezionamento. Inizialmente, impostare lo spessore di tagliare manualmente fino frammenti di tessuto retinico appaiono nella fetta. Quindi modificare le impostazioni al punto 2.3. poiché latopo retina è solo di circa 200 micron di spessore, non ci saranno più di 2 - 3 fette per blocco di agarosio.
- Rimuovere sezioni dal vassoio buffer con una bacchetta di vetro e trasferirli 2 ml Ames 'medie da 35 mm piastra di Petri.
- Conservare sezioni immediatamente in un incubatore a 37 ° C (5% CO 2/55% O 2). L'agarosio che circonda sezioni resterà solida in incubatrice e può essere utilizzato per gestire le sezioni senza danneggiare la retina. Migliore qualità fetta viene ottenuta quando immagazzinati a 37 ° C entro la rispettiva atmosfera rispetto a Media ossigenato Ames 'a RT. Le sezioni possono essere utilizzate immediatamente o possono essere memorizzati fino a 4 ore in incubatrice con buoni risultati fisiologici.
- Incorpora prossimi pezzi della retina in agarosio e ripetere le sezioni 4 - 6.
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Representative Results
In fette orizzontali della retina di topo, corpi cellulari orizzontali potrebbero essere facilmente identificati in base alla loro morfologia unico con diverse dendriti primari emergono da un corpo cellulare poligonale (Figura 1A). corpi cellulari orizzontali situati vicino alla superficie della fetta sono stati regolarmente accessibili per gli elettrodi di patch-clamp. Durante le registrazioni, le cellule sono state riempite con un colorante fluorescente, rivelando la loro arborizzazione dendritiche intricato, che assomigliava la morfologia delle cellule orizzontali assone portanti della retina di topo intatto 8 (Figura 1B). Etichettatura dei peduncoli cono con fluoresceina-coupled di arachide agglutinine ha mostrato una stretta relazione spaziale tra peduncoli cono e dendriti delle cellule orizzontali (Figura 1C). Con poche eccezioni, tutti i peduncoli cono all'interno del campo dendritica delle cellule orizzontali sono stati contattati da processi dendritiche.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Per dimostrare che i contatti tra coni e cellule orizzontali erano funzionali, registrazioni di patch-clamp sono state condotte da corpi cellulari orizzontali In condizioni adattati al buio, le risposte attuali erano. caratterizzata da una grande interiore corrente accompagnato da moderata a attività sinaptica ad alta frequenza (Figura 2A). la deviazione dalla linea di base e le correnti post-sinaptici eccitatori sono stati causati dalla costante rilascio di glutammato nel buio, attivando postsinaptica AMPA- e kainato tipo glutammato recettori 9. eventi sinaptici individuali sono stati caratterizzati da una forma d'onda monofasica o traiettorie attuali più complessi (Figura 2B). La presenza di attività post-sinaptica tonica suggerisce che il glutammato è stato rilasciato ai contatti sinaptici tra fotorecettori cono e dendriti delle cellule orizzontali mostrato nella Figura 1C.horizocellule ntale registrati risposto alle variazioni di intensità luminosa, che indica che la cascata di trasduzione del segnale nei fotorecettori cono era anche intatto e funzionale in un preparato fetta orizzontale. A causa della riduzione del rilascio del trasmettitore, il tonico corrente entrante di cellule orizzontali adattati al buio è stato inibito, e l'attività sinaptica appariva chiaramente diminuita durante la presenza di uno stimolo piena luce campo (1,300 W / cm 2, 470 40 nm) (Figura 3A). Allo stesso modo, un interruttore per l'oscurità da uno stato di luce-adattato causato una corrente verso l'interno e una maggiore attività sinaptica (Figura 3B). Inoltre, gli impulsi elettrici brevi (1-15 V, 1 msec) sono stati applicati attraverso un elettrodo di stimolazione bipolare platino-iridio di depolarizzazione tutti fotorecettori cono in prossimità di un corpo cellulare orizzontale. Il rilascio stimolazione indotta da glutammato evocato grande ampiezza eccitatorie correnti postsinaptiche nella cella orizzontale registrata (Figura 3C). in sDIFFICILE CONDIZIONE, questi risultati dimostrano in modo convincente che la sinapsi tra i fotorecettori cono e cellule orizzontali può essere manipolato sperimentalmente da una luce stimoli endogeni o da depolarizzazione controllata di elementi presinaptici.
Figura 1: Morfologia e contatti sinaptici di cellule orizzontali in un orizzontale Fetta Preparazione. Una cellula orizzontale (freccia) si trova vicino alla superficie della fetta è stata visualizzata con ottica a contrasto DODT. Barra di scala = 10 micron (A). Per gli esperimenti di imaging, una cellula orizzontale è stato riempito con Oregon verde 488 Bapta-1 (100 mM) tramite un patch-elettrodo, che è ancora collegato alla cella. Barra di scala = 10 micron (B). Sovrapposizione di una cellula orizzontale dye-iniettato e la matrice di peduncoli cono marcati con fluoresceina-coupled di arachide agglutinine rivela contatti sinaptici putativi. Barra di scala = 10 micron (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: attività sinaptica Registrato da una cellula del corpo orizzontale. Whole-cell voltage-clamp registrazione ad un potenziale di -60 mV tiene mostra alta frequenza tonica attività sinaptica (A). Alla più elevata risoluzione temporale (B), gli eventi sinaptici visualizzare forme d'onda monofasiche (freccia) o più traiettorie attuali complessi (frecce). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Le risposte attuali di corpi cellulari orizzontali evocati dalla luce e stimolazione elettrica. risposta luce di un corpo cellulare orizzontale adattata al buio registrata a -60 mV in possesso di potenziale. Illuminazione a tutto campo inibisce il tonico verso l'interno corrente e riduce l'attività sinaptica (A). Un corpo cellulare luce orizzontale adattata registrate nelle stesse condizioni mostra una corrente attivo dopo un lampo scuro accompagnato da un aumento dell'attività sinaptica durante buio (B). Le linee orizzontali in A e B rappresentano i tempi dello stimolo. Stimolazione extracellulare da impulsi elettrici brevi induce grandi ampiezza correnti postsinaptiche eccitatorie causa del rilascio di glutammato sincronizzato da fotorecettori cono (C). partecipazione potenziale: -60 mV. La freccia indica la temporizzazione dell'impulso di stimolazione. correnti troncati all'inizio della traccia rappresentano artefatti di stimolazione..com / files / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Contrariamente alle porzioni verticali, la morfologia dendritica dei neuroni orientate radialmente come cellule orizzontali e cellule amacrine è ben conservata. Rispetto ai preparati intere retina, questi tipi di cellule sono facilmente accessibili per microelettrodi e possono essere studiate da entrambe le tecniche elettrofisiologiche e di imaging. Qui, ci siamo concentrati sulla retina esterna; tuttavia, un approccio simile è stato segnalato in particolare per le cellule amacrine della retina interna 10.
Le proprietà della preparazione fetta orizzontale hanno diverse implicazioni per studi funzionali. Il numero di contatti sinaptici tra fotorecettori cono e cellule orizzontali post-sinaptici era quasi indistinguibile dalla retina intatto. contatti sinaptici erano funzionali, che mostra il rilascio del neurotrasmettitore tonico al buio. La sinapsi potrebbe essere attivato da stimoli sia endogeni come la luce / buio transizioni o dalla stimolazione bipolare esterno.
La tecnica qui presentata è in gran parte limitato ai neuroni orientati in senso orizzontale. Pertanto, non è possibile registrare da fotorecettori e cellule bipolari intatte in una fetta orizzontale, in quanto gli assoni delle cellule bipolari verranno troncati. Inoltre, è impossibile controllare perfettamente il livello di sezionamento. Un singolo pezzo della retina mIRITTO quindi essere tagliato a livello indesiderato, per esempio tra segmenti esterni ed interni di fotorecettori. Aumentando il numero di pezzi della retina all'interno di un blocco di aumenti di agarosio possibilità di una corretta piano di sezionamento, almeno in un unico pezzo.
La preparazione fetta orizzontale si adatta bene a studiare le proprietà uniche di sinapsi nastro di coni e bastoncelli fotorecettori. Finora, abbiamo usato un sistema di knock-out animale per studiare il ruolo delle proteine presinaptiche complexin 3 e 4 complexin sulla trasmissione sinaptica tra i fotorecettori cono e cellule orizzontali 11. E 'anche possibile studiare le proprietà dei recettori postsinaptici neurotrasmettitori, come illustrato in precedenza 9.
Le applicazioni future includeranno lo studio delle proteine sinaptiche basate su linee di topi transgenici con tecniche elettrofisiologiche e di imaging. Sarà anche possibile indagare il pro biofisicoprietà di giunzioni tra le cellule orizzontali. Poiché le risposte di luce possono essere misurate, la tecnica sarà anche utilizzato per studiare la codifica di stimoli endogeni alla prima sinapsi del sistema visivo. E 'possibile effettuare la preparazione al buio per impedire alla luce adattamento del tessuto, altrimenti le risposte luce sarà ampiamente cono guidato.
In sintesi, la preparazione fetta orizzontale rappresenta un nuovo approccio per migliorare l'accessibilità delle singole sinapsi come prerequisito per studiare le proprietà funzionali della retina mammiferi 12.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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