Summary
Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.
Abstract
preparações fatia vertical são bem estabelecido para o estudo e circuitos de transmissão de sinal na retina de mamífero adulto. O plano de corte nestas preparações é perpendicular à superfície da retina, tornando-o ideal para o estudo dos neurónios e radialmente orientadas, como os fotorreceptores e as células bipolares. No entanto, as grandes células de mandris dendríticas, células horizontais amácrinas de campo amplo, e as células ganglionares são na maior parte truncada, deixando marcadamente reduzida actividade sináptica nestas células. Considerando que as células ganglionares e células amácrinas deslocadas pode ser estudada em toda uma preparação-montada da retina, células horizontais e células amácrinas localizados na camada nuclear interna são pouco acessível para eléctrodos no tecido da retina inteira.
Para alcançar o máximo de acessibilidade e integridade sináptica, desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina do rato, e estudou a transmissão do sinal na sinapse entre fotorreceptores e horizontalcélulas. corte horizontal permite (1) identificação visual fácil e não ambígua de corpos celulares horizontais para segmentação eletrodo, e (2) a preservação dos campos dendríticas de células horizontal estendidos, como um pré-requisito para cone de entrada sináptica intacta e funcional para os dendritos das células horizontais.
células horizontais de fatias horizontais exibiram atividade sináptica tónico no escuro, e eles responderam a breves flashes de luz com uma redução da atividade sináptica atual e diminuída para dentro. evidência imunocitoquímica indica que quase todos os cones dentro do campo dendrítica de uma célula horizontal estabelecer sinapses com os dendritos periféricos. A preparação fatia horizontal é, portanto, bem adequado para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios da retina estendida horizontalmente, bem como transmissão de sinais sensoriais e de integração através das sinapses selecionados.
Introduction
A informação visual é codificado como um padrão espaço-temporal dinâmica de ativação de fotorreceptores, e da sinapse fita entre fotorreceptores e neurônios de segunda ordem determina a transferência a jusante da informação visual. A preparação fatia vertical da retina de mamífero é uma ferramenta muito valiosa para estudar o processamento de sinais em vias verticais, ou seja, entre os fotorreceptores e as células bipolares, e entre células bipolares e alguns tipos de célula amacrine 1, 2, 3, 4.
No entanto, de corte vertical, sempre causa grave truncagem dos campos dendríticas de muitos neurônios da retina, levando à perda considerável de contatos sinápticos. Especialmente na retina externa, células horizontais são afetados devido aos seus campos dendríticas estendidos lateralmente, distribuídos e sistemas de terminais axônio 5. Numa verticaispreparação fatia, a entrada sináptica de centenas de terminais cone fotorreceptoras para os dendritos de uma célula horizontal é, assim, reduzida a alguns contactos esparsas. Isto pode ser suficiente para estudar as propriedades de sinapses individuais, mas não representam de nenhum modo as capacidades de processamento de sinal sincronizado subjacentes a activação das sinapses fita de fotorreceptores.
Assim, desenvolvemos uma preparação fatia horizontal, o que deixa a quase totalidade do fotorreceptores cone de entrada sináptica para dendrites horizontais intacta e funcional. O plano de seccionamento corre paralelo à superfície da retina, idealmente o corte através da camada nuclear interna entre as células horizontais e células amácrinas. Deste modo, as fatias horizontais da retina externa são criadas, contendo, no sítio pré-sináptica, os fotorreceptores com segmentos interiores e exteriores, bem como terminais sinápticos, e células horizontais e células bipolares no local pós-sináptica. Esta preparação é bem adequado to investigar entradas sinápticas coordenadas em dendritos das células horizontais por todos os cones fotorreceptores dentro de seu campo dendrítica. Assim, pode ser útil para compreender melhor o funcionamento da sinapse fita de fotorreceptores, que é crucial para a transferência de informação visual a partir da matriz de ativação de fotorreceptores em uma resposta pós-sináptica.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para experiências com animais emitidos pela República Federal da Alemanha.
Observação: Uma vez que o tecido da retina vai ser desprovido de oxigénio durante partes prolongadas deste processo, todos os passos devem ser realizadas tão depressa quanto possível. Ratos deve ser escuro adaptado pelo menos 3 horas antes da dissecção. Para evitar a adaptação à luz da retina, a preparação e o corte deve ser realizado sob luz vermelha fraca.
1. Preparação da mídia e de outros produtos químicos
- Prepare Ames 'Medium 6. Após a dissecação, imergir tecido da retina em Meio de Ames em todos os momentos.
- Dissolver 2,2 g de Ames 'Médio e 298 mg HEPES em 250 ml de água destilada. A concentração de HEPES irá ser de 5 mm. Mexa delicadamente até que todas as partículas são dissolvidas.
- Médio da bolha Ames à temperatura ambiente com carbogénio (95% de oxigénio, 5% carrodióxido de bon) durante pelo menos 5 min. carbogénio de alimentação com uma pipeta de Pasteur de vidro para a solução. Ligue o pipeta Pasteur através de uma tubagem adequada para a saída do regulador de gás.
- Adicionar 475 mg de sódio-bicarbonato de sódio à solução. A adição de bicarbonato após borbulhamento evita a precipitação de carbonato de cálcio.
- Prepare baixo agarose temperatura de gelificação. A agarose é necessária para a incorporação do tecido da retina durante o corte vibratome.
- Dissolve-se 180 mg de agarose em 9 ml de Meio de Ames e 1 ml de água destilada. Usar um forno de microondas para aquecer lentamente a solução de agarose até todos os sólidos estarem dissolvidos. Calor em 5 - 10 incrementos seg para evitar transbordamento. Solução deve ser límpida e transparente.
- Loja dissolver a agarose em banho de água a 37 ° C durante a duração do processo.
2. Configurando o Vibratome
NOTA: Todos corte foi realizado com ovibratome listados na Tabela Materiais. As definições dadas referem-se a este tipo de apenas vibratome. Para mais detalhes sobre vibratome seccionamento do tecido neural consulte Referência 7.
- Coloque vibratome lâmina injector no suporte da lâmina.
- Medir a deflexão vertical da lâmina com o dispositivo "VibroCheck". Usar o parafuso de ajustamento no suporte da lâmina para inclinar a lâmina até que é paralelo ao plano de corte. O posicionamento exacto da lâmina é necessário para prevenir os efeitos do estore veneziano sobre a superfície da secção e para produzir uma secção plana que contém as células vivas sobre a sua superfície.
- Definir vibratome com as seguintes configurações: amplitude, 1,00; velocidade, 0.20; espessura, 180-200 uM.
3. Dissecção do mouse Retina
- Anestesie adultos C57BL / 6 de rato por vaporização de cerca de 1 ml de isoflurano num recipiente estanque ao ar. Quando a anestesia é completa, a eutanásia dos animais por deslocação cervical. orato não devem ter mais de 3 meses, de outro modo a qualidade das fatias irá deteriorar-se.
- Remover olho bola, colocando uma pinça curva sob o olho. Gentilmente levantando a bola do olho irá expor o nervo óptico. Cortar o nervo óptico com uma tesoura primavera e transferir a bola de olho para uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 ml de Ames Médio.
- Realizar todas as etapas subseqüentes no palco de um microscópio estéreo. Ajustar a ampliação para um valor que permite o controlo visual optimizada dos seguintes procedimentos (as etapas de 3,4-3,9).
- Perfurar a córnea na transição para a esclera com uma pinça de pontas ou de uma agulha 20 G. Durante esta etapa, equilibrar a bola de olho com outro fórceps. Tenha cuidado para não danificar a retina com o dispositivo de perfuração.
- Insira a tesoura primavera no pequeno orifício feito na etapa 3.3 e cortar um círculo ao redor da córnea. Mais uma vez, segurar a bola do olho com uma pinça durante o corte. Manter a incisão muito perto da superfície de modo a não cut na retina.
- Remova cuidadosamente córnea, cristalino e corpo vítreo com uma pinça. O corpo vítreo é composto apenas por uma camada fina e transparente na parte de trás do olho. No entanto, é essencial para vibratome seccionamento que o corpo vítreo é totalmente removido.
- Na placa de Petri, posicionar a ocular de uma forma que se olha através do furo para baixo, sobre a retina. O aro da abertura deve ser composto de apenas tecido escleral. Se o corte circular (passo 3.4) foi levada a cabo demasiado perto do equador da ocular, tecido da retina, também estará presente próximo da incisão. Tenha cuidado, em seguida, para não danificar a retina no passo 3.8.
- Agarrar a esclera com uma pinça e arrancar com cuidado o tecido distante. É essencial para não romper a retina durante este passo. Se necessário, descolar a retina do ora serrata por equilibrando a parte escleral do tecido com a pinça e cuidadosamente descascar a retina com os outros fórceps. Mantenha a pinça fechada; nunca manuseie a retina com uma pinça desde o tecido é muito macio e dará lugar imediatamente.
NOTA: Nesta etapa, a retina e o resto da ocular será ligado apenas na cabeça do nervo óptico. - Corte o local de ligação na cabeça do nervo óptico com a tesoura primavera. A retina deve agora ser flutuando livremente como uma só peça de tecido em Meio de Ames.
- Cortar a retina em 4 - 6 pequenos retângulos de aproximadamente 23 mm, utilizando uma lâmina de bisturi curvado, segurando a retina ao longo das bordas com a pinça, para manipulá-lo na posição. Evite trilhar o tecido da retina dentro dos retângulos. Aqui peças das partes central da retina, e não a periferia longe.
- Transferir peças da retina com um grande diâmetro de Pasteur de plástico pipeta para uma placa de petri de plástico de 35 mm, o fundo do qual tem sido substituído por uma malha com tamanho da grade inferior a 1 mm. Fixar a placa de Petri dentro do terço superior de uma garrafa ou recipiente cónico e submergir peças da retina de BU Médio Amesbbled com carbogênio.
4. Incorporação de Retinal Pieces em Agarose
- transferir cuidadosamente 2 - 3 partes da retina em cerca de 35 mm plástico de Petri em conjunto com alguns dos Ames Médio. É mais conveniente usar um grande diâmetro de Pasteur de plástico pipeta de transferência. Neste passo, a orientação exacta das peças da retina não importa.
- Remover o máximo possível de Meio de Ames remanescente 'com uma pipeta de Pasteur de vidro. Assim que o líquido foi removido prosseguir com o passo 4.3. Não deixe que a seca tecido da retina.
- Imediatamente cobrir peças da retina com 2 ml de dissolver a agarose (37 ° C). Dado o tamanho mencionado na etapa 3.10, as peças não irá enrolar-se dentro do agarose.
- Dentro do líquido de agarose, suavemente empurrar partes da retina ao fundo do prato de petri. A camada de células ganglionares deve estar voltada para baixo. Use um microscópio estéreo para julgamento da posição exata. Para o posicionamento, lidar com pi da retinaECES com uma pequena espátula. Posicionar a retina o mais rápido e preciso possível uma vez que a agarose irá solidificar rapidamente.
- Providenciar partes da retina paralela ao fundo do prato de vidro; caso contrário, as seções serão tangencial ou oblíqua. peças individuais não devem tocar uns aos outros, mas também não deve ser muito longe. Tentar colocar as peças da retina mais ou menos no mesmo nível horizontal.
- Coloque placa de petri de vidro com peças da retina encaixada no refrigerador (4-6 ° C) durante pelo menos 2 min. Isto irá rapidamente endurecer a agarose para processamento posterior. Assim que a agarose foi polimerizado prosseguir com o próximo passo.
5. Montagem da retina Pieces
- Remova cuidadosamente o bloco de agarose contendo pedaços de retina da placa de Petri. Usar uma espátula ou um dispositivo semelhante ao levantar o bloco de agarose a partir do vidro. Devido às forças adesivas, isso pode vir a ser bastante difícil. No entanto, evitar a quebra dobloco de agarose. Realizar este e todos os passos subsequentes à temperatura ambiente.
- Coloque o bloco de agarose em uma lamela de vidro e ajustar seu tamanho, com uma lâmina de bisturi. Deixar 1 - 2 mm de agarose em cada lado das peças da retina. O tamanho final do bloco deve ser de cerca de 1,066 milímetro (10 mm refere-se à altura do bloco, 6 mm ao seu comprimento de bordo).
- Cole o bloco de agarose para o suporte de amostras do vibratome usando um adesivo instantâneo. peças da retina devem ser localizado na parte superior do bloco de alta 10 mm, e orientado paralelamente à sua superfície, enquanto a parte inferior é afixada ao suporte.
- Cubra o bloco imediatamente por vazamento médio do Ames anteriormente borbulhar "na bandeja de tampão do vibratome.
6. Preparação Horizontal vibratome Secções
- Comece o corte. No primeiro, definir a espessura de cortar manualmente até fragmentos de tecido da retina aparecer na fatia. Em seguida, altere as configurações no passo 2.3. Desde oretina do rato é apenas cerca de 200 um de espessura, não haverá mais do que 2-3 fatias por bloco de agarose.
- Remover seções da bandeja de tampão com uma vareta de vidro e transferi-los para 2 ml de Meio Ames 'em uma placa de Petri de 35 mm.
- Secções de armazenamento imediatamente em uma incubadora a 37 ° C (5% CO2 / 55% de O 2). A agarose em torno das secções permanecerão sólido na incubadora e pode ser usado para manipular as secções sem danificar a retina. Melhor qualidade fatia é obtida quando o armazenamento a 37 ° C no interior da respectiva atmosfera comparação com Médio Ames oxigenado 'à TA. As secções podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas até quatro horas na incubadora com bons resultados fisiológicos.
- Incorporar próximos pedaços de retina em agarose e repetir Secções 4 - 6.
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Representative Results
Em fatias horizontais da retina de rato, corpos celulares horizontais podem ser facilmente identificados de acordo com a sua morfologia original com vários dendritos primários emergentes a partir de um corpo celular poligonal (Figura 1A). corpos celulares horizontal localizada perto da superfície da fatia foram rotineiramente acessível para eléctrodos de patch-clamp. Durante gravações, as células foram preenchidos com um corante fluorescente, revelando a sua arborização dendrítica intrincado, que se assemelhava muito a morfologia das células horizontal com rolamento de axónios da retina do rato intacto 8 (Figura 1B). Rotulagem dos pedículos cone com aglutinina de amendoim juntamente com fluoresceína mostrou uma relação espacial próxima entre pedículos cone e dendritos das células horizontais (Figura 1C). Com poucas exceções, todos os pedículos cone dentro de campo dendríticas da célula horizontal foram contatados por processos dendríticos.
ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Para provar que os contactos entre os cones e células horizontais eram funcionais, gravações de patch-clamp foram realizadas a partir de corpos de células horizontais Sob condições de adaptação ao escuro, as respostas atuais eram. caracterizado por uma grande corrente para dentro acompanhada de moderada a actividade sináptica de alta frequência (Figura 2A). o desvio da linha de base e as correntes excitatório pós-sináptico foram causados pela libertação constante de glutamato no escuro, a activação pós-sináptica AMPA- e do tipo cainato glutamato 9 receptores. sinápticas eventos individuais foram caracterizados por uma forma de onda monofásicas ou trajectórias de corrente mais complexos (Figura 2B). A presença de actividade pós-sináptica de glutamato tónico sugere que foi lançado nos contactos sinápticos entre fotorreceptores cone e dendrites horizontais mostradas na Figura 1C.horizocélulas ntal gravados responderam a alterações na intensidade da luz, indicando que a cascata de transdução de sinal em fotorreceptores cone também estava intacto e funcional numa preparação fatia horizontal. Devido à redução da libertação do transmissor, o tónico para dentro corrente de células horizontais adaptados ao escuro foi inibida, e a actividade sináptica apareceu claramente diminuída durante a presença de um estímulo de luz de campo total (1,300 W / cm 2, de 470 40 nm) (Figura 3A). Da mesma forma, uma mudança para a escuridão de um estado de luz adaptada causou uma corrente interna e aumento da atividade sináptica (Figura 3B). Além disso, breves pulsos elétricos (1-15 V, 1 ms) foram aplicados por meio de um eléctrodo de estimulação bipolar de platina-irídio para despolarizar os fotorreceptores cone na vizinhança de um corpo da célula horizontal. A libertação induzida por estimulação do glutamato evocado grande amplitude correntes excitatório pós-sináptico na célula horizontal registada (Figura 3C). em sRESUMO, esses resultados mostram de forma convincente que a sinapse entre cones fotorreceptores e células horizontais pode ser manipulado experimentalmente por tanto a luz de estímulo endógena ou por despolarização controlada de elementos pré-sinápticos.
Figura 1: Morfologia e contatos sinápticos de células horizontais em uma fatia Preparação Horizontal. Uma célula horizontal (seta) situado perto da superfície da fatia foi visualizado com óptica de contraste de Dodt. Barra de escala = 10 uM (A). Para as experiências de imagiologia, uma célula horizontal foi preenchido com verde de Oregon 488 BAPTA-1 (100 uM) por meio de um remendo-eléctrodo, o qual está ainda ligado à célula. Barra de escala = 10 um (B). Sobreposição de uma célula horizontal injeção de corante e a matriz de pedículos cone marcadas com aglutinina de amendoim juntamente com fluoresceína revela contatos sinápticos putativos. Barra de escala = 10 um (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Atividade Synaptic gravadas de um corpo celular Horizontal. Whole-cell gravação voltagem-grampo com um potencial de manutenção de -60 mV mostra de alta frequência actividade sináptica tónico (A). Com maior resolução temporal (B), eventos sinápticos exibir formas de onda monofásicas (seta) ou mais trajetórias atuais complexos (setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Respostas atuais de corpos celulares horizontais evocado pela luz e estimulação elétrica. resposta à luz de um corpo celular horizontal de adaptação ao escuro registrou a -60 mV segurando potencial. Iluminação de campo total inibe a tônica para dentro atual e reduz a atividade sináptica (A). Um corpo celular horizontal luz adaptado registrados nas mesmas condições exibe uma corrente interna na sequência de um escuro flash acompanhado pelo aumento da atividade sináptica durante a escuridão (B). As linhas horizontais em A e B representam o momento do estímulo. Estimulação extracelular por pulsos elétricos breves induz correntes pós-sinápticos de grande amplitude excitatórios devido à liberação sincronizada de glutamato de cones fotorreceptores (C). potencial de realização: -60 mV. A seta indica a temporização do impulso de estimulação. correntes truncadas no início do traço representam artefactos de estimulação..com / files / ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em contraste com fatias verticais, a morfologia dendrítica de neurónios e radialmente orientadas, como as células horizontais e células amácrinas é bem preservada. Em comparação com as preparações de retina inteiros, estes tipos de células são facilmente acessíveis para microeléctrodos e pode ser estudado por ambos os métodos electrofisiológicos e de imagem. Aqui, nós nos concentramos na retina externa; No entanto, uma abordagem semelhante tem sido reportado especialmente para células amácrinas da retina interna 10.
As propriedades da preparação fatia horizontal tem várias implicações para estudos funcionais. O número de contatos sinápticos entre cones fotorreceptores e células horizontais pós-sinápticos era quase indistinguível da retina intacta. contatos sinápticos eram funcionais, mostrando liberação tônica do neurotransmissor no escuro. A sinapse pode ser ativado por qualquer estímulos endógenos como luz / transições escuros ou por estimulação bipolar externo.
A técnica apresentada aqui é principalmente limitado aos neurônios orientados horizontalmente. Portanto, não é possível gravar a partir de fotorreceptores e células bipolares intactas em uma fatia horizontal, uma vez que os axónios de células bipolares será truncada. Além disso, é impossível controlar perfeitamente o nível de seccionamento. Uma única peça de retina might, portanto, ser cortado em um nível indesejável, por exemplo, entre os segmentos exteriores e interiores de fotorreceptores. Aumentar o número de peças da retina dentro de um bloco aumenta as chances de agarose de um plano correto de corte, pelo menos, em uma única peça.
A preparação fatia horizontal é bem adequado para estudar as propriedades únicas de sinapses fita de bastonetes e cones fotorreceptores. Até agora, temos utilizado um sistema de knock-out animal para investigar o papel das proteínas pré-sinápticas complexin 3 e 4 complexin na transmissão sináptica entre cones fotorreceptores e células horizontais 11. Também é possível estudar as propriedades de receptores de neurotransmissores pós-sinápticos, como mostrado anteriormente 9.
As aplicações futuras incluem o estudo de proteínas sinápticas com base em linhagens de camundongos transgênicos com técnicas electrofisiológicas e de imagem. Será também possível investigar o pró biofísicopriedades de junções comunicantes entre as células horizontais. Uma vez que as respostas de luz pode ser medida, a técnica também irá ser utilizado para investigar a codificação de estímulos endógenos na primeira sinapse do sistema visual. É possível efectuar a preparação na escuridão para evitar adaptação à luz do tecido, caso contrário, as respostas de luz vai ser em grande parte de cone impulsionada.
Em resumo, a preparação fatia horizontal representa uma nova abordagem para aumentar a acessibilidade de sinapses individuais como um pré-requisito para estudar as suas propriedades funcionais na retina de mamífero 12.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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