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Intravital माइक्रोस्कोपी और एक हेयरलैस माउस के कान के सिरे में thrombus प्रेरण

Published: April 2, 2017 doi: 10.3791/55174
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1, 3
1Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery "Otto Koerner", Rostock University Medical Center, 2Department of General, Thoracic, Vascular and Transplantation Surgery, Rostock University Medical Center, 3Institute for Experimental Surgery, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

गंजा SKH1 घंटे का घंटा माउस के कान मॉडल की जांच की microvascular बिस्तर में पूर्व शल्य तैयारी के बिना microcirculation और phototoxic thrombus प्रेरण के intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सक्षम बनाता है। इसलिए, गंजा माउस के कान विवो मॉडल में एक उत्कृष्ट microvascular thrombus गठन, thrombus विकास, और थ्रोम्बोलिसिस दौरान जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए है।

Abstract

संवहनी रोगों के thrombotic जटिलताओं रुग्णता और औद्योगिक देशों में मृत्यु दर में से एक प्रमुख कारण हैं। Thrombus गठन के दौरान सेलुलर और गैर सेलुलर रक्त घटकों के बीच जटिल संबंधों के कारण, शरीर विज्ञान और घनास्त्रता के pathophysiology के विश्वसनीय पढ़ाई केवल विवो में किया जा सकता है। इसलिए, इस लेख गंजा चूहों में एक कान मॉडल प्रस्तुत करता है और microcirculation, thrombus गठन, और थक्का विकास के इन विवो विश्लेषण पर केंद्रित है। intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और अंतःशिरा (चतुर्थ) संबंधित फ्लोरोसेंट रंजक के आवेदन का उपयोग करके, अलिंद में microcirculation के दोहराव विश्लेषण आसानी से शल्य तैयार करने के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है,। इसके अलावा, इस मॉडल विभिन्न मुद्दों के इन विवो पढ़ाई, घाव भरने, reperfusion चोट, या एंजियोजिनेसिस सहित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सारांश में, गंजा चूहों के कान में विव के लिए एक आदर्श मॉडल हैशारीरिक या pathophysiological की स्थिति में हैं और विभिन्न प्रणालीगत या सामयिक उपचार की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए त्वचा microcirculation की ओ अध्ययन।

Introduction

वर्तमान अनुच्छेद के प्रयोजन के प्रत्यक्ष अवलोकन और microcirculation के विश्लेषण, thrombus गठन, और थक्का विकास के लिए गंजा माउस के अलिंद के लिए आवेदन किया intravital माइक्रोस्कोपी की तकनीक का वर्णन करने के लिए है। 1000 में 1 की एक घटना दर के साथ, शिरापरक घनास्त्रता अभी भी रुग्णता का एक आम कारण है। हालांकि निदान, रोकथाम रणनीतियों, और चिकित्सा हाल के वर्षों में विकसित किया गया है, शिरापरक घनास्त्रता का एक तिहाई एक फुफ्फुसीय अन्त: शल्यता 1 के रूप में प्रकट होता है। धमनी घनास्त्रता हृदय रोगों, जो औद्योगिक देशों में मौत का सबसे आम कारण हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। धमनी atherosclerotic सजीले टुकड़े का टूटना के आधार पर घनास्त्रता दिल का दौरा, mesenteric रोधगलन, और मिरगी में शामिल है। हर सर्जरी रक्त घटकों को subendothelial संरचनाओं को उजागर करता है, रक्त प्रवाह की गतिशीलता बदल जाता है, और रोगी immobilizes। निचले अंग, अंग टी की endoprosthetic सर्जरी मेंransplantation और फ्लैप सर्जरी घनास्त्रता जटिलताओं के लगातार कारण होते हैं। विशेष रूप से माईक्रवैस्कुलर घनास्त्रता अक्सर नैदानिक ​​लक्षणों की कमी के कारण, अपरिवर्तनीय क्षति का कारण बनता है। इसी तरह, microvascular घनास्त्रता थ्रोम्बोटिक थ्रोम्बोसाइटोपेनिक परपूरा, पूति, फैलाया intravascular जमावट, antiphospholipid सिंड्रोम, और क्रोनिक शिरापरक कमी, अन्य लोगों के अलावा सहित कई रोगों में एक महत्वपूर्ण नियम निभाता है।

चिकित्सा और घनास्त्रता की रोकथाम के लिए कई नई दवाओं हाल के वर्षों में विकसित किए गए, लेकिन एन्टीप्लेटलेट दवाओं और थक्का-रोधी अभी भी दुष्प्रभाव, कमी विरोधी है, और लंबी अवधि के प्रभाव शामिल हैं। इन कमियों को आपातकालीन चिकित्सा सेवा में समस्याओं को जन्म दे। इस प्रकार, और अधिक शोध जटिल प्रक्रियाओं है कि घनास्त्रता, जो शायद ही इन विट्रो में नकली किया जा सकता है के दौरान होने को उजागर करने की जरूरत है।

गंजा SKH1 घंटे का घंटा माउस लंदन में एक चिड़ियाघर 1926 की खोज की थी।गुणसूत्र 14 पर एक जीन दोष के कारण, पशु अपने फर प्रसव के बाद दिन 10 के बाद यह अच्छी तरह से vascularized अलिंद वाहिकाओं के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए सुलभ बना देता है खो देता है। कान की औसत मोटाई 300 सुक्ष्ममापी है। यह त्वचा की दो परतों, जो उपास्थि से अलग होते हैं के होते हैं। उपास्थि के उत्तल पृष्ठीय पक्ष पर, 3 संवहनी बंडलों earlobe दर्ज करें। शिखर संवहनी आर्क्स और बेसल शंट तीन बंडलों कनेक्ट। venules 200 सुक्ष्ममापी (बेसल) और 10 सुक्ष्ममापी (शिखर) के बीच व्यास की है। बंद meshed केशिकाओं के चारों ओर खाली बाल कूप 2। गंजा SKH1 घंटे का घंटा माउस की शारीरिक रचना अलिंद घनास्त्रता अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली और लागत प्रभावी मॉडल बनाता है।

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Protocol

सभी इन विवो प्रयोगों (7221.3-1-006 / 15) पशुओं के संरक्षण और देखभाल और प्रयोगशाला पशु की उपयोग के लिए एनआईएच गाइड (प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) पर जर्मन कानून के अनुसार आयोजित की गई।

1. पशु के जनरल रखते हुए

  1. पुरुष SKH1 घंटे का घंटा 4 से 6 सप्ताह के आयु वर्ग के चूहों के साथ प्रदर्शन करते हैं। 20 और 25 ग्राम के बीच एक वजन के साथ जानवरों का प्रयोग करें।
  2. पानी और भोजन यथेच्छ को स्थिर उपयोग के साथ, एक रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में और 26 डिग्री सेल्सियस के लिए 24 के मानकीकृत की स्थिति और के बारे में 60% सापेक्ष आर्द्रता के तहत जानवरों रखें।
  3. एक पिंजरे में पांच पुरुष जानवरों तक रखें। उनकी भलाई के लिए पशुओं के आवास के दौरान बिस्तर और संवर्धन सामग्री प्रदान करें।

2. पशु की prearrangement

  1. एक माउस वजन और संबंधित दवा लोड (जैसे, cannabinoid, 5 मीटरग्राम / किलो वजन (BW)) एक इंसुलिन सिरिंज में। दवा 30 मिनट thrombus प्रेरण से पहले का नियंत्रित करें।
  2. अंगूठे और तर्जनी और छोटी उंगली के साथ माउस की पूंछ के बीच माउस की गर्दन पकड़ कर, पशु खिंचाव और पेट के नीचे बाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग में दवा intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षन। 15 मिनट के लिए पिंजरे में वापस पशु रखो।
  3. ketamine (90 मिलीग्राम / किग्रा BW) और xylazine (25 मिलीग्राम / किग्रा BW) के साथ संज्ञाहरण तैयार करें। 15 मिनट के thrombus प्रेरण से पहले, माउस anesthetize। पिंजरे में माउस रखो, पूंछ थोड़ा खींच, और एक इंसुलिन सिरिंज के साथ निश्चेतक आईपी इंजेक्षन।
  4. पिंजरे में वापस संज्ञाहरण के शुरू होने तक माउस रखो। पर्याप्त संज्ञाहरण सत्यापित करने के लिए, संदंश के साथ पूंछ में लाएं।
  5. एक इंसुलिन सिरिंज में; लोड 0.05 डीफ़्रॉस्ट fluorescein आइसोथियोसाइनेट लेबल dextran (5%, 150 केडीए FITC-dextran) की एमएल। सिरिंज भरने, वहीं यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले, रहेगा, क्योंकि यहां तक ​​कि छोटे intravenously (iv) -administered हवाई बुलबुले जानवर के लिए घातक हो सकता है।
  6. मुंह के बल स्थिति में एक हीटिंग थाली पर संज्ञाहरण माउस रखें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग थाली को समायोजित करें।
  7. माउस के कॉर्निया पर आंख मरहम रखो। त्वचा कीटाणुरहित और बाँझ उपकरणों का उपयोग करें।
  8. दाएं कान के कपाल और दुम बढ़त में polypropylene 7/0 के दो टांके सिलाई। संभव (चित्रा 1 बी) के रूप में आधार के लिए धार के रूप में करीब है और समीपस्थ रूप में टांके रखें।
  9. पृष्ठीय स्थिति के लिए माउस Shift। चिपकने वाला स्ट्रिप्स का उपयोग कर acrylglass मंच के लिए सभी पैरों को ठीक करें। सामने के दांतों के तहत एक टांका हुक और चिपकने वाला स्ट्रिप्स के साथ acrylglass को टांका चिपके द्वारा पीछे की ओर मुडना में सिर की स्थिति।
  10. आपरेशन stereomicroscope के तहत मंच पर पशु सरकाना। 16X आवर्धन का प्रयोग करें।

3. वाम गले की नस और FITC-dextran इंजेक्शन की तैयारी

नोट: माइक के लिएदाएं कान के roscopy, बाईं गले की नस तैयार करते हैं।

  1. एक छुरी का उपयोग करना, एक cranio-दुम दिशा में गर्दन के बाईं ओर त्वचा में एक 5 मिमी चीरा पैदा करते हैं। एक microforceps और microscissors के साथ चमड़े के नीचे ऊतक काटना। पॉलिएस्टर 8/0 टांके के साथ या electrocoagulation साथ या तो Ligate पार वाहिकाओं।
  2. microforceps और microscissors का उपयोग कर अपने बाह्यकंचुक से नस मुक्त पोत बिना छुए।
  3. फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन के लिए तैयार इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग करें। ध्यान से नस perforating के बिना, microforceps साथ पोत दीवार हड़पने। सिरिंज के साथ distended पोत दीवार घुसना और इंजेक्षन FITC-dextran iv।
  4. सिरिंज कपास के फाहे का उपयोग कर वापस लेने के बाद खून बह रहा बंद करो। खून से बचें और कान के प्रदूषण को डाई।

4. intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए सही कान की स्थिति

  1. एक acrylglass ग हीटिंग थाली पर पशु स्थानांतरणहीटिंग थाली के लिए एक स्लॉट और कान स्थिति के लिए एक 0.5 सेमी उच्च विमान के साथ onstruction।
  2. हीटिंग चिपकने वाला स्ट्रिप्स का उपयोग कर प्लेट पर नीचे ठीक पशु चेहरा। कान (चित्रा 1 बी) ताकि कान के शिखर हिस्सा विमान पर फ्लैट तैनात किया जा सकता है के लिए 0.5 सेमी उच्च विमान के बगल में कान के आधार पर अपेक्षाकृत मजबूत और उत्तल उपास्थि रखें।
  3. आदेश कान स्थिति में acrylglass विमान को कमरे के तापमान 0.9% सोडियम क्लोराइड की एक बूंद जोड़ें। दाएं कान रखें, इसके अवतल उदर पक्ष पर योजनाबद्ध टांके नीचे की ओर का सामना करना पड़, 0.9% सोडियम क्लोराइड की बूंद पर साथ। कपास के फाहे का उपयोग करना, सोडियम क्लोराइड की बूंद अवशोषित और केशिका बलों acrylglass को कान विमान देते हैं।
  4. acrylglass को टांके टेप कान की स्थिति ठीक करने के लिए।
  5. 0.9% कमरे के तापमान सोडियम क्लोराइड की एक बूंद कान के उत्तल पृष्ठीय पक्ष में जोड़े। ध्यान वीं में प्रवेश बेसल वाहिकाओं को संपीड़ित करने के बिना कान पर एक coverslip (0.5 सेमी व्यास) डालई कान। कपास के फाहे का उपयोग करना, क्रम coverslip और कान लक्ष्य जहाजों के बीच की दूरी कम करने के लिए coverslip के नीचे से जितना संभव हो उतना सोडियम क्लोराइड को हटा दें।

5. intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और thrombus दाएं कान को प्रेरित करना

  1. (-;: 510, एल.पी.: 520 एफटी 490 एनएम 450) FITC-dextran दृश्य के लिए intravital प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी समायोजित करें। एक प्रकाश स्रोत के रूप में एक चर 100-W पारा दीपक का उपयोग करें। एक डीवीडी रिकॉर्डर करने के लिए एक उच्च संकल्प, काले और सफेद सीसीडी कैमरा कनेक्ट करें।
  2. intravital प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की मेज पर तय अपहरण कान के साथ हीटिंग थाली युक्त acrylglass पर पशु स्थानांतरित करें।
  3. व्यास में और 400 के एक अग्रगामी रक्त के प्रवाह के साथ 60 सुक्ष्ममापी - - 600 सुक्ष्ममापी / एस 20X आवर्धन (20X / 0.95 संख्यात्मक एपर्चर) और 20% प्रकाश की तीव्रता का उपयोग करना, एक शिरापरक पोत के लिए खोज 50।
  4. 63x magnificatio का पानी विसर्जन के लिए coverslip करने के लिए कमरे के तापमान पानी की एक बूंद जोड़ेंn उद्देश्य (63X / 0.95 संख्यात्मक एपर्चर)। एक 1 मिमी व्यास प्रवेशनी के साथ एक सिरिंज का प्रयोग करें और माइक्रोस्कोप के उद्देश्य पर ड्रॉप जगह। सिर्फ पर्याप्त पानी coverslip और पानी की बूंद के साथ उद्देश्य संपर्क करने के लिए जोड़ें।
  5. इसके तत्काल बाद पानी की बूंद के आवेदन के बाद, व्यास और रक्त के प्रवाह के ऑफ़लाइन माप के लिए 20% प्रकाश की तीव्रता के साथ 20 s के लिए पोत रिकॉर्डिंग शुरू।
  6. FITC-dextran के इंजेक्शन के बाद थक्का प्रेरण शुरू 5 मिनट। इस प्रयोजन के लिए 100% करने के लिए प्रकाश की तीव्रता बढ़ाने के।
  7. thrombus प्रेरण के दौरान रक्त प्रवाह की जाँच करने के 30 रों अवधि के भीतर 2 s के लिए माइक्रोस्कोप के एपर्चर बंद कर दें। रक्त का प्रवाह बने के मामले में, फिर एपर्चर खोलें। बंद कर दिया रक्त के प्रवाह के मामले में, 30 s के लिए पोत निरीक्षण।
    नोट: पोत प्रवाह 30 s या अधिक के लिए या यदि रक्त प्रतिगमनपूर्वक बहती है अभी भी खड़ा है, तो के रूप में occluded में वर्गीकृत है। orthograde रक्त का प्रवाह फिर से शुरू होता है, तो पूरी तरह से एपर्चर और contin खोलने ue पोत रोड़ा जब तक thrombus प्रेरण जैसा कि ऊपर वर्णित होता है। जल्दी thrombus प्रेरण के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि बार जब एपर्चर रक्त के प्रवाह की जांच करने के आदेश बंद हो गया लगभग निरंतर एपि रोशनी बनाए रखने के लिए संभव के रूप में कम कर रहे हैं। बाद में, thrombus विकास के दौरान, पोत कम फ्लोरोसेंट डाई के साथ भरकर रखा जाता है, तो यह लगातार मनाया जा सकता है।
  8. का चयन करें और कान प्रति 5 वाहिकाओं ढंक लेते हैं। FITC-dextran के इंजेक्शन के बाद लगभग 1 घंटे के लिए खुर्दबीन के नीचे thrombus प्रेरण के समय को सीमित करें।

6. फ़ॉलो-अप क्रियाएँ

  1. गर्दन ट्रांसक्यूटेनस polypropylene 6/0 टांके का उपयोग करने का एक घाव बंद निष्पादित करें।
  2. संज्ञाहरण से वसूली के दौरान, पिंजरे में वापस माउस रख दिया और अवरक्त प्रकाश का उपयोग कर पशु गर्म।
  3. सॉफ्टवेयर वाहिकाओं और रक्त के प्रवाह के वेग के व्यास की माप की अनुमति के लिए डीवीडी रिकॉर्डर से दर्ज डेटा स्थानांतरित करें।
_title "> 7। बाएं कान की परीक्षा

  1. पशु की वसूली और 48 घंटे के लिए सभी इंजेक्शन FITC-dextran को खत्म करते हैं।
  2. चरणों ऊपर वर्णित है, इस समय सही गले की नस और बाएं कान की तैयारी को पुनः चलाएं।

8. ऊतक Asservation

  1. बाएं कान के intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद, नमूना 0.5 एमएल आंख की पश्चनेत्रगोलकीय नस जाल से खून का एक गिलास केशिका का उपयोग कर। ध्यान से, पंगा लेना आंदोलनों के साथ भीतरी नेत्रच्छद कोण घुसना तक शिरापरक रक्त केशिका के माध्यम से बहती है। एक ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) रक्त ट्यूब में जांच इकट्ठा।
  2. रक्त नमूना लेने के बाद, पूंछ नस में 500 मिलीग्राम / किग्रा BW ketamine इंजेक्शन लगाने के द्वारा पशु का बलिदान।
  3. की ल्यूकोसाइट्स, एरिथ्रोसाइट्स, thrombocytes, हीमोग्लोबिन, और हेमाटोक्रिट एक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक रुधिर विश्लेषक का उपयोग करते हुए रक्त कोशिकाओं की गणना करें।
  4. 10 मीटर के लिए 2500 XG पर और कमरे के तापमान पर शेष EDTA रक्त अपकेंद्रित्रमें। पिपेट और आगे की जांच के लिए रक्त प्लाज्मा फ्रीज।
  5. कैंची का प्रयोग, अलिंद में कटौती करने और ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के लिए 4% formaldehyde में उन्हें ठीक।

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Representative Results

Thrombogenesis पर Cannabinoid उपचार के प्रभाव

FITC-dextran के 0.05 एमएल के इंजेक्शन पर, phototoxic thrombus प्रेरण (आंकड़े 2 और 3)। एक endothelial घाव और एक पार्श्विका प्लेटलेट प्लग का निर्माण होता है वर्तमान अध्ययन में, कैनाबिनोइड के आईपी इंजेक्शन (5 मिलीग्राम / किग्रा BW) या वाहन के बाद थक्का प्रेरण सभी venules में एक थ्रोम्बोटिक पोत रोड़ा के परिणामस्वरूप (चित्रा 4)। वाहन का इलाज पशुओं में, thrombus गठन के लिए समय 430 है (:;: 637 रों 75 वें प्रतिशतक 330 25 वें शतमक) था। न तो cannabidiol (सीबीडी) और न ही WIN55,212-2 (विन) प्रशासन पोत रोड़ा बार पर एक प्रासंगिक प्रभाव दिखाया। 240: हालांकि, अन्तर्जात केनाबिनोइड एनंदएमाइड काफी समय thrombus गठन और 270 रों को थ्रोम्बोटिक पोत रोड़ा के लिए आवश्यक (25 वें प्रतिशतक कमरों; 75 वें प्रतिशतक: 360 रों, पी <0.05 वाहन की तुलना में)।

चाहे एनंदएमाइड के हाइड्रोलिसिस और उसके उत्पाद के बाद साइक्लोऑक्सीजिनेज पर निर्भर रूपांतरण, arachidonic एसिड, एनंदएमाइड द्वारा thrombus गठन में शामिल है परीक्षण करने के लिए, unspecific साइक्लोऑक्सीजिनेज अवरोध करनेवाला इंडोमिथैसिन प्रयोगों का एक और सेट में एनंदएमाइड (चित्रा 5) के साथ संयुक्त किया गया था। फिर, FITC-dextran, एनंदएमाइड (10 मिलीग्राम / किग्रा BW) के 0.1 एमएल के इंजेक्शन पर वाहन (पी <0.05 वाहन बनाम) की तुलना में thrombus गठन समय कम,। जबकि इंडोमिथैसिन उपचार अकेले venular रोड़ा समय पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, एनंदएमाइड का इलाज पशुओं में साइक्लोऑक्सीजिनेज निषेध काफी लंबे समय तक thrombus 300 रों (25 वें प्रतिशतक: 240 रों; 75 वें प्रतिशतक: 420 रों) के गठन, 160 रों की औसत की तुलना में (25 वें प्रतिशतक: 100 रों; 75 वें प्रतिशतक: 200 रों) एनंदएमाइड tre के बाद atment केवल (पी <बनाम एनंदएमाइड 0.05)। वाहन उपचार और इंडोमिथैसिन / एनंदएमाइड सह प्रशासन के बाद पोत रोड़ा बार काफी 2 अलग नहीं था।

आकृति 1
चित्र 1 intravital माइक्रोस्कोपी के लिए गले की नस (ए) और प्लेसमेंट कान की (बी) तैयार करना। (ए) आपरेशन stereomicroscope का प्रयोग, सही गले की नस तैयार किया जाता है। बाएं कान की नियुक्ति के लिए टांके FITC-dextran के इंजेक्शन से पहले सिले रहे हैं। बाईं गले की नस की पूर्व विच्छेदन से घाव ट्रांसक्यूटेनस टांके (बी) के साथ बंद कर दिया है। बाएं कान polypropylene 7/0 टांके के साथ तय हो गई है। एक coverslip ध्यान से कान के बेसल वाहिकाओं को संपीड़ित करने के बिना रखा गया है। एक हीटिंग थाली पूरे प्रयोग के दौरान पशु के शरीर का तापमान बनाए रखता है।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 55,174 / 55174fig1large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. intravital माइक्रोस्कोपी और thrombus प्रेरण। एक ही venule से पहले 10X, 20X में (ए) और के बाद (बी) thrombus प्रेरण, और 63x बढ़ाई (बाएं से दाएं) दिखाया गया है। रक्त प्लाज्मा fluorescein आइसोथियोसाइनेट लेबल dextran (FITC-dextran, 5%) की 0.05 एमएल के साथ दाग है। thrombus * के साथ चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3. Venular thrombus प्रेरण। एक ही venule befor दिखाया गया हैई (ए) 100 रों (बी) के बाद, और intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से, एपि रोशनी के 300 रों (सी) के बाद। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों नीले प्रकाश एपि रोशनी द्वारा उत्पन्न कर रहे - FITC-dextran की (450 490 एनएम) और अन्तःचूचुक ख़राब। इस प्रकार, प्लेटलेट्स सक्रिय और पूर्ण थ्रोम्बोटिक पोत रोड़ा (सी) में उजागर subendothelial संरचनाओं का पालन, प्राथमिक पार्श्विका thrombus गठन (बी) और, बाद में, जिसके परिणामस्वरूप कर रहे हैं। यह आंकड़ा Grambow 3 से संशोधित किया गया है। thrombus * के साथ चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. फ़्लो चार्ट प्रायोगिक प्रोटोकॉल दिखाना। </ संबंधित cannabinoid (5/10 मिलीग्राम / किग्रा BW) के आईपी इंजेक्शन द्वारा strong> Cannabinoid उपचार IVM से पहले 30 मिनट के लिए और 0. दिन पर सही कान IVM 1 घंटे तक ही सीमित था में thrombus गठन की प्रेरण प्रदर्शन किया था। 47 घंटे बाद, 2 दिन, एक ही प्रोटोकॉल माउस के बाएं कान के लिए रक्त के नमूने से पहले लागू किया गया था। यह आंकड़ा Grambow 3 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5. Venular thrombus एकल Cannabinoid उपचार और साइक्लोऑक्सीजिनेज निषेध के बाद गठन। प्रकाश / डाई thrombus प्रेरण के दौर से गुजर चूहों में venules का रोड़ा बार। (ए) पशु DMSO युक्त वाहन (VEH) के साथ इलाज या गया कैनाबिनोइड एनंदएमाइड साथ (AEA), WIN55,212-2 (विन), या cannabidiol (सीबीडी) (5 मिलीग्राम / किग्रा BW, एन = 5)। 5% FITC-dextran के 0.05 एमएल iv इंजेक्ट किया गया था थक्का प्रेरण से पहले। एक और की स्थापना में, 0.1 5% की एमएल FITC-dextran (बी) एनंदएमाइड (10 मिलीग्राम / किग्रा BW) इंडोमिथैसिन (इंडो) (5 मिलीग्राम / किग्रा BW) के साथ संयुक्त किया गया था द्वारा thrombus गठन पर साइक्लोऑक्सीजिनेज पर निर्भर उत्पादों के प्रभाव का आकलन करने के लिए एनंदएमाइड (एन = 5)। रैंकों पर Kruskal वालिस एक तरह से एनोवा डन पद अनौपचारिक विश्लेषण (ए और बी) के द्वारा मिली। मूल्यों मंझला और IQR (5 वें, 25 वें, 75 वें, और 95 वें शतमक) के रूप में दिया जाता है। * पी <0.05 वाहन बनाम, # पी <0.05 एनंदएमाइड बनाम, § पी <0.05 इंडोमिथैसिन बनाम। यह आंकड़ा Grambow 3 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वहाँ SKH1 घंटे का घंटा चूहों के कान के सिरे में सफल thrombus शामिल करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। समस्या निवारण के लिए, प्रोटोकॉल के संबंधित चरणों कोष्टक में दर्शाया गया है।

6 सप्ताह और एपिडर्मिस की कम cornification साथ - परीक्षा की स्थिति 4 साल की उम्र में युवा पशुओं में भी आदर्श हैं। बड़े जानवरों में, जहाजों के दृश्य की गुणवत्ता त्वचा की सतह और लक्ष्य वाहिकाओं (कदम 1.1) के बीच उच्च दूरी की वजह से भी बदतर और कम तुलनीय है।

परीक्षा के क्षेत्र में FITC-dextran की परिस्त्राव रोकने के लिए, फिक्सिंग टांके संभव के रूप में मामूली रखा जाना चाहिए। टांके के लिए निकटता में, फ्लोरोसेंट डाई बहना और extravascular अंतरिक्ष और जहाजों के बीच इसके विपरीत कम कर सकते हैं। डाई के इस तरल पदार्थ का स्त्राव धीरे-धीरे प्रगति करता है। टांके सिले रहे हैं, तो के रूप में FITC-dextran के इंजेक्शन, अच्छा करने से पहले 15 मिनट के ऊपर उल्लेख कियाintravital माइक्रोस्कोपी की परीक्षा की स्थिति (कदम 2.8) यह सुनिश्चित किया जाता है।

FITC-dextran धीरे renally निकाल दिया जाता है। उच्च आणविक dextran (150 केडीए) के साथ फ्लोरोसेंट डाई के संयोजन परिस्त्राव और उत्सर्जन में देर। वर्तमान अध्ययन में, माइक्रोस्कोपी और थक्का शामिल करने के लिए समय thrombus गठन समय पर उत्सर्जन और कम फ्लोरोसेंट डाई प्लाज्मा सांद्रता के प्रभाव को रोकने के लिए 1 घंटे तक ही सीमित था।

सीरिंज भरने जबकि, कोई हवाई बुलबुले इंजेक्शन के लिए रहना चाहिए, क्योंकि यहां तक ​​कि छोटे iv प्रशासित सिरिंज में हवा के बुलबुले जानवर (कदम 2.5) के लिए घातक हो सकता है। जब iv इंजेक्शन के बाद गले की नस से बाहर सिरिंज खींच, नियमित रूप से खून बह रहा है (कदम 2.6) से होता है। रक्त या FITC-dextran के साथ बाद में जांच की कान का संदूषण intravital माइक्रोस्कोपी काफी मुश्किल या भी असंभव बना देता है। इस प्रकार, contralateral कान और गले की नस की तैयारी की सिफारिश की है।

coverslip ध्यान से लागू किया जाना चाहिए, किसी भी अतिरिक्त दबाव (कदम 4.5) के बिना। अन्यथा, पूरे कान में रक्त के प्रवाह को बेसल वाहिकाओं के संपीड़न, जो थक्का प्रेरण दौरान रोड़ा बार कम हो सकता है की वजह से धीमी कर दी है। की सटीक प्लेसमेंटcoverslip stereomicroscope साथ सत्यापित किया जा सकता। venules विशेष रूप से coverslip के किनारों पर, लगातार भरा जाना है। coverslip intravital प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के उद्देश्य से पानी की बूंद के संपर्क की गारंटी करने के लिए इस्तेमाल किया जा चाहिए। विसर्जन के क्रम 100% प्रकाश की तीव्रता के साथ पोत के एपि रोशनी को आश्वस्त करने में पूरे thrombus प्रेरण के दौरान प्राप्त किया जाना है। सबसे अच्छा तरीका है पानी की बूंद के स्थिर स्थान प्राप्त करने coverslip का उपयोग करके। moisturized पारदर्शी प्लास्टिक रैप पर या सीधे त्वचा पर ड्रॉप लाना पानी और अस्थिर विसर्जन की नाली का कारण बनता है।

महत्व और हेयरलैस SKH1 घंटे का घंटा की earlobe माउस की सीमाएं

SKH1 घंटे का घंटा गंजा माउस, कान के सिरे में जहाजों intravital माइक्रोस्कोपी 2, 4 का उपयोग करने का प्रत्यक्ष कार्यात्मक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है 2 की शारीरिक रचना जैसा दिखता है। पूरे microvascular नेटवर्क, व्यास में 100 सुक्ष्ममापी अप करने के लिए venules, धमनियों, और केशिकाओं से मिलकर, कल्पना और वास्तविक समय में जांच की जा सकती। यह गंजा चूहों के कान घाव भरने 6, 7, अक्षीय पैटर्न फ्लैप 2, 5, macromolecular रिसाव 5, और microvascular thrombus गठन 8, 9, 10 के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाता है। व्यास में 100 सुक्ष्ममापी अप करने के लिए जहाजों की उपलब्धता मॉडल की एक सीमा होती है। कतरनी तनाव, रक्त प्रवाह, और पोत वास्तुकला छोटे और बड़े जहाजों में मतभेद है। इसलिए, मन्या धमनी या ऊरु वाहिकाओं जैसे मॉडल macrovascular thrombus गठन पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है।

इस तरह के हैम्स्टर 11 के गाल के रूप में microcirculation के intravital दृश्य के सभी वैकल्पिक मॉडल,, माउस, 13, 12 या चूहा 9 की cremaster मांसपेशियों के पृष्ठीय skinfold कक्ष, 10 शल्य तैयारी की आवश्यकता है। गंजा माउस के कान के जहाजों सर्जरी द्वारा ऊतकों को नुकसान के किसी भी जोखिम के बिना सुलभ हैं, इसलिए वहाँ गंजा माउस 14 के कान के सिरे में सूजन, वाहिकासंकीर्णन, और hemostasis की सक्रियता से माप मानकों के आधार पर कोई असर नहीं पड़ता है। भले ही कोई शल्य तैयारी के लिए आवश्यक है, छवि संकल्प और स्पष्टता अन्य मॉडलों (जैसे, पृष्ठीय skinfold चैम्बर और cremaster तैयारी) के बराबर है। आदेश में एक उच्च इमेजिंग गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल अच्छी तरह से टी के कम cornification साथ युवा चूहों पालन किया जाना चाहिए, औरवह प्रयोग किया जाना है डर्मिस।

उनके सतही स्थानीयकरण के कारण, कान के जहाजों आसानी से intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अध्ययन किया जा सकता। वे पोत व्यास के अपने समायोजन के माध्यम से पशु में तापमान नियंत्रण सक्षम करें। इसलिए, दोनों कमरे और शरीर का तापमान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के मानकीकृत किया जाना है। सभी earlobe वाहिकाओं त्वचीय ऊतक में परिधीय वाहिकाओं प्रतिनिधित्व करते हैं। केंद्रीय जहाजों की तुलना में, परिधीय वाहिकाओं विभिन्न ऊतकीय संरचनाओं और रिसेप्टर अभिव्यक्ति की विशेषता है। इसलिए, अन्य मॉडलों (जैसे, mesenteric venules और धमनियों की तैयारी) केंद्रीय वाहिकाओं के विषय में विशिष्ट मुद्दों की परीक्षा के लिए अधिक उचित हो सकता है।

वर्णित मॉडल की एक और सीमा गंजा SKH1 घंटे का घंटा चूहों, जो अन्य माउस उपभेदों के रूप में के रूप में आम नहीं हैं का उपयोग कर के साथ जुड़े प्रतिबंध नहीं है। इसलिए, ट्रांसजेनिक गंजा चूहों प्रजनन श्रम किया जा सकता हैशुभ और महंगा। रासायनिक और यांत्रिक बालों को हटाने स्थानीय सूजन पैदा कर सकता और बालों की जड़ों, जो दृश्य गुणवत्ता ख़राब हो सकता है नहीं निकालता है। के रूप में अच्छा दृश्य गुणवत्ता और सतह और लक्ष्य पोत के बीच कम दूरी विश्वसनीय thrombus शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है; अन्य मॉडलों (जैसे, पृष्ठीय skinfold कक्ष) माउस के अध्ययन है कि फर के साथ कुछ माउस उपभेदों की आवश्यकता के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। दूसरी ओर, कान के सिरे मॉडल विभिन्न रोग की स्थिति के अनुकरण के लिए सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, गंभीर रूप से भरकर रखा ऊतकों में microcirculation तीन न्यूरोवैस्कुलर बंडलों 15 में से दो के संयुक्ताक्षर के बाद जांच की जा सकती। घाव भरने के दौरान microcirculation के विश्लेषण से गंजा माउस मॉडल 16 के कान के उपयोग के लिए एक और उपयुक्त उदाहरण है।

कुछ प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए, यह Asse के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही पशु की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हैएस एस एक उपचार के समय अनुक्रम। हाल ही में प्रकाशित प्रयोगात्मक अध्ययन में, छोड़ दिया कान में थक्का प्रेरण दाएं कान 3 की पूर्व उपचार उसमें कोई परिवर्तन न किया गया था। इसलिए, मॉडल का एक और लाभ यह है दो अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही माउस के प्रत्येक कान में थक्का प्रेरण की संभावना है। पशु संरक्षण के संबंध में, प्रयोगात्मक प्रक्रिया जानवरों के लिए न्यूनतम इनवेसिव है, और चूहों की सर्जरी से उबरने या प्रयोगों के बीच एक पृष्ठीय skinfold कक्ष ले जाने के लिए नहीं है। हर जानवर में, कान प्रति कम से कम पांच उचित वाहिकाओं phototoxic thrombus प्रेरण द्वारा occluded जा सकता है, इतना डेटा जानवरों की एक छोटी संख्या के साथ एकत्र किया जा सकता।

महत्व और intravital माइक्रोस्कोपी और thrombus प्रेरण की सीमाएं

Intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वास्तविक समय 5 में microcirculation के दृश्य की अनुमति देता है। iv प्रशासन, FITC-DEXTRA के बादn रक्त प्लाज्मा दाग। यह पूरा पोत रोड़ा जब तक प्रेरण की शुरुआत से thrombus विकास के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है। सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं विपरीत माध्यम में अंतराल के रूप में पहचाना जा सकता है। आगे की जांच (जैसे, granulocyte-अन्तःचूचुक बातचीत) के लिए, सफेद रक्त कोशिकाओं rhodamin-6G के साथ दाग जा सकता है।

प्रयोग की रिकॉर्डिंग और ऑफ़लाइन विश्लेषण लाल रक्त कोशिका वेग, arteriolar vasomotion, केशिका घनत्व, और microvascular व्यास की इन विवो माप सक्षम बनाता है। ये पैरामीटर thrombus गठन, फ्लैप छिड़काव, और घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा अवलोकन सीधे और लगातार प्रयोग 5 के दौरान इन गतिशील छिड़काव मानकों और उनके परिवर्तन यों कर सकते हैं। अन्य तकनीकों, क्सीनन वार्शआउट, ऊतक ऑक्सीजन का स्तर, लेजर डॉपलर, या डाई प्रसार की तरह, यह भी कम आक्रामक हैं, लेकिन वे टी द्वारा प्रतिबंधित कर रहेवह रक्त के प्रवाह के अप्रत्यक्ष माप। इस प्रयोग के परिणाम की वैधता को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, प्रत्यक्ष तरीकों पसंद किया जाता है।

फ्लोरोसेंट डाई की प्रतिक्रिया और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की रिहाई में एक निश्चित तरंग दैर्ध्य परिणाम है, जो स्थानीय स्तर पर अन्तःचूचुक 17 नुकसान की रोशनी। धाराप्रवाह रक्त कणों की प्रदर्शनी समय 1,000x कम जब अन्तःचूचुक की तुलना में है। इसलिए, thrombogenic प्रभाव एक phototoxic endothelial घाव की वजह से प्राथमिक है और प्रत्यक्ष phototoxic प्लेटलेट सक्रियण 18 की वजह से नहीं। प्लेटलेट्स उजागर subendothelial मैट्रिक्स के लिए संपर्क के माध्यम से ही सक्रिय है और एक प्लेटलेट प्लग 19 (चित्रा 3) के रूप में कर रहे हैं। thrombogenesis के इस तंत्र में इस तरह के अस्थिर एनजाइना और संवहनी सम्मिलन के रूप में कई स्थितियों में एक उत्कृष्ट भूमिका निभाता है।

लाइट / डाई thrombus प्रेरण alt तुलना में कम आक्रामक हैबैलून कैथेटर 20, विद्युत प्रवाह 21, लेजर 22, या सूजन 19 के माध्यम से endothelial घावों बनाने की ernative तरीकों। प्रकाश / डाई के साथ thrombus प्रेरण भी उद्देश्य के प्रकाश किरण में सख्ती से स्थानीय स्तर पर कार्य करता है। इसलिए, पड़ोसी वाहिकाओं सीधे प्रभावित नहीं होते हैं और बाद में थक्का शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। लाइट / डाई thrombus प्रेरण दोनों venules और धमनियों में किया जा सकता। वर्तमान अध्ययन में, विशेष रूप से venules इलाज किया गया है क्योंकि धमनियों की एपि रोशनी vasospasm पैदा कर सकता है, रोड़ा बार 19 को प्रभावित कर सकता है।

संज्ञाहरण xylazine और ketamine, जो पशु चिकित्सा और प्रायोगिक चिकित्सा में स्थापित किया गया है संयोजन का उपयोग किया गया था। दवाओं आईपी इंजेक्शन थे। उपरोक्त खुराक के साथ, 30 मिनट और के लिए 1.5 सोने के लिए सर्जरी सहिष्णुता के साथ पर्याप्त संज्ञाहरण - 2 घंटे हासिल की थी।

गंजा SKH1 घंटे का घंटा माउस के कान में अच्छी तरह से घाव भरने और फ्लैप अनुसंधान के क्षेत्र में स्थापित है। कई अध्ययनों से thrombus प्रेरण और थ्रोम्बोलिसिस 3, 23, 24, 25, 26 के लिए सफलतापूर्वक मॉडल का इस्तेमाल किया है। प्रोटोकॉल ठीक से किया जाता है, तो गंजा SKH1 घंटे का घंटा माउस के कान के सिरे में intravital माइक्रोस्कोपी microcirculation और thrombus गठन के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय, आसान है, और प्रभावी उपकरण है। यह विभिन्न रोग की स्थिति अनुकरण करने के लिए सरल है, जबकि मॉडल विवो में microcirculation के महत्वपूर्ण मापदंडों का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों कोई स्वीकृतियां की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SKH-1/hr mice Charles River 477 can be purchased from other vendors 
standard laboratory food ssniff Spezialdiaeten V1594-0  can be purchased from other vendors 
operation stereomicroscope Leica  M651/M655  can be purchased from other vendors 
intravital microscope Zeiss Axiotech Vario 100  can be purchased from other vendors 
objective (20X/0.95)  Zeiss 20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR  can be purchased from other vendors 
objective (63X/0.95) Zeiss 63x/0,95 W; ACHROPLAN  can be purchased from other vendors 
black and white CCD-camera  Pieper  FK 6990 IQ-S  can be purchased from other vendors 
DVD-recorder Panasonic DMR-EX99V  can be purchased from other vendors 
sodium chloride Braun 5/12612055/1011 can be purchased from other vendors 
Ketamine 10% Bela pharm F3901-6 can be purchased from other vendors 
Xylazine 2% Bayer 6293841.00.00 can be purchased from other vendors 
FITC-dextran 5% Sigma  46945-100MG-F can be purchased from other vendors 
dexapanthenol 5% eye ointment Bayer 6029009.00.00 can be purchased from other vendors 
formaldehyde 4% Sigma HT501128-4L can be purchased from other vendors 
DMSO Sigma 472301 can be purchased from other vendors 
coverslips 5 x 5 x 1 mm Menzel L4339 can be purchased from other vendors 
Adhesive strips Leukosilk 4683400 can be purchased from other vendors 
centrifuge Beckman Coulter CLGS 15 can be purchased from other vendors 
hematology analyzer Sysmex KX-21 A6980 can be purchased from other vendors 
EDTA-blood tube Sarstedt 201,341 can be purchased from other vendors 
cotton swabs Sanyo 604-A-1 can be purchased from other vendors 
infrared light Beurer 5/13855 can be purchased from other vendors 
single use synringe Braun  2020-08 can be purchased from other vendors 
insulin syringe Braun 9161502 can be purchased from other vendors 
disposable hypodermic needles Braun 465 7640 can be purchased from other vendors 
end-to-end capillary Sarstedt 19,447 can be purchased from other vendors 
heating plate Klaus Effenberg OP-T 185/03 can be purchased from other vendors 
scissors 14.5 cm Aesculap BC259R can be purchased from other vendors 
needle Holder Aesculap BM081R can be purchased from other vendors 
microforceps Aesculap BD331R can be purchased from other vendors 
microscissors Aesculap OC496R can be purchased from other vendors 
scalpel 21 Dahlhausen 11.000.00.511 can be purchased from other vendors 
Prolene 7-0 Ethicon XNEH7470 can be purchased from other vendors 
Prolene 6-0 Ethicon XN8706.P33 can be purchased from other vendors 
electrocautery Servoprax H40140 can be purchased from other vendors 
acrylglass pad integrated heating, 0.5 cm high plane

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Intravital माइक्रोस्कोपी और एक हेयरलैस माउस के कान के सिरे में thrombus प्रेरण
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Strüder, D., Grambow, E., Klar, E., Mlynski, R., Vollmar, B. Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse. J. Vis. Exp. (122), e55174, doi:10.3791/55174 (2017).

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