Summary
هنا نقدم بروتوكول لخلايا صورة تعبر عن الأخضر الفلورسنت نوع أنجيوتنسين مستقبلات 1A الموسومة البروتين خلال الإلتقام التي بدأها العلاج أنجيوتنسين الثاني. وتتضمن هذه التقنية الجسيمات الحالة وضع العلامات مع علامة فلوري الثانية، ومن ثم استخدام برنامج لتحليل شارك في توطين مستقبلات ويحلول في ثلاثة أبعاد على مر الزمن.
Abstract
يستخدم التصوير الخلية الحية لالتقاط الصور في وقت واحد في الوقت الفاصل بين مستقبلات الأنجيوتنسين نوع 1A (AT 1A R) ومقصورات داخل الخلايا في الخلايا الجنينية البشرية transfected الكلى 293 (كلوة) بعد التحفيز مع أنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني). و transfected خلايا كلوة عابر مع DNA البلازميد التي تحتوي على AT 1A R ذات الكلمات الدلالية مع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP). يتم تحديد الجسيمات الحالة مع صبغ أحمر فلوري. يتم التقاط الصور الخلية الحية على المجهر متحد البؤر المسح بالليزر بعد التحفيز انج الثاني وتحليلها من قبل البرامج في ثلاثة أبعاد (3D، voxels) مع مرور الوقت. التصوير الخلية الحية يمكن التحقيقات في الاتجار مستقبلات ويتجنب يفند المرتبطة التثبيت، وعلى وجه الخصوص، وفقدان أو النزوح مصطنع من مستقبلات الغشاء EGFP الموسومة. وهكذا، كما يتم تعقب الخلايا الفردية عبر الزمن، وتوطين التحت خلوية من المستقبلات يمكن تصوير وقياس. يجب الحصول على الصور ذلك كافياذ بسرعة لالتقاط الحركة السريعة حويصلة. ومع ذلك، وبسرعة التصوير أسرع، وتخفيض عدد الفوتونات التي تم جمعها. يجب أيضا أن تكون التنازلات في اختيار المعلمات التصوير مثل حجم فوكسل من أجل الحصول على سرعة التصوير. تطبيقات كبيرة من التصوير الخلية الحية هي لدراسة الاتجار البروتين، والهجرة، والانتشار، دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الالتهام الذاتي والبروتين البروتين التفاعل وديناميكية، على سبيل المثال لا الحصر.
Introduction
ويتمثل الهدف العام للحصول على أدلة الكمي في الزمان والمكان من colocalization مستقبلات مع العضيات التحت خلوية محددة بعد العلاج مع ناهض مستقبلات. وهكذا، فإن الهدف المباشر هنا هو لالتقاط الوقت الفاصل بين الصور مبائر من الجسيمات الحالة والغشاء الذي يمتد مستقبلات في خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة) بعد ترنسفكأيشن وبعد ذلك تجميع وتحليل البيانات التصوير في 3D لقياس كمي لتسليم مستقبلات ل الجسيمات المحللة. التحقيق في الاتجار وقت واحد من مستقبلات الغشاء مع الجسيمات الحالة أو العضيات الأخرى خلال الإلتقام عندما تفعيلها من خلال يجند مستقبلات يمكن أن تساعد في تحديد كيفية تنظيم مستقبلات الغشاء في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.
AT 1A يفترض R أن تتحلل في الجسيمات الحالة بعد العلاج مع انج الثاني في أنظمة خلايا نموذج، في المقام الأول HEK293 1 على الرغم من أن غالبية تفصيليتم ترجمة eptors في المقام الأول في الإندوسومات إعادة التدوير عديد الحويصلات لإعادة التدوير في وقت لاحق إلى غشاء البلازما في حين أن الجزء الأكبر من يجند، آنغ الثاني، هو المتدهورة في يحلول 2، 3، 4، 5. وفي الآونة الأخيرة، لي وآخرون. أظهرت باستخدام نقل فورستر للطاقة الرنين (الحنق) وتقنيات مضان المجهر العمر التصوير (FLIM) أن colocalizes AT 1A R (على ~ 10 نانومتر نطاق) مع LAMP1، وهو بروتين غشاء الليزوزومية مما يشير إلى أن ما لا يقل عن بعض من مستقبلات المستهدفة إلى والمتدهورة من الجسيمات الحالة 6. ولاحظ هؤلاء الكتاب أن الكلوروكين الليزوزومية المانع سدت في 1A جمعية R-LAMP1 وهو ما يتسق مع التقارير السابقة تشير إلى أن تأثير الكلوروكين هو لمنع انصهار أواخر الإندوسومات أو autophagosomes مع الجسيمات الحالة. النهج غير المباشرة الأخرى لتحديد AT 1A R لوقد استخدمت ocalization في الجسيمات الحالة bafilomycin، مثبط الليزوزومية أن نستنتج AT جود R 1A في الجسيمات الحالة 3، 4، 5، 6، 7، 8.
التصوير الخلية الحية يتجنب الآثار المحتملة للتثبيت على حجم الخلية، وفقدان / يعتم / إعادة توزيع مستقبلات GFP خيالية. وقد اعتمدت الدراسات السابقة على خلايا ثابتة لتحديد colocalization أو توارد من مستقبلات مع الجسيمات الحالة أو باستخدام الخلايا الحية المسمى مع بدائل ملزمة مستقبلات مثل β arrestin 1، 2، 3، 4، 5، 6. التصوير الخلية الحية من GPCRs أخرى باستخدام متحد البؤر القرص الغزل أو ليزر نقطة المسح أسيوطالمجاهر OCAL مجهزة GaASP أو HYD كشف عن مكنت المحققين لمراقبة داخليا والاتجار بها المستقبلات في الخلايا الفردية تصويرها في زي مداخن في 30 ثانية فترات 9 و 10. ولكن حتى عندما يتم جمع الحية خلية ض مداخن بسرعة، قد تحدث التحليل إلا بعد اختيار طائرة واحدة في كل كومة، أي في 2D 10. في حين أن هذا قد يكون كافيا لدراسة المنضوية النوع من الاختزال أو التيروزين كيناز مستقبلات في مسألة ما، و1A روبية AT تتراكم في الحويصلات التي تغير حجم وموضع على مر الزمن، وبالتالي فهي بطبيعتها أكثر صعوبة لعينة كاف باستخدام شريحة واحدة تمثيلية في كل نقطة زمنية. لتحديد دقيق لمسار المسمى AT 1A R من خلال الخلية وللكشف عن كل من السكان من الحويصلات اختلاف في حجم وموضع، فقد تم تطوير هذا الأسلوب للتصوير 3D وتحليل 3D لتتبع هذه التغييرات وأن يكون تستخدم جنبا إلى جنب مع وضع العلامات من مختلف حجرات داخل الخلايا مثل الجسيمات الحالة.
يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول للتصوير الخلايا الحية لتصور مباشرة حركة AT 1A R في الخلية ونقلها إلى مقصورات التحت خلوية بعد التحفيز انج الثاني. يتم تمييزها المقصورات التحت خلوية مع الوهم بروتين فلوري أو علامات الفلورسنت الأخرى. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم النهج الأول في توطين المستقبلات في العضيات التحت خلوية مع الحد الادنى من القرار 200 نانومتر من أجل مقارنة تحور مقابل من النوع البري مستقبلات أو للكشف عن التغييرات التالية العلاجات الدوائية. هذه التقنية يمكن الوصول إليها نظرا لأنه يمكن القيام بها في أي المجهر متحد البؤر مجهزة للتصوير الخلايا الحية. السهولة النسبية لهذا النهج يتناقض مع زيادة الخبرة والمعدات اللازمة لتنفيذ الحنق FLIM تقنيات / / BRET الذي كشف عن التفاعلات الجزيئية 6،"XREF"> 11. هذه القياسات تحدد تفاعلات البروتين البروتين بدقة عالية (~ 10 نانومتر) ويستدل توطين داخل عضيات التحت خلوية. وتستخدم هذه التقنيات المتقدمة لمتابعة وزيادة تحديد التفاعلات الجزيئية المصالح، بدلا من المرور من المستقبلات من خلال المقصورات التحت خلوية، وأنها تظهر مباشرة تفاعلات البروتين البروتين في أوقات وأماكن محددة داخل الخلية 11. FLIM، وهي تقنية الحنق مستقلة التركيز متقبل، وغالبا ما تجرى على عينات ثابتة منذ الحصول على الصور أبطأ. في المقابل، يوفر نسبة الحنق التصوير السريع وقرار colocalization عالية من البروتينات التفاعل. العيب من نسبة الحنق هو أن التصوير يستخدم widefield برنامج التحصين الموسع ومضان للحصول على سرعة التصوير وتشمل الخلية بأكملها، مما أدى إلى انخفاض القرار، وعلى النقيض من العضيات 12. نقل تلألؤ بيولوجي الطاقة الرنين (BRET) هو آخرتقنية المتقدمة التي تم تطبيقها على GPCRs لقياس اكتساب القرب الجزيئي على مر الزمن 11. في هذه التقنية يتم تقسيم fluorophore البروتين جزيئيا ويرتبط كل منهما نصف إلى واحد من اثنين من البروتينات في السؤال. عندما اثنين من البروتينات من ربط الفائدة بعضها البعض، وأجزاء من العلامة خيالية تعيد تجميع للحصول على مضان وزيادة مضان كميا مع مرور الوقت.
هنا، نقدم تقنية واضحة للتصوير الخلايا الحية إلى جانب الكمي الصورة لدراسة الاتجار AT 1A R في الخلية على التحفيز انج الثاني وتغيير محتمل في تسليم المنضوية AT 1A R لالجسيمات الحالة التالية انج الثاني التحفيز. الاستخدام النهائي لهذه التقنية هو لوصف الاختلافات في الاتجار غشاء مقارنة نوع البرية ومستقبلات تحور. وهذه الاختلافات تساعد على تحديد آلية (ق) التي تؤثر الأنشطة الفسيولوجية للAT 1A R leadiنانوغرام لتنظيم ضغط الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اليوم الأول
البذر 1. خلية
- إعداد كاملة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM). إضافة 50 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين، 5 مل من L-الجلوتامين إلى 450 مل من DMEM لجعل 500 مل من DMEM كاملة تستكمل مع مصل بقري جنيني (10٪)، البنسلين / الستربتومايسين (1٪) ولام الجلوتامين (1٪).
- الكلى الجنينية (كلوة) الخلايا البشرية البذور، وعدد مرور 6-11 في 50000 / جيد في نظام ساترة غرف جيدا 8 في كامل DMEM.
- الحفاظ على الشريحة غرف عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
اليوم الثاني
2. الحويصلية ترنسفكأيشن
- جعل الطازجة في البلازميد والحويصلية حلول 1A R-GFP باستخدام ظروف معقمة مع حكومة مستوى السلامة الحيوية 2.
- تمييع 2 ميكرولتر من البلازميد في 900 نانوغرام / ميكرولتر حل الأسهم في 178 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل لتحقيق ويركزأيون من البلازميد ما يقرب من 10 نانوغرام / ميكرولتر.
- تمييع 4.5 ميكرولتر من محلول المخزون الحويصلية في 175.5 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل لإنشاء 01:40 التخفيف من الأسهم.
- إضافة حل الحويصلية إلى حل البلازميد ومزيج من قبل باستخدام pipettor 1 مل إلى ماصة صعودا وهبوطا من 20 مرات لخلط الحل ترنسفكأيشن.
- احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25-27 درجة مئوية).
- في حين أن هذا الخليط ويحتضنها، وإزالة وسائل الإعلام ببطء مع مل pipettor 1 وإضافة ببطء 400 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي هي قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
- إزالة بلطف PBS واستبدالها مع 200 ميكرولتر / بئر تخفيض وسائل الاعلام المصل قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: كن حذرا في جميع الخطوات عند غسل الخلايا لتجنب مفرزة من الخلايا من ساترة بسبب الإجهاد الهائل الناجم من قبل pipetting. - الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- مرة واحدة فيفترة حضانة المرض انتهت، إضافة 80 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 4،0-4،5 ساعة ولكن ليس أكثر من 5 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
- بعد فترة ترنسفكأيشن اكتمال الحضانة، وإزالة ببطء وسائل الإعلام من الدوائر باستخدام 1 مل pipettor واستبدال بلطف مع 300 ميكرولتر / بئر الكامل DMEM واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 .
اليوم الثالث
3. مصل المجاعة
- إزالة وسائل الإعلام بلطف باستخدام 1 مل pipettor واستبدال ببطء مع 300 ميكرولتر من DMEM المصل خالية بدون أحمر الفينول.
- الحفاظ على غرفة في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 10-12 ساعة.
اليوم الرابع
4. لايف التصوير خلية
- المقصورات داخل الخلايا وصمة عار (الجسيمات الحالة في هذه الحالة).
- أبوالتحرير 30 دقيقة قبل التصوير الجسيمات الحالة في الخلايا، إضافة 22.5 ميكرولتر من الفلورسنت حل الأسهم صبغ 1 ميكرومتر (0.5 ميكرولتر من 1 ملم صبغة الفلورسنت مخففة في 499.5 ميكرولتر من DMEM المصل خالية بدون أحمر الفينول) إلى كل بئر لتركيز الصبغة النهائية 75 نانومتر.
- احتضان لمدة 25-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 ثم إزالة بلطف الصبغة وإضافة 300 ميكرولتر من DMEM المصل خالية جديدة دون الفينول الأحمر ببطء.
- إعداد المجهر للتصوير.
- ضبط المرحلة أسفل لتجنب الأضرار التي لحقت العدسة أثناء بدء التشغيل من المجهر الآلي.
- بدوره على السلطة المجهر، والطاقة الماسح الضوئي، قوة الليزر ومن ثم انبعاث الليزر، وأخيرا مصباح معدن هاليد لالملاحظة البصرية (انظر تعليمات الشركة المجهر مبائر).
- فتح برنامج حاسوبي التصوير وفي مطلع البرامج على الأرجون (488 نانومتر) الليزر وقوة تصل إلى 30-50٪. ملاحظة قوة تعتمد علىسن الليزر. ضمن التجارب لا بد من الحفاظ على إعدادات ثابتة.
- بدوره على الليزر الباعثة للأحمر (على سبيل المثال 568 نانومتر أو 594 نانومتر).
- شكل التصوير مجموعة إلى عمق 12 بت.
- تعيين الثقب لنانومتر خط ليزر الأرجون 488 و 568 نانومتر للأو 594 نانومتر ليزر ل1 وحدة القرص إيري. إذا كان GFP قاتمة جدا، استخدم وضع 2 وحدة القرص إيري، ولكن تتناسب مع قنوات مناسب.
- عند استخدام مجموعات فلتر مزدوج اللون، حدد انبعاث موجات المناسبة لGFP وصبغة الفلورسنت. أو، تعيين الطول الموجي الانبعاثات (إم) في 499-580 نانومتر لGFP وإم 599-680 نانومتر لصبغة الفلورسنت التي تنبعث منها الأحمر.
- تأكد من أن تنزف من خلال والتقاطع لا تحدث. إيقاف كل ليزر بدورها وتحقق من كل القنوات الانبعاثات لكل منها. عندما ليزر الأرجون هو خارج، وينبغي أن يكون انبعاث الأخضر الصفر. عندما الليزر الباعثة الأخضر هو خارج، يجب أن تكون قناة الانبعاثات الحمراء الصفر.
ملاحظة: أسلم طريقة لصورة كل في مسارات منفصلة (sequential). - تشمل قناة brightfield إذا رغبت في ذلك. تجنب التصوير النقيض التفاضلية (DIC) لأنه يمكن أن تحرف القياسات colocalization.
- للتصوير الحية، حدد متتابعة خط بدلا من إطار تسلسلي.
- حدد الخلايا للتصوير.
- الاستفادة من هدف 1.4 الفتحة العددية (NA)، مثل هدف 63X / 1.4 NA النفط إلى خلايا صورة (أو 40X / 1.4 NA). توسيط الهدف وإضافة قطرة من اللزوجة العالية، وانخفاض النفط تألق ذاتي الغمر على الهدف.
- نقل غرفة مع الخلايا transfected من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. توخي الحذر للحفاظ على الشرائح شقة وضمان أن الغرفة يجلس جيدا وضبط النفس من الحركة.
- نقل الهدف حتى قطرة من النفط يلامس فقط الجزء السفلي من الشريحة. البؤري الصحيح هو بالقرب من هذا الموقف. في المجاهر التلقائي، حفظ هذا الموقف وكذلك موقف خفضت لاستخدامه في عينيainder من تجربة التصوير لتسهيل تغيير العينات.
- اختيار الخلايا قاتمة. وخلايا overexpressing AT 1A R-GFP سوء توجيه مستقبلات في الخلية وتعطل وظيفة عادية.
- تؤكد أن مخطط الخلية، التي تحددها غشاء البلازما، مرئيا ويفضل أن لا تتداخل مع الخلايا الأخرى.
- التركيز ومركز الخلية في مجال الرؤية.
- التبديل إلى الوضع متحد البؤر.
- اختيار وضع التصوير السريع. مع يد واحدة على تركيز الرقابة والآخر على جهاز التحكم XY المرحلة، والتركيز ومركز الخلية من الفائدة تصور على الشاشة.
- تأكد من أن خلية من الفائدة وينتشر بشكل جيد وأسفل أو بطني جانبها مصفف بشكل وثيق مع ساترة من خلال التركيز صعودا وهبوطا من خلال الخلية.
- تعيين المعلمات ض مرحلة لصورة خلية في 3D.
- حدد زر على لقمة Z المكدس والحوار السفلي (أو ما يعادلها) والتركيز على الجزء السفلي من جالذراع ثم اضغط على "البدء". ثم، والتركيز على الجزء العلوي من الخلية ثم اضغط على "النهاية". إعادة فحص أن الخلية بأكملها يتم تضمينها في ض المكدس.
- تعيين حجم Z-خطوة إلى 1.0 ميكرون.
- إعدادات التصوير تعيين.
- اختر التكبير 2، تبعا للعدسة، بحيث يكون حجم بكسل النهائي حوالي 0.279 ميكرون س 0.279 ميكرون إلى 0.14 ميكرون س 0.14 ميكرومتر في البعد XY.
- لخلايا كلوة في هذه التجربة، تعيين سرعة المسح الضوئي إلى ما يقرب من 1 ميكرو ثانية لكل فوكسل وحدد 2 المتوسط أو 2 تراكمات سطرا، اعتمادا على سطوع الخلايا.
- ضبط كثافة الليزر وكسب لتصوير GFP وصبغة الفلورسنت. بصفة عامة، فإن counterstains يكون أكثر إشراقا، وبالتالي مضخم للكشف عن (PMT) وليس الغاليوم فوسفيد زرنيخيد (GaASP) أو أجهزة الكشف عن الهجينة (HYD) ينبغي أن تستخدم لهذه القناة اللون الثانية في حين ضرورية اللحظات وHYD كاشفات للقناة GFP. إذا كان HYD أو GaASP كشفوتستخدم أملاح الإماهة الفموية لصبغة الفلورسنت، حذرة وتبدأ مع الليزر على قوة منخفضة للغاية.
- تعيين مدة المسح الضوئي وتكرار المسح الضوئي، على سبيل المثال، كل 30-60 ق أكثر من 25 دقيقة أو أكثر لمعرفة استهداف AT 1A R-GFP إلى الجسيمات الحالة.
- تعيين ضبط تلقائي للصورة للحفاظ على الاستقرار طائرة التنسيق مع مرور الوقت.
- بدء تجربة التصوير.
- إعداد مقدما 100X انج الأسهم الثاني في 5 ميكروغرام / ميكرولتر (4.7793 ملم) وإضافة 2.1 ميكرولتر من هذا إلى 998 ميكرولتر المتوسطة (10 ميكرومتر).
- بدء التحفيز يجند من خلال إضافة 3 ميكرولتر من محلول المخزون 100X يجند (آنغ الثاني) إلى تحتوي على 300 ميكرولتر فورا قبل التصوير (تركيز النهائي 100 نانومتر).
- انقر فوق ابدأ والصورة في 3D في الوقت المطلوب والتردد.
- قبل الانتهاء من العمل في المجهر، وجمع ض المكدس لاستخدامها لاحقا في الطرح الخلفية أثناء التحليل. في وضع العد الفوتون، وهذا ليسضروري لأن الخلفية هي في الأساس 0. مع إضاءة على تشغيل كافة وظروف التصوير الأخرى نفسها، ولكن مع عدم وجود عينة التقاط صورة عينة. انظر الطرح الخلفية (أدناه) قيد التحليل.
اليوم الخامس
تحليل 5. صورة
- تصدير الصور إلى تنسيق TIFF.
- انقر بزر الماوس الأيمن على اسم ملف الصورة لرؤية القوائم وحدد تصدير أو انقر فوق ملف | تصدير | استيراد.
- تصدير إلى شجار لالتحليلات اللاحقة التأكد من تصدير الخام وبيانات 12 بت [ليس "أحمر أزرق أخضر" (RGB) التحويل المستخدمة للصور ذات جودة النشر]. لا تصدير إلى تنسيق JPEG.
- لاحظ X، Y، Z أبعاد فوكسل وحجم ض خطوة لاستخدامها لاحقا خلال تحليل الصور. على سبيل المثال، وذلك باستخدام 40X / 1.4. قد يكون NA العدسة الشيئية هذه القيم 0.138 ميكرون س 0.138 ميكرون مع 1 ميكرومتر حجم ض خطوة (انظر البيانات في قسم النتائج تمثيلي).
- <قوية> إنشاء كومة صورة للتحليل.
- فتح صورة البرنامج الكميات (الشكل 2)
- استخدام "العمل | تكوين جديد | صور من تسلسل مختارة" لتوليد صورة ملف واحد من تسلسل المستوردة واحدة (الشكل 2، السهم 1 #).
- أدخل عدد من القنوات، وعدد من ض أقسام، وعدد من النقاط الزمنية.
- اعتمادا على هيكل من ملفات TIFF. *، حدد، على سبيل المثال، قنوات، ض الطائرة، ونقاط الوقت كما أمر الطائرات الصورة. تأكد من أن كومة الصورة النهائية يمثل بشكل صحيح قنوات اللون، ض المكدس، والوقت من نقاط الصورة الأصلية.
- حدد اسم الصورة (الشكل 2، وأبرز اسم الملف في اليسار، السهم رقم 2). انقر بزر الماوس الأيمن على صورة و / أو حقل الصورة، ومن الخيارات في الجزء السفلي من القائمة اختر "خصائص". في بكسل ميكرون ل(X) (Y) و (Z) حجم، أدخل لاحظت خصائص الصورة الصحيحة أعلاه.
- خلفية طرح قبل تحليل الصور. تصحيح الخلفية يمكن أن يتحقق في أي برنامج تحليل الصور. خلفية طرح باستخدام أحد خيارين.
- الخيار 1: حدد "العمل | تكوين جديد | الطرح الخلفية" (الشكل 2، السهم رقم 1). استخدام صورة خلفية المكتسبة التي تم الحصول عليها في نهاية الدورة التصوير المذكورة أعلاه باسم "المرجعي الظلام" صورة تحت عنوان "أدوات | طرح الخلفية".
- الخيار 2: فحص الأغمق في الصور التي لا يوجد فيها عينة، والعثور على متوسط أو أقصى سطوع البكسل في تلك المنطقة، وتجاهل أي بكسل مشرق على نحو غير عادي والتي قد تكون fluorophore زائفة، بكسل مشرق عشوائيا، أو بعض الظواهر الأخرى. حدد "تطبيقات | تكوين جديد | الطرح الخلفية". استخدام هذا سطوع بكسل (مصنوعة السلبية) كما أوفست.
- تحقق للتسجيل اللون وصحيحة إذا لزم الأمر.
- توليد تصحيح التسجيل عن طريق اختيار "تطبيقات | تكوين جديد | تصحيح التسجيل" (الشكل 2، السهم رقم 1) واستخدم مربع الحوار لإجراء التعديلات. عند الانتهاء عنصر مجلد جديد ستظهر بعنوان "تصحيح التسجيل".
- تطبيق تسجيل واحد أو أكثر من الصور من الفائدة عن طريق النقر على اسم الصورة (الشكل 2، وأبرز اسم الملف في اليسار، السهم رقم 2) ومن ثم اختيار "أدوات | التسجيل الصحيح" (زر أداة المجاور للتطبيقات).
- اختر صورة (الشكل 2، وأبرز اسم الملف في اليسار، السهم رقم 2)، ورسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول خلية واحدة باستخدام أداة حرة المنطقة (الشكل 2، السهم 3 #). استخدام وضع التركيز الموسع (2D، القائمة المنسدلة في أعلى اليسار) لمراقبة الخلية مثل أداة الاقتصاص يعمل فقط في 2D التصور.
- انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة وتحديد "المحاصيل إلى التحديد" ويتم إنشاء عنصر صورة جديدة.
- حدد الخلية المزروعة من خلال النقر على اسمها ثم حدد "القياس" علامة التبويب فوق (الشكل 2، السهم رقم 4).
- لتحديد وقياس الحويصلات المنضوية للGFP، جر "البحث عن كائنات" تحت عنوان "الحقائق" (الشكل 2، السهم 5 #) في مربع التسلسل (الشكل 2، السهم 6 #).
- ضبط "البحث عن كائنات" قناة إلى قناة GFP.
- إعدادات المفتوحة (رمز عجلة مربع الحوار في، السهم رقم 6) وتعيين4؛ عتبة باستخدام: "لSD و" الحد الأدنى "إلى 6. تعيين" حجم الكائن الحد الأدنى "ل0 ميكرون 3.
ملاحظة: سوف أقل وSD الحد يتوقف على التجارب الفردية. تأكيدا البصرية التي يتم الكائنات الصحيح thresholded من خلال دراسة نقاط زمنية مختلفة (الشكل 2، السهم 7 #). يستخدم مربع الحوار لاختيار الطريقة التي اختارت هي تصور الأشياء thresholded (الشكل 2، السهم رقم 8) | "خيارات ملاحظات القياس". - انقر على "مقياس" في مربع الحوار "البحث عن كائنات" (الشكل 2 السهم رقم 6) واختيار القنوات ونوع من القياسات. عادة، حدد "كافة القنوات" و "كثافة وحجم القياسات".
- لتحديد العتبة والمرشحات لتحديد خلية كاملة ولقياس مجموع كثافة GFP، كرر الخطوات المذكورة أعلاه (5.5.4 - 5.5.8) باستخدام المعلمات التالية: SD 0 و "حجم الكائن الحد الأدنى" ل2 μ؛ م 3 في مربع الحوار الثاني "البحث عن كائنات" لتحديد الخلايا باستخدام GFP (الشكل 2، السهم 9 #)
- سحب "تصفية سكان" تحت عنوان "تصفية" إلى مربع تسلسل تحت السكان 2 (ثاني مربع "البحث عن كائنات"، الشكل 2، السهم رقم 9). حدد "حجم (ميكرون 3> 100).
- ضمان بصريا أن يتم تحديد كائن واحد فقط. يجب thresholded الخلية بأكملها وكافة الكائنات الأخرى تصفيتها بعيدا. "الفلتر" المعلمة (ق) قد تحتاج إلى تعديل إذا كانت الخلية الصغيرة، على سبيل المثال.
- مرة واحدة كانت موحدة القياس، حفظ بروتوكول بالنقر بزر الماوس فوق الصورة واختر "بروتوكول حفظ" من أجل إعادة ( "استعادة البروتوكول"). ويمكن أيضا أن بروتوكول يتم تصديرها إلى توفير سجل في نفس الدليل كصورة.
- انتقل إلى "جعل القياس" عن طريق اختيار "القياسات | جعل قياس البند" (الشكل 2
- أدخل اسم القياس الصحيح (نسخ لصق من صورة غير مريحة) ورمز تحليل أو التاريخ (إضافة مفيدة لحفظ السجلات) وحدد "جميع Timepoints". سيتم إنشاء عنصر ورقة العمل الجديد تحت الصورة. إبقاء أسماء الملفات موجزة.
- انقر على اسم الملف ورقة عمل وحدد علامة التبويب "تحليل". تحديد ما إذا كان voxels المشبعة موجودة قبل اختيار الأول "تقييد تحليل ل:" تحديد عدد السكان 2 (الخلية).
- انقر على الحق في الميدان تحت "علامة التبويب تحليل" وفي مربع الحوار تحت عنوان "تحليل هذه البيانات:" حدد "ماكس ([قناة لون GFP])". تحت عنوان "ملخص من قبل:" حدد "يعني ([قناة لون GFP]". وتحت عنوان "تنظيم البيانات بواسطة:" و "الصف" حدد "Timepoint" والمبادرة القطريةالمسيخ "موافق".
ملاحظة: إذا كان يحتوي على بيانات بكسل المشبعة (على سبيل المثال 65،536 لمدة 16 بت أو 4096 لمدة 12 بت)، فإن التحليل لا تكون دقيقة (سوف نقلل محتوى الحويصلة). تجاهل تلك الخلية لتحليلها. إن لم يكن المشبعة، انتقل إلى الخطوة التالية. - التالي، ضمن علامة التبويب "الخام" ثم تحت عنوان "تحليل" علامة التبويب وبزر الماوس الأيمن فوق بيانات تجد "تقييد تحليل ل:" ثم حدد سكان 1 للحويصلات أو السكان (2) لخلية كاملة.
- تحت عنوان "تحليل هذه البيانات:" تحديد "مجموع" (قناة لون GFP)؛ تحت عنوان "ملخص من قبل:" تحديد "مجموع". وتحت عنوان "تنظيم البيانات بواسطة:" و "الصف" حدد "Timepoint" أو "الوقت نسبي" ثم انقر فوق "موافق". قد يتم حفظ التحديدات تحليل وإعادة استخدامها.
- تحديد ونسخ / لصق مباشرة من البرنامج صورة الكميات إلى جدول بيانات فارغة أو تصدير البيانات جدول بواسطة النقر على الحق في داتوواختيار حفظ باسم ملف csv. وسيتم إدراج قياس كثافة خلية كاملة مع قياسات كل حويصلة في عدد السكان لذلك تأكد من تحديد وفصلها عن الحويصلات.
ملاحظة: بعد بالتآمر البيانات، والزيادة في مجموع مضان GFP الواردة في الحويصلات يرتفع بسرعة. photobleaching من، إذا حدث ذلك، تم الكشف عن فقدان من إجمالي كثافة الخلايا GFP مع مرور الوقت.
- في البحث عن الأجسام (السكان 1)، مجموعة "البحث عن كائنات" قناة إلى قناة الحمراء وفي رمز عجلة ضمن مربع الحوار هذا يدل على السهم رقم 6 (الشكل 2) مجموعة "عتبة باستخدام:" لSD و "الحد الأدنى" ل 6. تعيين "حجم الكائن الحد الأدنى" إلى 0.017 ميكرون 3.
ملاحظة: سوف أقل وSD الحد يتوقف على التجارب الفردية. تأكيدا البصرية التي يتم thresholded الكائنات الصحيح يجب أن تدلي بها الامتحانining نقاط زمنية مختلفة. يستخدم مربع الحوار لاختيار الطريقة التي اختارت هي تصور الأشياء thresholded (الشكل 2، السهم رقم 8) | "خيارات ملاحظات القياس". - انقر على "قياس" في "البحث عن" كائنات "الحوار (الشكل 2 السهم رقم 6) واختيار القنوات وأنواع القياسات. عادة"، ويتم اختيار جميع قنوات "و" كثافة وحجم القياسات ".
- للسكان 2، استخدام إعدادات مماثلة لتلك التي تستخدم لتحديد كله transfected الخلايا معربا في 1A R-GFP (5.5.9).
- إذا كانت الخلايا متعددة (بما في ذلك الخلايا untransfected مع حويصلات صبغة الفلورسنت إيجابي) موجودة، وزراعة المحاصيل الخلية في المرحلة الأولى من تحليل أمر بالغ الأهمية. بدلا من ذلك، استخدام "تجزئة" ينبغي أن تستخدم للحد من تحديد الجسيمات الحالة داخل الخلية transfected معربا في 1A R-GFP. يجب تحديد الجسيمات الحالة فقط داخل الخلية GFP وليس من الخلايا المجاورة، untransfected.
- تحليل وتصدير البيانات على النحو الوارد أعلاه.
ملاحظة: يتم عرض مثال على خلايا thresholded والحويصلات في الشكل (4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا مجموعة تمثيلية من التجارب، و transfected خلايا كلوة مع مستقبلات الأنجيوتنسين نوع 1A (AT 1A R-GFP) بناء (E1،2،3-AT 1A R) المستنسخة في pEGFP-N2 البلازميد 13. تم الحصول على الصور مرور الزمن من كلوة ولعب كفيلم (انظر لايف التصوير خلية 1 ولايف التصوير خلية 2 أفلام). تظهر الأفلام واللقطات التي بعد التحفيز يجند، AT 1A يتم ترجمة R-EGFPs في الغالب في الغشاء البلازمي، ولكن مع إضافة انج الثاني هذه المستقبلات تصبح المنضوية ضمن 2.5 دقيقة لتكوين الحويصلات مشرقة وفي أوقات لاحقة التجمع في الحويصلات أكبر في منطقة محيط بالنواة (أرقام 4B و 5 و 6A، الخلية الحية التصوير 2).
الكمي من مجموع كثافة الخلايا GFP ومجموع كثافة حويصلة GFP للخلية في الشكل 5 صrovide توضيحا من التعقيدات الملازمة عندما انج الثاني يدفع الإزعاج ويتغير شكل الخلية مباشرة بعد التحفيز (الشكل 5A، السهم في 0 دقيقة بعد انج الثاني، الصف العلوي والبرتقالي يشير إلى الأشياء thresholded). في أوقات لاحقة، وتوطين الحويصلات التي تحتوي على GFP في كتلة محيط بالنواة أيضا يتداخل (الشكل 5A، السهم الأحمر في 29.5 دقيقة). وعلى الرغم من كل الأشياء ينبغي أن تدرج في مجموع قياس كثافة الخلايا GFP، ينبغي أن تستبعد والكشكشة من القياسات حويصلة لأنها تمثل غشاء البلازما AT 1A R-GFP. في المقابل، لا ينبغي استبعاد الحويصلات محيط بالنواة عنقودية من قياس الحويصلة (ينظر هذا الأخير في مساحة الخلية المغلقة في الدوائر الحمراء في الشكل 5A، السهم على 29.5 دقيقة بعد انج الثاني، أقل صف). محاولات لتحقيق ذلك عن طريق تصفية حجم (أكثر من أو أقل من 7 ميكرون 3) لم يكن مفيدا لأنه لا يمكن أن تميز الكشكشة وضد عنقوديةesicles (أرقام 5A و5B، مقارنة مرشح> 7، فلتر <7، وليس فلتر). والبديل الممكن أن يكون رسم مناطق الفائدة (ROI) تشمل الجزء هيولي الخلية باستثناء حافة الإزعاج ومحيط الخلية. في نهاية المطاف، هذه الخلية لن تدرج في النتائج الكمية لأن هناك كانت مشبعة بكسل من GFP الحاضر.
ويرد المثال الثاني ممثل في الشكل 6A يوضح مسار الوقت الذي لم يستخدم ضبط تلقائي للصورة. يظهر GFP المنضوية كنسبة مئوية إجمالي GFP الخلوي (الشكل 6B). النقاط وقت قبل السهم الأحمر في 3 دقائق مضللة جزئيا باعتبارها الوحيدة الخلية كانت في حجم التصوير ولكن 3 دقائق بعد انج الثاني بالإضافة إلى ذلك، البؤري restabilized. وGFP الكلي داخل الخلية يدل على أن هذه الخلية لم photobleach ملحوظ على مر الزمن (الشكل 6C ). بين 3 و ما يقرب من 12 دقيقة، وفي المئة GFP كثافة في الحويصلات زيادات ثم مستويات قبالة (الشكل 6B). بعد ذلك، تم استخدام الجسيمات الحالة التي حددها صبغة الفلورسنت لتحديد رويس داخل الخلية transfected ثم جرى كميا لقاء مبلغ من شدة GFP (الشكل 6D). بعد ثلاث دقائق، وشدة AT 1A R-GFP في الجسيمات الحالة التي تم تحديدها الحمراء لا تختلف على مر الزمن (الشكل 3D، ن = 5، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط). وبالتالي ليس هناك زيادة اكتشافها في تسليم AT 1A R-مراكز تنسيق الشؤون الجنسانية في الجسيمات الحالة لمدة تصل إلى 24 دقيقة بعد تناوله انج الثاني.
الشكل 1: المشبعة بكسل التي تم تحديدها في بحث الجدول (طرفية). السهم الأحمر يشير بكسل المشبعة هو مبين في الزرقاء.ر = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على البرامج صورة الكمي. يشار إلى العناصر الرئيسية التي الأرقام ومناقشتها ضمن النص الأساليب. 1) البند العمل، صورة 2) مختارة، 3) يده خالية من أداة العائد على الاستثمار، 4) القياسات التبويب، 5) البحث عن كائنات 6) عدد السكان 1 بحث عن كائنات مربع الحوار، 7) سهم تفعيل الفاصل الزمني الفيلم، 8) القياسات البند، 9) مربع حوار يحتوي على القيادة تصفية سكان a البحث الثاني كائنات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: اللون التسجيل تصحيح. الصور مع تصحح ووأظهرت تسجيل بكسل تصحيح جنبا إلى جنب مع إدراجات العديد من الحويصلات المحتوية على colocalizing AT 1A R-GFP. وتحولت بكسل الحمراء 1 بكسل إلى اليسار في الطائرة XY للصورة غير المصححة. تظهر الأشكال المناطق محاصر في أعلى التكبير. شريط مقياس = 3.3 ميكرون، أبعاد فوكسل = 0.138 س 0.138 × 1 ميكرون 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم توضيحي لاستيفاء الحد الأدنى إلى التعرف GFP- وصبغ نيون التي تحتوي على الحويصلات وGFP-كله الخلايا. (أ) تحديد الخلايا بأكملها باستخدام AT 1A R-GFP (GFP، الصف العلوي) وthresholded GFP لخلية كاملة (خلية الهوية، والصف السفلي) وترد في 0 و 2.5 دقيقة بعد انج الثاني بالإضافة. وتشير المربعات البيضاء الإضافيةالمناطق آخرون هو مبين في (ب) و (ج). تتم مقارنة (ب) AT 1A R-مراكز تنسيق الشؤون الجنسانية في 0 و 2. 5 دقائق بعد إضافة انج الثاني في الصور لون واحد (الصف العلوي). وتظهر الحويصلات التي تم تحديدها من قبل العتبة في الصف السفلي (ID فيس والأرجواني). ويبين (C) وصور اللونين (AT 1A R-GFP / صبغة الفلورسنت) عند 0 و 2.5 دقيقة بعد انج الثاني بالإضافة. وتظهر الجسيمات الحالة التي تم تحديدها من قبل العتبة التي كتبها الخطوط الحمراء. شريط مقياس = 7.0 ميكرون، أبعاد فوكسل = 0.114 س 0.114 س 1.4 ميكرون 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم توضيحي لآثار الكشكشة ومجمع الحويصلات على قياس المنضوية GFP المستقبلات. (أ) T 1A R-GFP في انج الثاني تعامل الخلايا في 0 (الصف العلوي) و 2.5 دقيقة (الصف السفلي) وترد في ثلاث تجارب تصفية مكان في العمود الأول طبقنا مرشح لتحديد فقط كائنات أكبر من 7 ميكرون 3، في العمود الثاني لتحديد كائنات أقل 7 ميكرون 3، وفي العمود الثالث تم استخدام أي مرشح. كان مستوى العتبة المستمر في كل ثلاث. تشير الأسهم إلى كائنات thresholded كبيرة، وتشير الدوائر مساحة السيتوبلازم تحتوي على حويصلات محيط بالنواة في نقطة زمنية لاحقة. المناطق Thresholded باللون البرتقالي. ويرد (B) الكمي لGFP مجموع كثافة في الحويصلات للمناطق thresholded مع أو بدون تصفية حجم (عن طريق عمود في A) عند نقطتين الوقت (قبل الصف في A). وكانت أبعاد فوكسل 0.138 س 0.138 × 1 ميكرون 3. شريط مقياس = 5.6 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تتبع AT1 على R- GFP التطبع والتعريب المحتملة في الجسيمات الحالة. (أ) ترد خمس نقاط زمنية محددة من AT 1A R-GFP مع LysoTracker الأحمر من الفيلم المصاحب (خلية حية التصوير الفيلم 1) في 0، 3، 6، 9، و 12 دقيقة بعد انج الثاني. وتمثل الشبكة نطاق وحدة من 6.56 ميكرون 3، وكانت أبعاد فوكسل 0.297 س 0.297 س 1.2 ميكرون 3، وخطوة ض = 1.2 ميكرون. (ب) وهناك مؤامرة من إجمالي GFP في المئة في الحويصلات مع مرور الوقت يوضح استيعاب السريع لAT 1A R-GFP. (ج) ومؤامرة من GFP الكلي في الخلية مع مرور الوقت يوضح أن photobleaching من القليل نسبيا حدث خلال 24 دقيقة من التصوير. وقد تم تحديد (D) الجسيمات الحالة عن طريق تحديد LysoTracker الحويصلات الأحمر إيجابية. مجموع كثافة GFP في فلوريداوقد تم قياس uorescent صبغ إيجابي حويصلة رويس في كل نقطة زمنية (تطبيع إلى نقطة لأول مرة مع أي تعويض ل photobleaching التي لا تقاس بشكل مستقل). (C - D) قبل السهم، والقياسات ليست صالحة منذ تحول التركيز. N = 5، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: الخلية الحية التصوير 1: (انقر على الحق للتحميل) خلية كلوة transfected مع AT 1A R-GFP تم تصوير كل 1 دقيقة لمدة 24 دقيقة (25 لقطة) بعد إضافة 100 نانومتر انج الثاني. وقد اكتسب الفيلم باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مع خطة-Apochromفي 63X / 1.4 هدف النفط NA، أبعاد فوكسل من 0.279 س 0.279 س 1.2 ميكرون 3؛ و 5 شرائح لمجموعة من سمك 4.794 ميكرون تصويرها في 3.20 ميكرو ثانية / بكسل. معدل الفيلم هو 2 لقطة / ثانية. وحدة = 6.56 ميكرون.
فيلم 2: التصوير الخلية الحية 2: (انقر على الحق للتحميل) خلية كلوة transfected مع AT 1A R-GFP تم تصوير كل 30 ثانية لمدة 25 دقيقة (51 إطارات) بعد إضافة 100 نانومتر انج الثاني. تم الحصول عليها الفيلم باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مع 40X / 1.4 هدف النفط NA خطة-امزيغ. وكانت أبعاد فوكسل 0.11 س 0.11 س 1.4 ميكرون 3. تم تصوير 7 شرائح لما مجموعه 8.4 ميكرون سمك في 3.72 ق / الإطار. معدل الفيلم هو 3 لقطة / ثانية. شريط مقياس = 7 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التجارب الأولية المقدمة هنا توضح أن أكثر من دورة زمنية قصيرة بدلا من 24 دقيقة، لم يطرأ أي تغيير ملموس في تسليم AT 1A R-GFP إلى الجسيمات الحالة. بشكل عام، يمكن أن يحدث تسليم مستقبلات المنضوية في الجسيمات الحالة في وقت مبكر من 15-20 دقيقة. هذه التجربة هي متسقة مع فرضية أن الجزء الأكبر من المنضوية AT 1A R وتستهدف كبيرة، الإندوسومات محيط بالنواة. دليل على أن ما لا يقل عن بعض AT 1A R يصل في الجسيمات الحالة يتضح من لي وآخرون. ، الذي قارن الخلايا في 5 دقائق و 30 دقيقة بعد العلاج انج الثاني وجدت colocalization كبير من LAMP1 مع AT 1A R 30 ولكن ليس 5 دقائق 6.
تقدم هذه الورقة وصفا مفصلا لإعداد الخلية، والتصوير، وخطوات تحليل وتناقش العديد من المزالق الكامنة في هذه التقنية التصوير المتقدمة. يعتمد هذا الأسلوب على الخطوات الحاسمة التي تناقش أدناه.
SS = "jove_step"> خلية الثقافة وترنسفكأيشن
منذ صحة جيدة الخلايا أمر بالغ الأهمية لأي تجربة التصوير الخلية الحية، من المهم تجنب استخدام الخلايا خارج مرور 11 بسبب التغيرات في معدلات النمو وكفاءة ترنسفكأيشن في الممرات أعلى. للحفاظ على الخلايا السليمة في كافة مراحل التجربة، يجب أن لا تتجاوز فترة حضانة مزيج ترنسفكأيشن مع خلايا 5 ساعات منذ حل الحويصلية غير سامة لخلايا يتضح من زيادة blebbing الغشاء. درجة الحرارة والرطوبة والسيطرة CO 2 هي كبيرة قبل وكذلك أثناء التصوير. الانجرافات في درجة الحرارة أثناء التصوير يمكن أن تسبب الانجرافات القسم ض الرئيسية نسبيا وفقدان الاستقرار البؤري. ومن هنا ينصح الحذر خلال إضافة انج الثاني للخلايا أثناء التصوير لضمان الحفاظ على المستوى البؤري بدقة.
التصوير
ميزة التصوير الخلية الحية على المناعية باستخدام خلايا ثابتة هيأن الظروف في الجسم الحي يمكن السيطرة عليها عن كثب والقطع الأثرية المرتبطة مع خلايا ثابتة يمكن تجنبها. ومع ذلك، يمكن التصوير الخلية الحية أن يكون تحديا للتحسين من أجل العمليات الخلوية التي هي سريعة للغاية، مثل استيعاب مستقبلات. سرعة الصك وضرورة تجنب photobleaching من الحد الاختيار من الأحداث التي يمكن دراستها. كل تجربة التصوير قد تتطلب بعض الخيارات التي يتعين اتخاذها في بعض المعلمات والتنازلات في الآخرين؛ الأمثلة هي الخيارات في حجم بكسل، وتراكم الخط، عامل التكبير، وسرعة المسح الضوئي للحصول على بيانات ذات نوعية جيدة للتحليل وتجنب الإفراط في نفس الوقت. قرارات حاسمة في هذه العوامل تعتمد على تحقيق التوازن بين الحاجة للحصول على حجم بكسل كافية للتمييز بين الحويصلات الفردية والحاجة الى الحصول على قرار زمني يكفي من الأحداث التي تحدث. وبالتالي لا بد من بعض المفاضلات من أجل الحصول على المعلومات بسرعة بما فيه الكفاية كما تبدأ الخلية لاستيعاب مستقبلات GFP المسمى. في منطقتناالحالة، على الرغم من أن برنامج متحد البؤر الحديثة يمكن أن تشير إلى حجم بكسل الأمثل، استخدمت تجاربنا قيمة أقل من حجم بكسل الأمثل وفقا للمعادلة نيكويست 14. سوف الخيارات المثلى من الإعدادات لتجارب أخرى تعتمد أيضا على كيفية مشرق هي الخلايا منذ أكبر حجم بكسل سيمكن تراكم أسرع من الفوتونات السماح مقايضة مع وقتا أطول فوكسل يسكن لجمع المزيد من الفوتونات.
لتحليل لتكون ناجحة، والتصوير الخلية الحية أيضا يتطلب حاسمة لتحقيق الاستقرار بؤري دقيقة خلال الوقت الفاصل بين التصوير. التحولات المحورية وكذلك الفشل في صورة الخلية بأكملها يمكن أن يكون لها تأثير عميق على القياس الكمي لاستيعاب المستقبلة وكذلك مجموع كثافة GFP الخلوي. وقد تم تقديم الحل لهذه المشكلة من تحولات محورية خلال أقرب نقاط وقت التصوير بعد إضافة انج الثاني من قبل الشركات المصنعة مبائر في شكل حلول ضبط تلقائي للصورة حيث ساترة interferomيستخدم etry مع ليزر الأشعة تحت الحمراء إلى جانب ردود الفعل إلى تركيز الرقابة الآلية للحفاظ على المسافة النسبية من الهدف إلى السطح ساترة التي حددها انعكاس الأشعة تحت الحمراء (التركيز على سبيل المثال مؤكد أو نظام التحكم التركيز). المشكلة المتبقية من اختصاصي المجاهر هي ثم لتحديد الصحيح ض نطاق بحيث أنه على الرغم من التغييرات الشكل، تبقى الخلية بأكملها في حجم التصوير. درجة الحرارة عاملا حاسما آخر للحفاظ على موقف التركيز / Z خلال النقاط الزمنية الأولية بعد إضافة انج الثاني. ينبغي الحفاظ على درجة حرارة الهدف وكذلك الحية غرفة التصوير الخلية عند 37 درجة مئوية في كافة مراحل التجربة.
عنصر حاسم آخر من التصوير، وتكتسب الصور كميا. إذا تم استخدام جهاز الكشف عن HYD في وضع العد فوتون، يجب تعيين المعلمات التصوير حتى لا يحدث تصادم أن الفوتون. لهذه الفرق وكشف عن الأخرى، ويجب ألا تحتوي على صور بكسل المشبعة (voxels). في كلتا الحالتين، جمعية مهندسي البترولcialized طاولة ننظر متابعة (طرفية) يمكن استخدامها لتصور وجود بكسل المشبعة وبالطبع إذا كانت موجودة، يجب على اختصاصي المجاهر تقليل كثافة الليزر و / أو زيادة.
تحليل
على الرغم من أن يتم تطبيق النهج المبين هنا لمستقبلات AT 1A R وcolocalization مع الجسيمات الحالة، فإنه ينطبق على التجارب التي الكمية النسبية للمستقبلات في مقصورات التحت خلوية المسمى مع العلامات الفلورية المختلفة هي في السؤال. إذا كان الهدف هو قياس ما إذا كان أو لم يكن يتحرك مستقبلات للعضية، ثم استخدام معامل colocalization لبيرسون مع علامة لعضية إشكالية. فإن كل بكسل حيث يتم التعرف على عضية تحتوي على كمية عالية من علامة ذلك أن واحدا من معاملات سوف يكون دائما بالقرب من 100٪. وهكذا، يمكن أن القياسات colocalization تكون مضللة. من ناحية أخرى، وقياس المئة من المستقبلات على عضية مقابل المبلغ الإجمالي من رجبتور هو أكثر من ذلك بكثير بالمعلومات وأوضح لتفسير. وثمة حالة التي يمكن أن يكون أفضل وصف البروتين colocalization باستخدام معامل ارتباط بيرسون تكون على 1A R مستقبلات وLAMP1 التي تم توثيقها، ولو بنهج colocalization أكثر تطورا، وهي FLIM / الحنق 6 التفاعل.
استخدام التصوير 3D هو أكثر دقة من استخدام شرائح تمثيلية من الخلايا مع التحليل في 2D بسبب الحركات الخلوية التي لا مفر منها خلال الوقت (لايف التصوير 2 فيلم). ويتضح من الصور الخلية الحية هو مبين في أرقام 3، 4B، و5A أن يتم ترجمة مستقبلات في المقام الأول على الغشاء البلازمي، ولكن، في غضون بضع دقائق من التعرض لانج الثاني هو يموضع إلى النقاط المضيئة على الغشاء والصغيرة حويصلات المجاور للغشاء، حفر ربما المغلفة والإندوسومات في وقت مبكر (أرقام 4B 4C). مع التطور المستمر من الوقت، والحويصلات تتحرك من خلال الخلية تتراكم في الحويصلات الكبيرة المجاورة للنواة التي وصفت بأنها الإندوسومات عديد الحويصلات (MVEs، أرقام 1، 5A) 3، 15. شريحة واحدة من خلال الخلية مع مرور الوقت أن تشوه عملية الاستيعاب وتحريف الأحداث الحقيقية وخاصة إذا كان شريحة لم يتضمن سطح الخلية في العصور الأولى، وMVEs في أوقات لاحقة.
في هذه الدراسة، يمكن نهجين لتحليل الصور تقليل آثار photobleaching من لGFP وكذلك صبغة الفلورسنت على نتائج الكمية. كما photobleach الخلايا (وإن كان ذلك على نطاق محدود)، والحفاظ على سطوع النسبي للحويصلات المنضوية النسبية لكثافة الخلية بأكملها، على افتراض photobleaching من يحدث بشكل موحد. كما حددت الحويصلات صبغة الفلورسنت إيجابي بسهولة عن طريق تحديد deviatio القياسيةن الخيار كثافة الفلورسنت يعني لالعتبة الحويصلات المنضوية مشرق. هذا يميزها عن الخلفية حتى كمستوى بأكمله من التراجع مضان. وهكذا، كانت قياساتنا ليست حساسة لآثار photobleaching من متواضع. ومع ذلك، photobleaching من القوي فقدان مثل 50٪ من كثافة الخلايا مع مرور الوقت قد يكون لها تأثير أكبر على النتائج الكمية. بدلا من ذلك، يمكن قياس آثار photobleaching من مستقل في تجارب السيطرة غابت انج الثاني في حالة AT 1A R-GFP أو في خلايا untransfected المجاورة في حالة من الأصباغ الفلورية. ويمكن بعد ذلك حلل آثار photobleaching من في أثناء التحليل.
مخاوف إضافية
في الآونة الأخيرة، وقد أجرى علماء الأحياء الخلايا تقييم نقدي وتعديل البروتينات الفلورية لرصد الاتجار الغشاء في خلايا لتجنب القطع الأثرية التي تم إنشاؤها بواسطة بروتين فلوري نفسها، مستقلة عن الرفاهيه البروتينز المعلمة. البروتينات الفلورية مختلفة معرضة للتفاعلات مع المكروية المحلية التي تؤدي إلى هطول الأمطار البروتين أو يشابك استنادا لالباكاف الحمضية وجود الحمض الأميني السيستين، على التوالي 16. ويمكن أن تشمل نتائج أخرى من هذه التفاعلات فقدان مضان 16. كل هذه التحف تؤثر على القياسات الكمية الاتجار. Constantini وآخرون. ولدت البروتينات الفلورية أحادى للتصوير التي تفتقر السيستين للقضاء على التحف المحتملة 16. وهكذا، وهذا يتوقف على الهدف من تجارب التصوير، والتحول من EGFP (غير أحادى) إلى مركب بسيط، فإن شكل خالية من السيستين يكون من المفيد للدراسات microenvironments حويصلي الحمضية و / أو الحد. ومثال آخر هو تحسين فائدتها لFRAP أو الحنق التجارب حيث multimerization ويشابك سيؤثر نشر البروتين والبروتين البروتين التفاعلات.
قطعة أثرية أخرى محتملة في الاعتبار عند التصوير باستخدام الجسيمات الحالة LysoTracker الأحمر جنبا إلى جنب مع البروتينات GFP الانصهار هو أن LysoTracker الأحمر وقد ثبت أن تكون قادرة على photoconversion إلى اللون الأخضر 17. يوصي الباحثون أن يكون الحد الأدنى استخدام الإضاءة epifluorescence، مناقشة حدوث هذه القطع الأثرية، والإشارة إلى الحالات الناجحة لcolocalization استخدام هذا كاشف. بالإضافة إلى ذلك، وعلامات أخرى من الجسيمات الحالة يمكن أيضا أن تستخدم للتحقق من النتائج colocalization، على سبيل المثال، الموسومة LAMP1 6.
في المستقبل، وحساسية وخصوصية هذا الاختبار يمكن فحص لمستقبلات تستهدف إلى الجسيمات الحالة فضلا عن غيرها من المقصورات التحت خلوية باستخدام مثبطات النقل حويصلة و / أو الانصهار، عن طريق تثبيط يحلول تحمض باستخدام bafilomycin لمنع تدهور ولكن ليس تراكم 7، 18 ، عن طريق استخدام الكلوروكين لمنع انصهار مع الجسيمات الحالة وبالتالي عرقلة شارك في توطين مستقبلات مع الجسيمات الحالة 2، 5، 6، 7، 18، باستخدام الضوابط الإيجابية مثل استهداف المسمى انج الثاني لالجسيمات الحالة 2، وبالمقارنة مع البعض جيدا مستقبل ويجند أنظمة -described مثل عامل ترانسفيرين أو البشرة النمو ومستقبلات المشابهة لها 3. عنصر تحكم إيجابية مثيرة للاهتمام، لمصطنع lbeit، في تجاربنا كان نتيجة لوحظ في المجاورة، untransfected، AT خلايا السلبية 1A R-GFP. على ما يبدو هذه الخلايا حملوا GFP صدر من الخلايا transfected واستهدف لالجسيمات الحالة حيث كان colocalization مع صبغة الفلورسنت بارز جدا (لا يظهر). هذا colocalization، ومع ذلك، لم يكن حساسية لانج الثاني كما هو متوقع.
وفي الختام، وأساليب ترنسفكأيشن، والتصوير، وتحليل الصور المعروضة هنا توفر الوسائل التي مستقبلات الداخلي لمختلف مقصورات التحت خلوية يمكن تتبع من الناحية الكمية داخل الخلايا الحية على مر الزمن. المقارنات النسبية بين مستقبلات مختلفة أو مستقبلات تحور بشكل انتقائي ممكنة فيما يتعلق حركية وتوطين التحت خلوية إلى مقصورات محددة. وتناقش الصعوبات والقطع الأثرية المرتبطة بهذه التكنولوجيا الممكنة. ومع ذلك، سريع الحية التصوير في 3D إلى جانب تحليل الصور يمكن استخدامها لقياس امتصاص مستقبلات وسريعةالتحولات من خلال السيتوبلازم إلى جزيئيا المقصورات التي يمكن تحديدها. هذا يمهد الطريق لقياس الفروق الناتجة عن الطفرة من مستقبلات أو تطبيق منبهات، الخصوم، ومثبطات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد العمل البحوث التي قدمت في هذه المخطوطة من قبل منحة R01 HL121456-01A1 إلى كاثرين ساندبرج. وأيد هذا العمل بالإضافة إلى توافر لايكا SP8 AOBS في الميكروسكوب والموارد المشتركة تصوير (مصر) في المركز الطبي بجامعة جورج تاون الذي يتم تمويله جزئيا من قبل P30-CA051008 من المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة الأمريكية. نحن نعترف بامتنان لايكا المساعدة SP8 التصوير بيتر جونسون، واستخدام زايس LSM880 في مختبر توماس Coate، قسم علم الأحياء في جامعة جورج تاون بمساعدة التصوير التي تقدمها ألما أرنولد من كارل زايس المجهر LLC. هذا المحتوى من المخطوط هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
