Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Published: March 27, 2017 doi: 10.3791/55177
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2, 4
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

Abstract

הדמית תא חי משמשת ללכידה זמנית זמן לשגות תמונות של קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין (AT R 1a) ותאים תאיים בכליה-293 עובריים אנושיים טרנספקציה (HEK) תאים בעקבות גירוי עם אנגיוטנסין II (אנג שנייה). תאי HEK הם transfected זמני עם ה- DNA פלסמיד המכיל AT R 1a מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP). ליזוזומים מזוהים עם פלורסנט לצבוע אדום. תמונות Live- תא נלכדות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר לאחר גירוי אנג השני ונותחו על ידי תוכנה בשלושה ממדים (3D, ווקסלים) לאורך זמן. Live- תא הדמיה מאפשרת חקירות סחר הקולט ונמנעה בלבול הקשורים קיבעון, ובפרט, האובדן או עקירת artefactual של קולטני קרום מתויג EGFP. לפיכך, כתאים בודדים מתבצעים מעקב לאורך זמן, לוקליזציה subcellular של קולטנים ניתן הדמיה ומדודה. התמונות חייבות להירכש sufficiently במהירות ללכוד תנועת שלפוחית ​​מהירה. עם זאת, במהירויות הדמיה מהר, מספר הפוטונים שנאספו מצטמצם. הפשרות חייבות להתבצע גם בבחירת פרמטרי הדמיה כמו גודל voxel כדי לצבור מהירות הדמיה. יישומים משמעותיים של דימות תאים חיים הם ללמוד סחר חלבון, הגירה, שגשוג, מחזור התא, אפופטוזיס, autophagy ואינטראקציה בין חלבונים ודינמיקה, אם למנות רק כמה.

Introduction

המטרה הכללית היא להשיג ראיות כמותית בזמן ובמרחב של colocalization קולטן עם אברונים subcellular ספציפיים לאחר הטיפול עם אגוניסט לקולטן. לפיכך, המטרה המיידית כאן היא ללכוד תמונות confocal זמן לשגות של lysosomes ו הטרנסממברני פורש קולטן בתאי כליה עובריים אנושיים (HEK) בעקבות transfection וכדי מכן להרכיב ולנתח את הנתונים הדמיה 3D למדוד את המסירה של קולטן כמותית כדי lysosomes. חקירת הסחר סימולטני של קולטן הטרנסממברני עם lysosomes או אברונים אחרים בזמן אנדוציטוזה כאשר מופעל על ידי ליגנד רצפטור יכול לעזור לקבוע כיצד קולטן הטרנסממברני מוסדר בתנאים פיזיולוגיים pathophysiological.

R AT 1a המשוער הוא מושפל lysosomes לאחר טיפול עם אנג II במערכות תאים מודל, בעיקר HEK293 1 למרות שרוב receptors הם נקודות בעיקר endosomes מחזור multivesicular למחזור מאוחר קרום הפלזמה בעוד חלק הארי של ליגנד, אנג השנייה, נפגע ליזוזום 2, 3, 4, 5. לאחרונה, Li et al. הפגינו באמצעות תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מיקרוסקופיה הדמיה החיים הקרינה (FLIM) טכניקות 1a AT colocalizes R (על סולם ~ 10 ננומטר) עם LAMP1, חלבון הממברנה ליזוזומלית מכאן שלפחות חלק הקולטן מיועד והשפילו על ידי lysosomes 6. מחברים אלו ציינו כי chloroquine ליזוזומלית מעכב חסומה העמותה R-LAMP1 1a אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים טוען כי השפעה של chloroquine היא לחסום היתוך של endosomes מאוחר או autophagosomes עם lysosomes. גישות עקיפות אחרות כדי לקבוע AT l 1a Rocalization ב lysosomes ניצלו bafilomycin, מעכב ליזוזומלית להסיק הימצאות R 1a ב lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.

Live- תא הדמיה תמנע השפעות אפשריות של קיבעון על נפח תא, ואובדן / עמעום / חלוק מחדש של קולטן ה- GFP-chimeric. מחקרים קודמים יש לסמוך על תאים קבוע כדי לקבוע colocalization או שיתוף התרחשות של הקולטן עם lysosomes או באמצעות תאים חיים שכותרתו עם פונדקאיות מחייב לקולטן כגון 1 β-arrestin, 2, 3, 4, 5, 6. הדמיה של תא חי GPCRs האחר באמצעות confocal ספינינג דיסק או conf סריקת נקודת ליזרמיקרוסקופי ocal מצוידים גלאי Gaasp או HYD אפשרו לחוקרים לבחון את ההפנמה וסחר של קולטנים בתאים בודדים צלמו ערימות z ב 30 שניות במרווחים 9, 10. עם זאת, גם כאשר Z- ערימות תא חיים נאספות במהירות, ניתוח עלול להתרחש רק לאחר הבחירה של מטוס בודד בתוך כל ערימה, כלומר ב 2D 10. אמנם זה עשוי להיות מספיק ללימוד קולטן קינאז GPCR או טירוזין הפנים נדון, Rs 1a AT מצטבר שלפוחית משני גודל ומיקום לאורך זמן וכך הם מטבעם יותר קשים לדגום כראוי באמצעות פרוסה אחת נציג בכל נקודת זמן. כדי לקבוע את התוואי באופן יסודי של שכותרתו AT R 1a דרך התא וכדי לזהות כל תת-אוכלוסייה של השלפוחית השונה בהיקפו, עמדה, אנו פתחנו שיטת הדמית 3D וניתוח 3D כדי לעקוב אחר שינויים אלה להיות הפועל בשיתוף עם תיוג של תאים שונים תאיים כגון lysosomes.

חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה עבור דימות תאי חיים כדי להמחיש את התנועה ישירות של R 1a AT לתוך התא והעברתו תאי subcellular בעקבות גירוי אנג השני. תאי subcellular מתויגים עם מפלצות חלבון פלואורסצנטי או סמני ניאון אחרים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם גישה ראשונה למקם קולטנים אברונים subcellular עם רזולוציה מינימאלית של 200 ננומטר על מנת להשוות מוטציה לעומת קולטנים wild-type או כדי לזהות שינויים בעקבות טיפוליים תרופתי. הטכניקה נגישה שכן הוא יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ confocal מצויד הדמית תא חי. הקלות היחסית של גישה זו עומדת בניגוד מומחיות מוגברת הציוד הדרוש כדי לבצע סריג / FLIM / טכניקות ברט אשר לזהות אינטראקציות מולקולריות 6,"Xref"> 11. מדידות אלה מגדירים אינטראקציות בין חלבונים ברזולוציה גבוהה (~ 10 ננומטר) ולוקליזציה בתוך אברונים subcellular הוא להסיק. טכניקות מתקדמות יותר אלה משמשות כדי לבצע מעקב להגדיר טוב יותר אינטראקציות מולקולריות של עניין, במקום חלוף קולטנים באמצעות תאי subcellular, והם ישירות להפגין אינטראקציות חלבון-חלבון בזמנים מסוימים ומקומות בתוך התא 11. FLIM, טכניקת סריג עצמאית של ריכוז acceptor, מתבצע לרוב על מדגמים קבועים מאז רכישת תמונה היא איטית יותר. לעומת זאת, סריג יחס מספק הדמיה מהירה colocalization ברזולוציה גבוהה של חלבונים אינטראקציה. החסרון של סריג יחס הוא הדמיה אשר מנצלת קרינת EPI widefield כדי לצבור מהירות הדמיה לכלול את התא כולו, וכתוצאה מכך ברזולוציה מופחתת וחדות של אברונים 12. העברת אנרגית תהודת פליטת אור (ברט) היא עודטכניקה מתקדמת כי יושם GPCRs למדוד את רכישת הקרבה מולקולרית לאורך זמן 11. בטכניקה זו fluorophore חלבון מחולקת מולקולרית וכל חצי צמוד לאחד שני חלבונים מדוברים. כאשר שני החלבונים מלווים במסר עניין אחד את השני, את החלקים של התג כימרי להרכיב מחדש לרכוש קרינה ואת הקרינה גדלה לכמת לאורך זמן.

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה עבור דימות תאי חיים יחד עם כימות תמונה ללמוד סחר R 1a AT בתא על גירוי אנג שני והשינוי פוטנציאל במסיירת הפנים AT R 1a כדי lysosomes בעקבות גירוי אנג שני. השימוש האולטימטיבי עבור טכניקה זו היא לאפיין הבדלים בסחר קרום השוואת סוג בר קולטנים מוטציה. הבדלים אלה יסייעו לזהות את המנגנון (ים) שפעת שפעילויות פיסיולוגיות של R 1a AT leading כדי ויסות לחץ הדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

יום אחד

1. זריעת תאים

  1. כן המלא בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM). הוסף 50 מ"ל של סרום שור העובר, 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ל של L- גלוטמין 450 מ"ל של DMEM לעשות 500 מ"ל של DMEM מלאה בתוספת סרום שור העובר (10%), פניצילין / סטרפטומיצין (1%) ו L- גלוטמין (1%).
  2. זרע כליה עובריים אנושיים (HEK) תאים, מספר מעבר 6-11 ב 50,000 / היטב במערכת coverglass 8 תאיים היטב שלם DMEM.
  3. שמור את השקופית תאיים על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.

יום שני

2. Liposome Transfection

  1. טרי להפוך AT פתרונות פלסמיד ליפוזום 1a R-GFP באמצעות בתנאים סטריליים עם ארון בטיחות ביולוגית ברמה 2.
  2. לדלל 2 μL של DNA פלסמיד ב 900 ng / μL פתרון המניות ב 178 μL של תקשורת סרום המופחת להשיג תרכיזיםיון של פלסמיד דנ"א של כ 10 ng / μL.
  3. לדלל 4.5 μL של פתרון מניות ליפוזום ב 175.5 μL של תקשורת סרום המופחת ליצור 01:40 דילול של המניות.
  4. מוסיפים את פתרון liposome לפתרון פלסמיד ומערבבים באמצעות פיפטור מ"ל 1 פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לערבב הפתרון transfection.
  5. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (C ° 25-27).
  6. בעוד תערובת זו היא דוגרת, להסיר את המדיה לאט עם pipettor 1 מ"ל ולאט לאט להוסיף 400 μL של בופר פוספט 1x (PBS) כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
  7. בעדינות להסיר את PBS ולהחליף עם 200 μL / גם של התקשורת סרום מופחת מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.
    הערה: היזהר בכלל הצעדים בעת שטיפת התאים כדי למנוע ניתוק של תאים מן coverslip בשל הלחץ העצום הנגרם על ידי pipetting.
  8. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  9. פעם התקופת הדגירה נגמרה, להוסיף 80 μL של תערובת transfection זה טוב דגירה התאים עבור 4.0-4.5 שעות אך לא יותר מ -5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2.
  10. לאחר תקופת דגירת transfection תושלם, להסיר את המדיה לאט מהתאים באמצעות pipettor מיליליטר 1 ולהחליף בעדינות עם 300 μL / טובה של DMEM מלא דגירת תאים עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 .

יום שלוש

3. סרום רעב

  1. הסר את המדיה בעדינות בעזרת פיפטור 1 מ"ל ולהחליף לאט עם 300 μL של סרום ללא DMEM ללא פנול אדום.
  2. שמירה על תא ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עבור 10-12 שעות.

היום הרביעי

4. הדמיה של תא חי

  1. תאים תאיים כתם (lysosomes במקרה זה).
    1. אה בוut 30 דקות לפני הדמית lysosomes בתאים, להוסיף 22.5 μL מתוך 1 מיקרומטר פתרון פלורסנט לצבוע מניות (0.5 μL של 1 מ"מ צבע פלואורסצנטי מדולל 499.5 μL של הסרום ללא DMEM ללא פנול אדום) זה טוב עבור ריכוז לצבוע סופי של 75 ננומטר.
    2. דגירה של 25-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 ולאחר מכן להסיר את צבען בעדינות ובאיטיות להוסיף 300 μL של סרום ללא DMEM טריים ללא פנול אדום.
  2. הכן את המיקרוסקופ הדמיה.
    1. התאם את השלב למטה כדי למנוע ניזק לעדשה במהלך האתחול של מיקרוסקופ אוטומטית.
    2. הפעילו את המחשב מיקרוסקופ, כוח סורק, כוח לייזר ולאחר מכן פליטת לייזר, ולבסוף את המנורה הליד מתכת עבור תצפית ויזואלית (ראו הוראות היצרן מיקרוסקופ confocal).
    3. פתח את תוכנת הדמיה בתורו התוכנה על הארגון (488 ננומטר) עד הליזר וכוח 30-50%. הערת הכח תלויגיל לייזר. בתוך ניסויים חשוב לשמור הגדרות קבועות.
    4. הפעל לייזר אדום פולטות (למשל 568 ננומטר או 594 ננומטר).
    5. פורמט הדמיה הגדר לעומק 12-bit.
    6. הגדר את חריר עבור ננומטר לייזר ארגון קו 488 ועבור לייזר 568 ננומטר או 594 ננומטר עד 1 יחידת הדיסק אוורירי. אם GFP הוא מאוד עמום, להשתמש בהגדרה של 2 יחידות דיסק Airy, אבל להתאים את הערוצים כראוי.
    7. בעת שימוש סינונים dichroic, בחר את אורכי גל הפליטה המתאים GFP ואת צבע פלואורסצנטי. או, להגדיר את אורך גל הפליטה (Em) ב 499-580 ננומטר עבור GFP וא"מ 599 - 680 ננומטר עבור צבע פלואורסצנטי אדום פולטות.
    8. בדוק כי לדמם דרך מוצלב אינו מתרחש. כבו כל ליזר בתור ולבדוק בשני ערוצי הפליטה לכל. כאשר ליזר הארגון כבוי, פליטת הירוק צריכה להיות אפס. כאשר הליזר הפולט הירוק כבוי, ערוץ פליטת אדום צריך להיות אפס.
      הערה: השיטה הבטוחה ביותר היא דמות שכל אחד מהם במסלולים נפרדים (sequential).
    9. כלול ערוץ brightfield אם תרצה בכך. הימנע הדמיה בניגוד ההפרש (DIC), כי זה יכול להטות מדידות colocalization.
    10. הדמיה חיה, רציפי קו בוחרים ולא רציפי מסגרת.
  3. בחרו את תאי הדמיה.
    1. לנצל מספרי צמצם 1.4 (NA) אובייקטיבי כמו מטרת שמן 63X / 1.4 NA תאי תמונה (או 40X / 1.4 NA). מרכז את המטרה ולהוסיף טיפה של צמיגות גבוהה, שמן טבילת autofluorescence נמוך על המטרה.
    2. מעביר את התא עם תאי transfected מן החממה עד לשלב של המיקרוסקופ. הקפד לשמור את השקופיות שטוחות ולהבטיח כי החדר הוא יושב היטב ומאופק מתנועתו.
    3. הזז את המטרה עד טיפת שמן רק נוגעת בתחתית המגלשה; המטוס התקין המוקדים הוא ליד עמדה זו. בשנת מיקרוסקופים אוטומטית, לשמור את המיקום הזה, כמו גם את העמדה הורידה להשתמש עבור remainder של ניסוי הדמיה כדי להקל שינוי דגימות.
    4. בחר תאים עמומים. תאים overexpressing AT 1a R-GFP יהיה misdirect הקולטן בתא ולשבש תפקוד תקין.
    5. אשר נקבעו המתווה של התא, שהוגדרה על ידי קרום התא, גלויה ועדיף לא חופף עם תאים אחרים.
    6. פוקוס ומרכז את תא שדה הראייה.
    7. עבור למצב confocal.
    8. בחר מצב הדמיה מהר. עם יד אחת על מוקד השליטה והשנייה בשלט במת XY, להתמקד ומרכז את תא העניין דמיין בצג.
    9. ודא תא העניין משתרע היטב בצד התחתון או גחון שלו ומצמיד אותן באופן הדוק עם coverslip על ידי התמקדות מעלה ומטה דרך התא.
  4. הגדר את הפרמטרים z-הבמה לתמונה תא 3D.
    1. בחר את לחצן ההפעלה עבור לראש מחסנית Z שיח תחתון (או שווה ערך) ולהתמקד לתחתית של גell מכן הקש "להתחיל". לאחר מכן, להתמקד לחלק העליון של התא ולחץ על "סוף". בדוק שוב כי התא כולו כלול Z- מחסנית.
    2. הגדר את גודל צעד Z ל -1.0 מיקרומטר.
  5. הגדרות הדמית גדר.
    1. בחר 2 זום, בהתאם העדשה, כך שגודל פיקסל הסופי עומד 0.279 מיקרומטר x 0.279 מיקרומטר 0.14 מיקרומטר x 0.14 מיקרומטר בממד XY.
    2. עבור תאים HEK בניסוי הזה, להגדיר מהירות סריקה של כ 1 מיקרו-שניות לכל voxel ובחר 2 מיצוע או 2 הצטברויות אחר שורה, בהתאם בהירות של תאים.
    3. התאם עוצמת הלייזר ולהשיג הדמיה GFP ואת צבע פלואורסצנטי. באופן כללי, counterstains יהיה הרבה יותר בהיר ולכן גלאי המכפיל (PMT) ואת זרח גליום ארסניד לא (Gaasp) או גלאי היברידי (HYD) צריך להיות מנוצל עבור ערוץ צבע שני ואילו גלאי תנשמות HYD נחוצים בערוץ ה- GFP. אם HYD או Gaasp לזהותORS משמשים צבע פלואורסצנטי, להפעיל זהירות ולהתחיל עם לייזר לעבר כוח נמוך מאוד.
    4. משך הסריקה הגדר ותדירות סריקה, למשל, כל 30-60 של מעל 25 דקות או יותר כדי לראות המיקוד של 1a AT R-GFP כדי lysosomes.
    5. הגדר את הפוקוס האוטומטי כדי לשמור על יציבות במישור מוקד לאורך זמן.
  6. בגין ניסוי ההדמיה.
    1. הכינו אנג מראש 100x השנייה המניה ב 5 מיקרוגרם / μL (4.7793 מ"מ) ולהוסיף 2.1 μL של זה 998 בינוני μL (10 מיקרומטר).
    2. בגין גירוי ליגנד על ידי תוספת של 3 μL של פתרון המניות 100x של ליגנד (אנג II) ל -300 היטב המכיל μL מיד לפני הדמיה (ריכוז סופי 100 ננומטר).
    3. לחץ על התחל ותמונה ב 3D בפעם ואת התדר הרצוי.
    4. לפני מסיימת לעבוד על המיקרוסקופ, לאסוף Z- מחסנית לשימוש עתידי רקע חיסור במהלך ניתוח. במצב ספירת פוטון, זה לאדרוש משום ברקע הוא בעצם 0. עם תאורה מופעלת וכל תנאי ההדמיה האחרים זהה, אך ללא מדגם לקחת תמונה לדוגמא. ראה רקע חיסור (בהמשך) מתוך ניתוח.

היום החמישי

ניתוח תמונה 5.

  1. ייצוא תמונות לפורמט TIFF.
    1. קליק ימני על שם קובץ התמונה כדי לראות תפריטים ובחר ייצוא או לחץ על קובץ | יצוא | יְבוּא.
    2. ייצוא ל TIFF עבור ניתוחים שלאחר מכן מוודא לייצא את RAW, נתונים 12 סיביות [לא 'ירוק כחול אדום' (RGB) המרה משמש תמונות באיכות פרסום]. אין לייצא לפורמט JPEG.
    3. הערת X, Y, מידות voxel Z ואת גודל z-צעד לשימוש מאוחר יותר במהלך ניתוח תמונה. לדוגמה, באמצעות 40X / 1.4. NA מטרת עדשת ערכים אלה עשויים להיות 0.138 מיקרומטר x 0.138 מיקרומטר עם 1 מיקרומטר z-צעד גודל (ראה נתונים בקטע תוצאות הנציג).
  2. <strong> צור ערימת תמונה לניתוח.
    1. תוכנת כימות פתחה תמונה (איור 2)
    2. השתמש "פעולה | צור חדש | תמונות מתוך רצף נבחר" כדי ליצור קובץ תמונה בודדת מתוך סדרות יחידות מיובאות (איור 2, חץ # 1).
    3. הזן את מספר הערוצים, מספר סעיפי z, ואת מספר נקודות זמן.
    4. בהתאם למבנה קבצי .tiff *, בחרו, לדוגמה, ערוצים, Z- מטוס, מועד לפי שעון כסדר של מטוסי התמונה. ודאו שערמת התמונה הסופית מייצגת ערוצי הצבע בצורה נכונה, Z- מחסנית, ונקודות זמן של התמונה המקורית.
    5. בחר את שם התמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2). קליק ימני על התמונה ו / או שדה התמונה, ומבין האפשרויות בתחתית הרשימה ובחר "מאפיינים". ב פיקסל מיקרומטר עבור (X) (Y) ו- (Z) גודל, הזן את מאפייני תמונה הנכונים שצוינו לעיל.
  3. רקע פחת לפני ניתוח תמונה. תיקון רקע ניתן להשיג בכל תוכנת ניתוח תמונה. רקע פחת באמצעות אחת משתי אפשרויות.
    1. אפשרות 1: בחר "פעולה | צור חדש | חיסור רקע" (איור 2, חץ # 1). השתמש תמונת רקע רכשה שהושגה בסוף פגישת ההדמיה שתוארה לעיל כתמונת "הפנייה האפלה" תחת "כלים | הפחת רקע".
    2. אפשרות 2: בדוק את האזורים האפלים של תמונות שבו אין מדגם, למצוא את שביל או בהירות מקסימלית של פיקסלים באזור זה, התעלמות מכל פיקסלים בהיר בצורה יוצאת דופן שיכול להיות fluorophore מזויף, פיקסל בהיר באופן אקראי, או כמה תופעה אחרת. בחר "פעולות | צור חדש | חיסור רקע". השתמש בהירות פיקסל זה (עשה שלילי) כפי הקיזוז.
  4. בדקו רישום צבע נכון אם יש צורך.
      (איור 3) להעריך את הצורך תיקון על ידי מעבר בין ערוץ צבע אדום או ירוק לסירוגין. מבחינה ויזואלית, אם הרישום כבוי גם על ידי 1 פיקסל, ברור לעין.
    1. צור תיקון הרישום על ידי בחירת "פעולות | צור חדש | תיקון רישום" (איור 2, חץ # 1) ולהשתמש בתיבת הדו-שיח כדי לבצע התאמות. עם השלמת פריט תיקיה חדשה תופיע תחת הכותרת "תיקון רישום".
    2. החל את רישום לאחד או יותר מתמונות של הריבית על ידי לחיצה על שם התמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2) ולאחר מכן בחירת "כלים | רישום נכון" (כפתור כלי סמוך פעולות).
  5. צור רצף מדידה לנתח AT שלפוחית R-GFP 1a ועוצמת התא כולו הבאהטיפול עם אנג שני.
    1. בחר תמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2) ולצייר באזור (ROI) עניין סביב תא בודד שימוש באפשרות באזור פריסטייל (איור 2, # החץ 3). השתמש במצב הפוקוס המורחב (2D, תפריט נפתח בצד שמאל למעלה) כדי לבחון את התא ככלי החיתוך עובדים רק להדמית 2D.
    2. קליק ימני על התמונה ובחר "חתוך לפי בחירה" ופריט תמונה חדש נוצר.
    3. בחר את התא קצוץ על ידי לחיצה על שמו ולאחר מכן בחר בכרטיסייה "מדידה" לעיל (איור 2, חץ מס '4).
    4. כדי להגדיר ולמדוד שלפוחית הפנימה עבור GFP, לגרור "מצא אובייקטים" תחת "מציאה" (איור 2, חץ # 5) לתוך תיבת רצף (איור 2, חץ # 6).
    5. הגדר "מצא אובייקטים" ערוץ לערוץ GFP.
    6. פתח את ההגדרות (סמל גלגל בתיבת דו-שיח, חץ # 6) ולהגדיר4; סף באמצעות: "אל SD ו" גבול תחתון "עד 6. גדר" גודל אובייקט מזערי "ל -0 מיקרומטר 3.
      הערה: גבול תחתון הס"ד יהיה תלוי ניסויים בודדים. אישור חזותי שהאובייקטים הנכונים thresholded נעשית על ידי בחינת בנקודות זמן שונות (איור 2, חץ # 7). "המדידה | אפשרויות משוב" תיבת הדו-שיח משמש לבחור את הדרך שבחרה חפצים thresholded הם דמיינו (איור 2, חץ # 8).
    7. לחץ על "מדוד" ב "אובייקטים מצאו" תיבת הדו-שיח (# חץ איור 2 6) ובחר את הערוצים וסוג המדידות. בדרך כלל, לבחור "כל הערוצים" ו "מדידות עוצמות ונפח".
    8. כדי להגדיר את thresholding ומתקנים לטיהור זיהוי של התא כולו וכדי למדוד עוצמת GFP הכולל, לחזור הפעולות הנ"ל (5.5.4 - 5.5.8) באמצעות הפרמטרים הבאים: SD 0 ו "גודל אובייקט מזערי" 2 μ; מ 3 בתיבה "מצא אובייקטים" הדו-שיח השני כדי לזהות תאים באמצעות GFP (איור 2, # חץ 9)
    9. גרור "אוכלוסייה מסננת" תחת "סינון" לתיבת הרצף תחת אוכלוסיית 2 (בתיבת "מצא אובייקטים" השנייה, איור 2, חץ # 9). "בחר Volume (מיקרומטר 3> 100).
    10. ראייה להבטיח כי רק אובייקט אחד מזוהה. התא כולו צריך להיות thresholded ובכל חפץ אחר מסוננים משם. פרמטר "המסנן" (ים) עשוי להזדקק התאמה אם התא הוא קטן, למשל.
    11. לאחר המדידה כבר טופלה, להציל את הפרוטוקול על ידי לחיצה ימנית על התמונה ובחר "שמור פרוטוקול" כדי לעשות שימוש חוזר ( "שחזור פרוטוקול"). הפרוטוקול ניתן גם לייצא על מנת ליצור רשום באותה בתיקייה כתמונה.
    12. המשך אל "הפוך ומדידה" על ידי בחירת "מדידות | הפוך פריט ומדידה" (איור 2
    13. הזן את שם המדידה הנכון (להעתיק ולהדביק מהתמונה נוחה) וקוד ניתוח או תאריך (תוספת מועילה עבור רישומים) ובוחרים "כל timepoints". פריט גיליון חדש ייוצר מתחת לתמונה. שמור שמות קבצים תמציתיים.
  6. לנתח ולייצא את הנתונים.
    1. לחץ על שם הקובץ גליון העבודה ובחר בכרטיסייה "לנתח". קבע אם ווקסלים רוויים נוכחים ידי הבחירה הראשונה "הגבל ניתוח ל:" לבחור 2 אוכלוסין (התא).
    2. קליק ימני על השדה תחת "הכרטיסייה נתח" בתיבת הדו-שיח תחת "לנתח נתונים אלה:" לבחור "מקס ([ערוץ צבע GFP])"; תחת "סיכם:" לבחור "Mean ([ערוץ צבע GFP]"; ותחת "ארגן את הנתונים על ידי:" ו "שורה" לבחור "timepoint" ו CLIck "אישור".
      הערה: אם נתונים מכילים פיקסלים רוויים (למשל 65,536 עבור 16 סיבי או 4,096 עבור 12-bit), הניתוח לא יהיה מדויק (זה יהיה לזלזל תוכן שלפוחית). להתעלם תא לניתוח. אם לא רווי, המשך לשלב הבא.
    3. לאחר מכן, תחת הלשונית "Raw" ולאחר מכן תחת לשונית "הניתוח" ו לחיצה ימנית על הנתונים למצוא "הגבל ניתוח ל:" ולאחר מכן בחר אוכלוסין 1 עבור שלפוחית ​​או אוכלוסין 2 עבור התא כולו.
    4. תחת "לנתח נתונים אלה:" לבחור "סאם" (ערוץ צבע GFP); "סיכם:" תחת בחר "סכום"; ו, תחת "ארגן את הנתונים על ידי:" ו "שורה" לבחור "timepoint" או "זמן יחסית" ולאחר מכן לחץ "אישור". בחירות ניתוח ניתן לשמור ולעשות בהם שימוש חוזר.
    5. לבחור ולהעתיק / להדביק ישירות מהתוכנה quantitation התמונה גיליון אלקטרוני ריק או לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על datובחירה באפשרות שמור כקובץ csv. מדידת עוצמת תא כולו תיכלל עם מדידות של כל שלפוחית ​​באוכלוסייה כדי להיות בטוח כדי לזהות ולהפריד בינו לבין השלפוחית.
      הערה: לאחר התוויית הנתונים, עליית GFP קרינה הכוללת מצויה בתוך שלפוחית ​​עולה במהירות. Photobleaching, אם היא מתרחשת, הוא זוהה כמו אובדן עוצמת GFP תא הכולל לאורך זמן.
  7. צור רצף מדידת לנתח נוכחי GFP ב lysosomes.
    1. ב האובייקטים מצאו (אוכלוסין 1), להגדיר "מצא אובייקטים" ערוץ לערוץ האדום סמל גלגל בתוך התיבה דו-השיח שמציינת חץ # 6 (איור 2) סט "סף באמצעות:" אל SD ו "גבול תחתון" כדי 6. הגדר "גודל האובייקט מזערי" כדי 0.017 מיקרומטר 3.
      הערה: גבול תחתון הס"ד יהיה תלוי ניסויים בודדים. אישור חזותי שהאובייקטים הנכונים שמתבצעים thresholded צריך להיעשות על ידי בחינהנקודות ining זמן שונות. "המדידה | אפשרויות משוב" תיבת הדו-שיח משמש לבחור את הדרך שבחרה חפצים thresholded הם דמיינו (איור 2, חץ # 8).
    2. לחצו על "מדוד" ב "מצא" אובייקטים "שיח (# חץ איור 2 6) ובחר את הערוצים וסוגי מדידות. בדרך כלל," כל הערוצים "ו" מדידות עוצמות ונפח "נבחרים.
    3. עבור אוכלוסייה 2, הגדרות שימוש זהה לזה המשמש לזיהוי תאים transfected כולה להביע AT R-GFP 1a (5.5.9).
    4. אם מספר תאים (כולל תאים untransfected עם שלפוחית ​​צבען חיובית ניאון) נוכחים, חיתוך התא בשלב הניתוח הראשון הוא קריטי. לחלופין, את השימוש של "למדר" צריך לשמש כדי להגביל זיהוי של lysosomes בתוך התא transfected להביע AT 1a R-GFP. ליזוזומים חייב להיות מזוהה רק בתוך התא GFP ולא ממקום סמוך, תאי untransfected.
    5. לנתח ולייצא נתונים כנ"ל.
      הערה: דוגמא של תאי שלפוחית thresholded מוצגת באיור 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בשנת סט נציג זה של ניסויים, תאים HEK היו transfected עם הקולטן 1a סוג אנגיוטנסין (AT 1a R-GFP) לבנות (R 1a E1,2,3-AT) משובטים לתוך פלסמיד pEGFP-N2 13. זמן לשגות תמונות של HEK נרכשו ושיחק כסרט (ראה הדמיה תא חי 1 והדמיה תא חי -2 סרטים). הסרטים וסטילס מראים כי לאחר גירוי ליגנד, AT 1a R-EGFPs הם נקודות בעיקר בקרום הפלזמה, אבל עם התוספת של אנג השנייה קולטנים אלה הופכים הפנימו בתוך 2.5 דקות כדי ליצור שלפוחית בהירה ולעתים מאוחר יותר מתגודדים שלפוחית גדולה אזור perinuclear (4B הדמוי, 5, ו 6 א; הדמית תא חייה 2).

כימות של עוצמת GFP תא הכולל ועוצמת GFP שלפוחית הכולל התא באיור 5 provide איור של סיבוכים הטמון כאשר אנג II משרה פורעת ושינויים צורת התא מיד לאחר גירוי (איור 5 א, חץ ב 0 דקות שלאחר אנג השנייה, בשורה העליונה, הכתום מצביע חפצים thresholded). לפעמים מאוחר יותר, לוקליזציה של שלפוחית המכילה GFP באשכול perinuclear גם מפריע (איור 5 א, חץ אדום בחלק 29.5 דקות). למרות כל האובייקטים צריך להיכלל במדידה עוצמת GFP תא הכולל, סלסולים צריך להיות מחוץ מדידות שלפוחית כפי שהם מייצגים קרום הפלזמה AT 1a R-GFP. לעומת זאת, שלפוחית perinuclear התקבצה אסור לשלול ממדידת השלפוחית (האחרון נראות בשטח של התא המוקף עיגולים אדומים באיור 5A, חץ 29.5 דקות שלאחר אנג שנייה, בשורה תחתונה). ניסיונות להשיג זאת על ידי סינון גודל (יותר או פחות מ -7 מיקרומטר 3) לא היה שימושי כפי שאין באפשרותה לעמוד להפלות מלמלות נ התקבצוesicles (איורים 5 א ו 5 ב, להשוות מסנן> 7, מסנן <7, ולא מסנן). חלופה אפשרית תהיה לצייר אזורים של העניין (ROI) המקיף את חלק cytoplasmic של התא אך למעט הקצה היקפי הפורעים של התא. בסופו של דבר, זה תא לא יכלול בתוצאות כמותית כי היו רווי פיקסלים של הווה GFP.

דוגמא מייצגת שנייה מוצגת באיור 6A הממחישות קורס הזמן בו הפוקוס האוטומטי לא היה בשימוש. ה- GFP הפנים מוצג GFP הסלולר הכולל אחוזים (איור 6). נקודות הזמן לפני החץ האדום ב -3 דקות מטעה חלק כמו שרק של התא היה בהיקף ההדמיה אבל 3 דקות לאחר תוספת אנג השנייה, מוקדי מטוס restabilized. ה- GFP הכולל בתוך התא מוכיח כי תא זה לא photobleach ניכרת לאורך זמן (איור 6 ג ). בין 3 ל כ 12 דקות, אחוז GFP עוצם בעליות שלפוחית ואז רמות מעל (איור 6). לאחר מכן, lysosomes מזוהה על ידי צבע פלואורסצנטי שימשו לזהות ROIs בתוך תא transfected אשר כומתו אז תמורת סכום של עוצמת ה- GFP (איור 6 ד). אחרי שלוש דקות, עוצמת 1a AT R-GFP ב lysosomes אדום-מזוהה אינו משתנה לאורך זמן (איור 3D, n = 5, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע). לפיכך אין עלייה לזיהוי מסירת 1a AT R-GFPs אל lysosomes עד 24 דקות לאחר מתן אנג השנייה.

איור 1
איור 1: רוויי פיקסלים שזוהו טבלת חיפוש (LUT). החץ האדום מצביע פיקסלים רווי בכחול.t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מבט כולל של תוכנת כימות תמונה. פריטי מפתח מסומנים על ידי מספרים ודנו בתוך טקסט השיטות. 1) פריט פעולה, 2) תמונה נבחרת, 3) כלי ROI ביד חופשית, 4) כרטיסייה מדידה, 5) מצא אובייקטים, 6) אוכלוסיית 1 למצוא חפצי תיבת הדו-שיח, 7) סרט לשגות חץ הפעלת זמן, 8) פריט מדידות, 9) ממצא שני אובייקטי תיבת הדו המכילה פקודת האוכלוסין מסננים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תיקון רישום צבע. תמונות עם לא מתוקן ורישום פיקסל תקן מוצג יחד עם ריבועים של מספר שלפוחית colocalizing המכילה AT R-GFP 1a. ככל שמספר הפיקסלים האדומים מוזזי 1 פיקסל שמאלה במישור XY של תמונה שלא תוקנה. ריבועי להראות באזורים בארגזים בהגדלה גבוהה יותר. סרגל קנה מידה = 3.3 מיקרומטר, מידות voxel = 0.138 x 0.138 x 1 מיקרומטר 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: איור של קביעת ערכי סף לזהות GFP- ו פלורסנט צבען המכילים שלפוחית תאים GFP-שלם. (א) זיהוי של תאים שלמים באמצעות AT R-GFP 1a (GFP, השורה העליונה) thresholded GFP עבור התא כולו (Cell ID, בשורה התחתונה) מוצגים ב 0 ו -2.5 דקות לאחר תוספת אנג השנייה. קופסות לבנות עולות inset באזורים שמוצגים (ב) ו- (ג). (ב) 1a R-GFPs מושווים ב 0 ו -2 5 דקות לאחר תוספת אנג השנייה בתמונות צבע אחד (בשורה העליונה). שלפוחית ​​המזוהית על ידי thresholding מוצגת בשורה התחתונה (ID Ves, סגול). (ג) תמונות שני צבעים (AT 1a R-GFP / צבע פלואורסצנטי) מוצגים ב 0 ו -2.5 דקות פוסט אנג II בנוסף. ליזוזומים המזוהה על ידי thresholding מוצג על ידי קווי מתאר אדומים. סרגל קנה מידה = 7.0 מיקרומטר, מידות voxel = 0.114 x 0.114 x 1.4 מיקרומטר 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: איור של האפקטים של מלמלות באשכולות שלפוחית על מדידה של רצפטורים הפנימו GFP. (א) 1a T R-GFP ב Ang II תאים שטופלו ב 0 (בשורה העליונה) ו -2.5 דקות (בשורה התחתונה) מוצגים שלושה ניסויים סינון איפה בעמודה הראשונה יושמה מסנן לבחור רק אובייקטים יותר מ -7 מיקרומטר 3, ב בעמודה השנייה כדי לבחור אובייקטים פחות 7 מיקרומטר 3, ובעמודה השלישית לא מסנן היה בשימוש. רמת ערכי סף הייתה קבועה בכל השלוש. החצים מצביעים על חפצים thresholded הגדולים, טבעות מצביעים על שטח של הציטופלסמה המכיל שלפוחית ​​perinuclear בנקודות מאוחר יותר זמן. באזורי thresholded הם כתומים. (ב) כימות של עוצמת הכוללת GFP ב שלפוחית מוצגת עבור אזורי thresholded עם או ללא סינון גודל (לפי עמודה ב א) בשתי נקודות זמן (על ידי שורת א). ממדי Voxel היו 0.138 x 0.138 x 1 מיקרומטר 3. בר סולם = 5.6 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 6
איור 6: מעקב AT1 הפנמה GFP R- ולוקליזציה פוטנציאלים ליזוזומים. (א) חמש נקודות זמן נבחרות 1a AT R-GFP עם האדום Lysotracker מוצגות מהסרט המצורף (הדמית תא חי 1 סרט) ב 0, 3, 6, 9, ו -12 הדקה 'פוסט אנג שנייה. הרשת מייצגת מידה יחידה של 6.56 מיקרומטר 3, מידות voxel היו 0.297 x 0.297 x 1.2 מיקרומטר 3, ואת z-צעד = 1.2 מיקרומטר. (ב) העלילה של GFP הכולל אחוזים שלפוחית לאורך זמן ממחיש את ההפנמה המהירה של 1a AT R-GFP. (C) עלילה של GFP הכולל בתא לאורך הזמן ממחיש כי photobleaching הקטן יחסית שהתרחש במהלך 24 דקות של הדמיה. (ד) ליזוזומים זוהו על ידי זיהוי השלפוחית האדום חיובית Lysotracker. עוצמת GFP הכולל בתוך flשלפוחית ​​צבען חיובי uorescent ROIs נמדדה בכל נקודת זמן (מנורמל לנקודת הזמן הראשונה ללא שום פיצוי עבור photobleaching שלא נמדד באופן עצמאי). (C - D) לפני החץ, המדידות אינן תקפות מאז המוקד עבר. N = 5, ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1
סרט 1: הדמיה של תא חי 1: (קליק ימני כדי להוריד) HEK התא transfected עם 1a AT R-GFP היה צילמו כל 1 דק '24 דק' (25 מסגרות) לאחר תוספת של 100 ננומטר אנג השנייה. הסרט נרכש באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם תוכנית-Apochromב 63X / 1.4 אובייקטיבי שמן NA, מידות voxel של 0.279 x 0.279 x 1.2 מיקרומטר 3; ו -5 פרוסות עבור סכום כולל של עובי 4.794 מיקרומטר צילמו ב 3.20 מיקרו-שניות / פיקסל. שיעור הסרט הוא 2 מסגרות / s. יחידה = 6.56 מיקרומטר.

סרט 2
סרט 2: הדמיה של תא חי 2: (קליק ימני כדי להוריד) HEK תא transfected עם 1a AT R-GFP היה צלם כל 30 שניות במשך 25 דקות (51 מסגרות) לאחר התוספת של 100 ננומטר אנג שניות. הסרט נרכש באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם מטרה הנפט Plan-Apochromat 40X / 1.4 NA. ממדי Voxel היו 0.11 x 0.11 x 1.4 מיקרומטר 3. 7 פרוסות עבור סכום כולל של 8.4 מיקרומטר עובי הם צילמו ב 3.72 s / מסגרת. שיעור הסרט הוא 3 מסגרות / s. סרגל קנה מידה = 7 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניסויים ראשוניים שהוצגו כאן להמחיש כי על קורס זמן קצר למדי של 24 דקות, שום שינוי ניכר במסירת 1a AT R-GFP אל lysosomes התרחש. באופן כללי, משלוח של קולטנים הפנימו כדי lysosomes יכול להתרחש מוקדם ככל 15-20 דקות. ניסוי זה עולה בקנה אחד עם ההשערה כי חלק הארי של הפנים AT R 1a מיועד endosomes הגדול, perinuclear. עדויות שלפחות חלק AT 1a R מגיע lysosomes הודגם על ידי Li et al. , שהשווה תאים ב 5 דקות ו 30 דקות לאחר טיפול אנג השני ומצא colocalization של LAMP1 המשמעותי עם R 1a AT 30 אבל 5 דקות 6 לא.

מאמר זה מספק תיאור מפורט של הכנת תא, הדמיה, וצעדי ניתוח ודן ופחים טמונים רבים טכניקת דימות מתקדמת זו. שיטה זו תלויה שלבים קריטיים בהמשך.

ss = "jove_step"> תרבות Transfection נייד

כיוון שבריאותו של תאים הטובים היא קריטית עבור כל ניסוי הדמית תא חי, חשוב להימנע משימוש תאים מעבר מעבר 11 עקב שינויים בשיעורי צמיחה ויעילות transfection ב קטעים גבוהים. כדי לשמור על תאים בריאים לאורך הניסוי, תקופת הדגירה של תערובת transfection עם תאים לא יעלה על 5 שעות מאז פתרון liposome הוא רעיל לתאים שמעידים blebbing הממברנה גדל. טמפרטורה, לחות ושליטה CO 2 הוא משמעותי לפני וכן במהלך ההדמיה. נסחפת בטמפרטורה במהלך ההדמיה עלולות לפגוע מרחף z-קטע מרכזי יחסית ואובדן יציבות מישור המוקד. לפיכך זהירות מומלצת במהלך תוספת של אנג השנייה לתאים במהלך הדמיה על מנת להבטיח כי מטוס המוקד נשמר במדויק.

הַדמָיָה

יתרון של הדמיה לחיות תאים מעל immunostaining באמצעות תאים קבועים הואניתן להימנע שתנאי vivo ב ניתן לשלוט באופן הדוק וחפצים הקשורים תאים קבועים. עם זאת, הדמית תא חי יכולה להיות מאתגרת לבצע אופטימיזציה עבור תהליכים תאיים כי הם מהירים מאוד, כמו הפנמה הקולטן. מהירות כלי והצורך להימנע photobleaching להגביל את הבחירה של אירועים שיכולים להילמד. כל ניסוי הדמיה עשוי לדרוש בחירות מסוימות להתבצע בכמה פרמטרים ופשרות באחרים; דוגמאות הן בחירות בגודל פיקסל, הצטברות קו, זום גורם, ומהירות סריקה כדי לקבל נתונים באיכות טובה לניתוח ולהימנע oversampling בעת ובעונה אחת. החלטות קריטיות גורם אלה תלויות באיזון הצורך בקבלת גודל פיקסל מספיק כדי להבחין שלפוחית ​​פרט הצורך בקבלת החלטה זמנית מספקת של האירועים המתרחשים. לכן כמה פשרות חייבות להיעשות על מנת להשיג מידע במהירות מספקת כמו התא מתחיל להפנים קולטן ה- GFP שכותרתו. בשלנותביעה, אף תוכנת confocal המודרנית יכולה להציע את גודל פיקסל האופטימלי, הניסויים שערכו השתמשו ערך פחות מגודל פיקסל האופטימלי על פי המשוואה נייקוויסט 14. בחירות אופטימליות של הגדרות עבור ניסויים אחרים גם תהיינה תלוי כמה מבריק התאים מאז גודל פיקסל גדול יאפשר הצטברות מהירה של פוטונים המאפשרים את סחר עם זמן להתעכב voxel כבר לאסוף פוטונים יותר.

לניתוח כדי להצליח, הדמית התא החי באופן אנוש גם דורשת ייצוב מוקדים מדויק במהלך הדמית הזמן לשגות. משמרות מיקוד וכן אי תמונת התא כולו יכולה להיות השפעה עמוקה על כימות של הפנמה הקולטן כמו גם עוצמת GFP הסלולר הכולל. הפתרון לבעיה זו של משמרות מוקדים במהלך מועדים לפי שעון המוקדם של הדמיה בעקבות התוספת של אנג השנייה סופק על ידי יצרני confocal בצורת פתרונות פוקוס אוטומטיים לפיה coverslip interferomלאופטומטריסטים עם לייזר IR בשילוב עם משוב מוקד שליטה אוטומטית משמש כדי לשמור על מרחק יחסי מן המטרה אל פני השטח coverslip שזוהו על ידי השתקפות IR (למשל Definite פוקוס או מוקד שליטה מסתגלת). בעית הנותרים של microscopist אז לזהות את Z- בטווח הנכון כך שלמרות שינויי צורה, התא כולו נשאר בהיקף ההדמיה. טמפרטורה היא גורם קריטי כדי לשמור על מצב המיקוד / ת במהלך מועדים לפי שעון ראשוני לאחר תוספת של אנג שנייה. הטמפרטורה של המטרה, כמו גם את תא הדמית תא החי יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.

עוד מרכיב קריטי של הדמיה, רוכש תמונות כמותית. אם גלאי HYD משמשים מצב ספירת הפוטון, פרמטרי ההדמיה חייבים להיות מוגדרים כך pileup הפוטון אינו מתרחש. לקבלת PMTs וגלאים אחרים, התמונות לא חייבות לכלול פיקסלים רוויים (ווקסלים). בשני המקרים, SPECIALIZED להסתכל למעלה בטבלה (LUT) ניתן להשתמש כדי להמחיש את נוכחותו של פיקסלים רווי וכמובן אם הם נוכחים, microscopist צריך להפחית את עוצמת הלייזר ו / או רווח.

אָנָלִיזָה

למרות הגישה המתוארת כאן מוחל על קולטן R 1a AT ו colocalization שלה עם lysosomes, זה חל על ניסויים שבהם הכמות היחסית של הקולטן בתאים subcellular שכותרתו עם תגי פלורסנט שונים מתערערת. אם המטרה היא למדוד אם מהלכי הקולטן אל אברון, ולאחר מכן באמצעות מקדם colocalization של פירסון עם סמן אברון הוא בעייתי. כל פיקסל שבו אברון מזוהה יהיה כמות גבוהה של הסמן כך שאחד המקדמים תמיד יהיה קרוב ל- 100%. לכן, מדידות colocalization יכולות להיות מטעות. מצד שני, מדידת אחוז קולטן על אברון לעומת הסכום הכולל של רג'פהטור הוא הרבה יותר אינפורמטיבי וברור יותר לפרש. במקרה בו colocalization החלבון יכול טוב ביותר להיות מתואר באמצעות מקדם המתאם של פירסון יהיה AT קולטן 1a R ו- LAMP1 אינטראקציה אשר תועד, אם כי בגישת colocalization מתוחכמת יותר, כלומר FLIM / סריג 6.

שימוש הדמית 3D הוא מדויק יותר מאשר שימוש פרוסות נציג של תאים עם ניתוח 2D בגלל תנועות הסלולר כי הן בלתי נמנעות במהלך הזמן (הדמית חיה 2 סרט). ברור מהתמונות לחיות התאים מוצגות איורים 3, 4 ב ', ו -5 א כי הקולטן הוא מקומי בעיקר קרום הפלזמה, לעומת זאת, בתוך כמה דקות של חשיפה אנג השני הוא localizes כדי כתמים בהירים על הקרום והקטן שלפוחית סמוכה הממברנה, בורות מצופית כנראה ואת endosomes מוקדם (4B הדמוי 4C). עם התקדמות המשך של זמן, שלפוחית לעבור דרך התא המצטבר שלפוחית גדול סמוך לגרעין תוארו endosomes multivesicular (MVEs, איורים 1, 5 א) 3, 15. פרוסה אחת דרך התא לאורך הזמן עלול לעוות את תהליך ההפנמה לסלף את האירועים הנכונים במיוחד אם את הפרוסה לא כוללת את השטח פני התא במועדים מוקדמים, ואת MVEs בזמנים מאוחר יותר.

במחקר זה, שתי גישות לניתוח תמונה יכולות למזער את ההשפעות של photobleaching של ה- GFP, כמו גם צבע פלואורסצנטי על התוצאה כמותית. ככל שתאי photobleach (אם כי במידה מוגבלת), הבהירות היחסית של שלפוחית ​​הפנימה ביחס לעוצמת התא כולו נשמרה, בהנחת photobleaching מתרחשת באופן אחיד. שלפוחית ​​צבען חיובית פלורסנט גם מזוהים בקלות על ידי בחירת deviatio תקןn של האופציה עוצמת פלורסנט הממוצע של thresholding שלפוחית ​​הפנימו בהיר. זה מבדיל אותם מרקע גם כאשר המידה השלמה של ירידות קרינה. לפיכך, המדידות שלנו היו לא רגישות להשפעות של photobleaching הצנוע. עם זאת, photobleaching החזק כגון 50% אובדן עוצמת תא לאורך הזמן עלול להיות בעל השפעה גדולה יותר על תוצאות כמותיות. לחלופין, את ההשפעות של photobleaching ניתן היה למדוד באופן עצמאי ניסויים שליטה נעדר אנג השנייה במקרה של 1a AT R-GFP או בתאים untransfected סמוכים במקרה של צבעי ניאון. השפעות photobleaching ניתן יהיה בחשבון במהלך ניתוח.

חששות נוספים

לאחרונה, ביולוגים של תא בצעו הערכה ביקורתית שינוי של חלבוני ניאון לניטור סחר קרום בתאים להימנע חפצים שנוצרו על ידי חלבון פלואורסצנטי עצמו, עצמאיים של ביין החלבוןg מתויג. חלבוני ניאון שונים פגיעים אינטראקציות עם microenvironment המקומית שמוביל לירידת משקעים חלבון או crosslinking מבוסס על של pKa שלהם והנוכחות של ציסטאין חומצה אמינית, בהתאמה 16. תוצאה נוספת של אינטראקציות אלה עשויות לכלול אובדן של קרינה 16. כל החפצים האלה משפיעים מדידות כמותיות של סחר. קונסטנטיני ואח '. יצר חלבוני ניאון monomeric הדמיה חסר ציסטאין לחסל חפצים פוטנציאליים 16. לפיכך, בהתאם מטרת הניסויים הדמיה, המעבר בין EGFP (לא monomeric) על monomeric, טופס ציסטאין-חינם יהיה יתרון ללימודים של וחומצי / או צמצום microenvironments שלפוחי. דוגמה נוספת תהיה השירות שלהם משופרת עבור FRAP או סריג בניסויים שבהם multimerization ו crosslinking ישפיע אינטראקציות חלבון דיפוזיה בין חלבונים.

עוד חפץ הפוטנציאל שיש להביא בחשבון בעת הדמיה lysosomes באמצעות Lysotracker האדום יחד עם חלבונים היתוך GFP הוא כי האדום Lysotracker הוכח להיות מסוגל photoconversion עד 17 ירוק. החוקרים ממליצים ושימוש בתאורה epifluorescence להיות ממוזער, לדון המופעים של חפץ זה, ולהתייחס מקרים מוצלחים של colocalization באמצעות ריאגנט זה. בנוסף, סמנים אחרים של lysosomes יכול גם להיות מועסק על מנת לאמת את התוצאות colocalization, למשל, מתויג LAMP1 6.

בעתיד, את הרגישות והסגוליות של assay זה יכול להיבחן על קולטן מיקוד lysosomes וכן תאים subcellular אחרים באמצעות מעכבי התחבורה שלפוחית ו / או היתוך, על ידי עיכוב החמצה ליזוזום באמצעות bafilomycin לחסום השפלה אבל לא הצטברות 7, 18 , באמצעות chloroquine לחסום היתוך עם lysosomes חסימה ולכן שיתוף לוקליזציה של קולטן עם lysosomes 2, 5, 6, 7, 18, באמצעות בקרות חיוביות כגון פגיעה המכוונת השנייה אנג שכותרתו lysosomes 2, ועל ידי בהשוואה אחרת גם מערכות הקולטן ליגנד -described כגון גורם גדילת transferrin או אפידרמיס 3 קולטנים מאותו המקור שלהם. פקד חיובי מעניין,lbeit artefactual, בניסויים שלנו הייתה תוצאה שנצפתה סמוך, untransfected, AT 1a R-GFP תאים שליליים. תאים אלה כנראה לקחו GFP שוחרר מתאי transfected וממוקדים אותו lysosomes איפה colocalization עם צבע פלואורסצנטי בלטה למדי (לא מוצג). colocalization זה, עם זאת, לא היה רגיש אנג השנייה כצפוי.

לסיכום, שיטות transfection, הדמיה, וניתוח הדימוי המוצג כאן לספק אמצעי שבאמצעותו הפנמה קולטן תאים subcellular שונים ניתן לייחס באופן כמותי בתוך תאים חיים לאורך זמן. השוואות יחסיות בין קולטנים שונים או קולטני מוטציה סלקטיבי אפשריות באשר קינטיקה ולוקליזציה subcellular כדי תאים ספציפיים. קשיים וממצאים אפשריים הקשורים בטכנולוגיה זו הם דנו. אף על פי כן, חיה-הדמיה מהר 3D בשילוב עם ניתוח תמונה ניתן להשתמש כדי למדוד ספיגת הקולט ומהירמעברים דרך הציטופלסמה מולקולרי תאים להגדרה. זו מגדירה את הבמה למדידת הבדלים הנובעים מוטציה של קולטן או יישום של אגוניסטים, יריבים, ומעכבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודת המחקר שהוצגה בכתב היד הזה נתמכה על ידי מענק R01 HL121456-01A1 קתרין זנדברג. עבודה זו נתמכה בנוסף לפי הזמינות של לייקה SP8 AOBS ב מיקרוסקופית והדמיה משותף משאבים (מצר) במרכז הרפואי של אוניברסיטת ג'ורג'טאון הממומן חלקית על ידי P30-CA051008 מן המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית של אמריקה. אנו בתודה להכיר סיוע הדמיה Leica SP8 ידי פיטר ג'ונסון, והשימוש של Zeiss LSM880 במעבדה של תומס Coate, החוג לביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג'טאון עם סיוע הדמיה מסופק על ידי אלמה ארנולד של Carl Zeiss מיקרוסקופית LLC. התוכן בכתב היד הזה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II (Ang II) Sigma-Aldrich A9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific 11960-044 Warm in 37 °C water bath before use 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442 Warm in 37 °C water bath before use
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Gibco -ThermoFisher Scientific 15140-122 Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco (life technologies) 25030-081 Warm in 37 °C water bath before use
Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells American Type Culture Collection (ATCC)  CRL-1573 Passage number 5 - 12
Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System Sigma-Aldrich 155409
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019 Store at 4 °C 
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco- ThermoFisher Scientific 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use
PBS 10x  Fisher BioReagents BP3994 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)  Gibco -ThermoFisher Scientific 31053-028 Warm in 37 °C water bath before use
LysoTracker Red DND-99 molecular probes -ThermoFisher Scientific L7528 Store aliquotes in dark at -20 °C . 
Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software PerkinElmer Visualization and Quantitation Modules For 3D image analysis of image stacks
Leica SP8 AOBS Leica Microsystems laser scanning confocal microscope For image collection
Zeiss LSM 880 Carl Zeiss laser scanning confocal microscope For image collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 121 הדמיה לחיות תאים מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר סוג אנגיוטנסין 1 הקולטן transfection endosomes שלפוחית ​​תאיים שלושה ניתוח ממדי התמונה lysosomes קולטנים הטרנסממברני חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת
הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kadam, P., McAllister, R., Urbach,… More

Kadam, P., McAllister, R., Urbach, J. S., Sandberg, K., Mueller, S. C. Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55177, doi:10.3791/55177 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter