Summary
Здесь мы приводим протокол к клеткам изображения, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок-меченый типа ангиотензина 1a рецепторы во время эндоцитоза, инициированные лечения ангиотензина II. Этот метод включает в себя маркировочные лизосом со вторым флуоресцентным маркером, а затем программное обеспечение, использующие для анализа совместной локализации рецептора и лизосом в трех измерениях с течением времени.
Abstract
Живых клеток используется для одновременного захвата покадровой изображения 1a рецепторов типа ангиотензина (AT 1a R) и внутриклеточным в трансфицированных человеческих эмбриональных почек-293 (НЕК) клеток после стимуляции ангиотензина II (Ang II). Клетки НЕК которые трансфицированы плазмидной ДНК , содержащей AT 1a R меченой с улучшенным зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Лизосомы идентифицированы с красным флуоресцентным красителем. Live-ячейки изображения, снятые на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии после стимуляции Ang II и анализировали с помощью программного обеспечения в трех измерениях (3D, вокселей) с течением времени. живых клеток позволяет расследование незаконного оборота рецептора и избегает путает, связанных с фиксацией, и в частности, утрата или артефактного перемещение EGFP-меченых мембранных рецепторов. Таким образом, как отдельные клетки отслеживаются через время, субклеточных локализации рецепторов можно визуализировать и измерить. Изображения должны быть приобретены sufficientlу быстро захватить быстрое перемещение везикул. Тем не менее, при более высоких скоростях обработки изображений, число фотонов, собранных уменьшается. Компромиссы также должны быть выполнены при выборе параметров обработки изображений, таких как размер воксела, чтобы получить скорость обработки изображений. Значительные применения живых клеток являются изучение незаконного оборота белка, миграцию, пролиферацию, клеточный цикл, апоптоз, взаимодействие аутофагии и белок-белок и динамику, чтобы назвать только некоторые из них.
Introduction
Общая цель состоит в том, чтобы получить количественные данные во времени и пространстве рецепторов колокализации с конкретными субклеточных органелл после обработки агонистом рецептора. Таким образом, ближайшая цель здесь заключается в захвате покадровой конфокальной образы лизосом и трансмембранного рецептора в эмбриональных клетках почки человека (HEK) после трансфекции и затем собрать и проанализировать данные изображений в 3D, чтобы количественно измерить доставку рецептора лизосом. Исследуя одновременно торговлей трансмембранного рецептора с лизосом или других органелл во время эндоцитоза при активации лиганда рецептора может помочь определить, как трансмембранный рецептор регулируется при физиологических и патофизиологических условиях.
AT 1a R предполагается разлагаться в лизосомах после обработки Ang II в модельных системах клеток, в первую очередь HEK293 1 , хотя большинство гееeptors в основном локализованы в мультивезикулярных эндосомами рециркуляции для последующего повторного использования в плазматическую мембрану в то время как основная масса лиганда, Ang II, деградирует в лизосомы 2, 3, 4, 5. Совсем недавно, Ли и др. продемонстрирована с использованием передачи Фёрстера энергии резонанса (FRET) и флуоресцентной микроскопии срок службы томографии (FLIM) методы , которые АТ 1a R колокализуется (на ~ 10 нм масштабе) с ЛАМПА1, лизосомального мембранный белок , предполагая , что по крайней мере некоторые из рецептора нацелен на и деградирует лизосомами 6. Эти авторы отметили , что ингибитор лизосомальная хлорохин заблокирован AT 1a R-LAMP1 ассоциации , которая согласуется с предыдущими сообщениями о том , что эффект хлорохина является блокирование слияния поздних эндосом или автофагосомы с лизосом. Другие косвенные подходы к определению AT 1a R Localization в лизосомах использовали bafilomycin, ингибитор лизосомальное вывести при наличии 1a R в лизосомах 3, 4, 5, 6, 7, 8.
живых клеток позволяет избежать потенциальных эффектов фиксации по объему клеток и потере / затемнением / перераспределения GFP-химерного рецептора. Предыдущие исследования полагались на фиксированные клетки , чтобы определить , колокализацию или смежности рецептора с лизосомы или с использованием живых клеток , меченных суррогатами связывающих рецептор , таких как β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-ячейки изображения других GPCRs с помощью конфокальной вращающийся диск или лазерной сканирующей точки конфÖçal микроскопы , оснащенные датчиками GaAsP или Hyd позволило исследователям наблюдать за интернализации и оборота рецепторов в отдельных клетках отображенных в Z-стеки по 30 с интервалом 9, 10. Тем не менее , даже если живая клетка Z-стеки быстро собираются, анализ может происходить только после выбора одной плоскости в пределах каждого стека, т.е. в 2D 10. В то время как это могло бы быть достаточно для изучения интернализированный GPCR или тирозин киназный рецептор в вопросе, 1а ЗС в п накапливается в пузырьках , которые изменяют размер и положение с течением времени и , таким образом , по своей природе более трудно адекватно образец с использованием репрезентативного единственного среза в каждый момент времени. Для того, чтобы тщательно определить маршрут меченый AT 1a R через ячейку и обнаруживать каждый субпопуляции везикулы , различающихся по размеру и положению, мы разработали метод для 3D визуализации и 3D - анализа , чтобы отслеживать эти изменения и быть используется в сочетании с маркировки различных внутриклеточных компартментах, таких, как лизосомы.
Исследователи могут использовать этот протокол для живых клеток изображений непосредственно визуализировать движение AT 1a R в клетку и ее передачи в субклеточных отсеков после стимуляции Ang II. Субклеточные отсеки помечены флуоресцентным белком химер или других флуоресцентных маркеров. Этот протокол также может быть использован в качестве первого подхода к локализации рецепторов в субклеточных органелл с минимальным разрешением 200 нм для того, чтобы сравнить мутировали против рецепторов дикого типа или для обнаружения изменений после фармакологического лечения. Техника доступна, так как оно может быть осуществлено на любом конфокальный микроскоп, оснащенный для живых клеток. Относительная простота этого подхода контрастирует с увеличением опыта и оборудования , необходимого для проведения FRET / FLIM / методы Брет, распознающие молекулярные взаимодействия 6,"Xref"> 11. Эти измерения определяют белок-белковых взаимодействий с высоким разрешением (~ 10 нм) и локализация в пределах внутриклеточных органелл выводится. Эти более продвинутые методы используются для наблюдения и дальнейшего определения молекулярных взаимодействий , представляющих интерес, а не прохождение через рецепторы субклеточных отсеков, и они непосредственно демонстрируют белок-белковых взаимодействий в определенное время и в местах внутри клетки 11. FLIM, метод FRET зависит от концентрации акцепторной, чаще всего выполняется на фиксированных образцов, так как получение изображений происходит медленнее. В противоположность этому, соотношение FRET обеспечивает быстрое и обработки изображений с высоким разрешением колокализацию взаимодействующих белков. Недостатком соотношения FRET является то , что визуализация использует с широким полем зрения эпи-флуоресценцию , чтобы получить скорость обработки изображений и включить всю клетку, что приводит к уменьшению разрешения и контрастности органелл 12. передача Биолюминесценция энергия резонанса (BRET) является еще однимпередовая техника , которая была применена к GPCRs для измерения приобретения молекулярной близости с течением времени 11. В этой технике белок флуорофор молекул рно разделены и каждая половина связана с одним из двух белков, о которых идет речь. Когда два нужных белков, связываются друг с другом, части химерного тега Сборку приобрести флуоресценции и повышенную флуоресценцию количественно с течением времени.
Здесь мы представляем простой метод для живых клеток изображений в сочетании с количественной оценки изображения для изучения торговли AT 1a R в клетке после стимуляции Ang II и потенциального изменения в доставке усвоены AT 1a R в лизосомы после стимуляции Ang II. Конечной использование этого метода заключается, чтобы охарактеризовать различия в мембранном сравнивающие дикого типа и мутантных рецепторов. Эти различия помогут определить механизм (ы) , которые влияют физиологические активности AT 1a R leadiнг регуляции кровяного давления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
День первый
1. Посев Cell
- Подготовить всю Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM). Добавьте 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-глутамина до 450 мл DMEM, чтобы сделать 500 мл полной среды DMEM, дополненной фетальной бычьей сыворотки (10%), пенициллин / стрептомицин (1%) и L-глутамин (1%).
- Семенной эмбриональной почки (НЕК) клетки человека, проход номер 6-11 на 50000 / лунку в 8 хорошо патроннике системы покровного стекла в полной DMEM.
- Поддерживать камерные скольжение при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч.
День второй
2. липосом Трансфекция
- Свеже сделать AT плазмиды и липосом решений 1a R-GFP с использованием стерильных условиях с кабинетом уровень биологической безопасности 2.
- Разбавляют 2 мкл плазмидной ДНК в 900 нг / мкл исходного раствора в 178 мкл восстановленного сыворотки сред для достижения Концентратион плазмидной ДНК приблизительно 10 нг / мкл.
- Развести 4,5 мкл липосом исходного раствора в 175,5 мкл восстановленного сыворотки сред для создания разбавлении 1:40 запаса.
- Добавьте раствора липосом плазмиде раствора и смешивают с использованием 1 мл пипетку, чтобы пипеткой вверх и вниз 20 раз, чтобы перемешать раствор для трансфекции.
- Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре (25-27 ° C).
- В то время как эта смесь инкубирования, удалить носитель медленно с 1 мл пипетки и медленно добавляют 400 мкл 1х фосфатно-буферным раствором (PBS), который предварительно нагревают до 37 ° С.
- Аккуратно удалите PBS и заменить 200 мкл / лунку восстановленного сыворотки средства массовой предварительно подогретой до 37 ° С.
Примечание: Будьте осторожны, на всех этапах при мытье клеток, чтобы избежать отряд клеток от покровного из-за огромного стресса, вызванного пипеткой. - Поддерживать клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 30 мин.
- ОднаждыИнкубационный период заканчивается, добавляют 80 мкл смеси для трансфекции в каждую лунку и инкубировать клетки в течение 4,0-4,5 ч , но не более , чем 5 ч при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
- После окончания периода трансфекции инкубации завершена, медленно извлеките носитель из камер с использованием 1 мл пипетку и осторожно заменить 300 мкл / лунку полной DMEM и инкубировать клетки в течение 24 ч при температуре 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 ,
День третий
3. Сыворотка Голодание
- Извлеките носитель осторожно с помощью 1 мл пипетку и медленно заменить 300 мкл не содержащей сыворотки DMEM без фенолового красного.
- Поддерживать камеру при температуре 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 10-12 ч.
День четвертый
4. Живая съемка Cell
- Пятно внутриклеточные отсеки (лизосом в данном случае).
- аборигенУТ 30 мин до получения изображения лизосом в клетках, добавьте 22,5 мкл из 1 мкМ флуоресцентного красителя маточного раствора (0,5 мкл 1 мМ флуоресцентный краситель разводили в 499,5 мкл не содержащей сыворотки DMEM без фенолового красного), в каждую лунку для концентрации окончательного красителя 75 нМ.
- Выдержите в течение 25-30 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 , а затем осторожно удалить краситель и медленно добавить 300 мкл свежей бессывороточной DMEM без фенолового красного.
- Подготовьте микроскоп для работы с изображениями.
- Отрегулируйте ступень вниз, чтобы избежать повреждения объектива при запуске автоматизированного микроскопа.
- Включите питание микроскопа, питание сканера, мощности лазера, а затем лазерного излучения, и, наконец, металлогалогенные лампы для визуального наблюдения (смотрите инструкции производителя конфокальной микроскопии).
- Откройте программу обработки изображений и в свою очередь программного обеспечения на аргон (488 нм) лазера и мощностью до 30-50%. Обратите внимание, что сила зависит отвозраст лазера. В экспериментах имеет решающее значение для поддержания постоянной настройки.
- Включите красный излучающий лазер (например , 568 нм или 594 нм).
- Настройка формата изображения 12-битной глубиной.
- Установите крошечное отверстие для аргона лазерной линии 488 нм и для 568 нм или 594 нм лазер с 1 Эйри диска устройства. Если GFP очень тускло, используйте установку 2-х дисковых блоков Эйри, но совпадают каналы соответствующим образом.
- При использовании дихроичных наборов фильтров, выберите соответствующие длины волн излучения для GFP и флуоресцентного красителя. Или установите длину волны излучения (Em) при 499-580 нм для GFP и Em 599 - 680 нм для красного светоизлучающего флуоресцентного красителя.
- Убедитесь, что протечка и кроссовер не происходит. Выключите каждый лазер в свою очередь, и проверьте оба канала выбросов для каждой из них. Когда лазер Аргон выключен, зеленая эмиссия должна быть равна нулю. Когда зеленый излучающий лазер выключен, красный канал излучения должен быть равен нулю.
Примечание: Самый безопасный способ заключается в изображении каждого в отдельные треки (sequренциальный). - Включите канал светлого при желании. Избегайте дифференциальной контрастности изображений (DIC), так как это может исказить измерения колокализационные.
- Для живого изображения, выберите линию, последовательный, а не последовательных кадров.
- Выберите ячейки для визуализации.
- Использование цели 1,4 числовая апертура (NA), таких, как цель 63X / 1.4 Н.А. нефти в клетках изображение (или 40X / 1.4 NA). Сосредоточьте цели и добавить каплю высокой вязкости, низкой аутофлуоресценция иммерсионного масла на цель.
- Перенести камеру с трансфектированных клеток из инкубатора на столик микроскопа. Будьте осторожны, чтобы держать слайды плоские и убедитесь, что камера хорошо сидит и удерживается от движения.
- Перемещение цели вверх, пока капля нефти не коснется нижней части слайда; право фокальной плоскости находится рядом с этой позиции. В автоматических микроскопов, сохранить эту позицию, а также опущенное положение использовать для бэрainder эксперимента формирования изображения для облегчения замены образцов.
- Выберите тусклые клетки. Клетки сверхэкспрессией AT 1a R-GFP будет неправильно направлять рецептор в клетке и нарушить нормальную функцию.
- Убедитесь, что контур ячейки, определяемый плазматической мембраной, видна и предпочтительно не перекрывается с другими клетками.
- Сосредотачиваете ячейку в поле зрения.
- Переключение в режим конфокальной.
- Выберите режим быстрого формирования изображения. С одной стороны, на регулировки фокуса, а другой на контроле XY этапе, сосредотачиваете ячейку интереса визуализируется на мониторе.
- Убедитесь, что ячейка, представляющая интерес, хорошо разнесены и его дно или брюшная сторона сопоставляются в тесном контакте с покровным, сосредоточив внимание вверх и вниз через ячейку.
- Установите параметры г-стадии к изображению ячейку в 3D.
- Нажмите кнопку On для верхней Z-стека и нижнего диалога (или его эквивалент) и сосредоточить внимание на нижней части CELL затем нажмите "начать". Затем, фокус на верхней части ячейки и нажмите "конца". Перепроверьте, что вся ячейка включена в Z-стека.
- Установить размер Z-шага до 1,0 мкм.
- Настройка параметров изображения.
- Выбор масштабирования 2, в зависимости от объектива, так что конечный размер пиксела составляет около 0,279 мкм х 0,279 мкм до 0,14 мкм х 0,14 мкм в измерении XY.
- Для НЕК клеток в этом эксперименте, установить скорость сканирования приблизительно 1 мкс на воксела и выберите 2 усреднение или 2 накоплениями от линии, в зависимости от яркости клеток.
- Регулировка интенсивности лазерного излучения и получить для визуализации GFP и флуоресцентный краситель. В общем, counterstains будет намного более ярким, и поэтому детектор ФЭУ (ФЭУ) и не Галлий арсенид фосфид (Gaasp) или гибридные детекторы (HYD) следует использовать для этого второго цветового канала в то время как ГБПБ и HYD детекторы необходимы для канала GFP. Если HyD или GaAsP обнаружитьОРР используются для флуоресцентного красителя, оказывают осторожность и начать с лазером при чрезвычайно низкой мощности.
- Установить продолжительность сканирования и частоты сканирования, например, через каждые 30-60 сек в течение 25 мин или дольше , чтобы увидеть нацеливание AT 1a R-GFP в лизосомы.
- Установите автофокусировку для поддержания стабильности фокусного плоскости с течением времени.
- Начните эксперимент визуализации.
- Приготовьте заранее 100x Ang II запас на уровне 5 мкг / мкл (4,7793 мм) и добавляют 2,1 мкл этого 998 мкл среды (10 мкМ).
- Начинают стимуляции лигандом путем добавления 3 мкл 100-кратного исходного раствора лиганда (Ang II) в лунку, содержащую 300 мкл непосредственно перед формирующим изображение (конечная концентрация 100 нМ).
- Нажмите кнопку Пуск и изображение в 3D в течение желаемого времени и частоты.
- Прежде чем закончить работу в микроскоп, собрать Z-стек для последующего использования в фоновом режиме во время анализа вычитанием. В режиме счета фотонов, это ненеобходимо, так как фон, по существу 0. При освещении включается и все другие условия формирования изображения так же, но без пробы брать образец изображения. См вычитание фона (ниже) при анализе.
День пятый
Анализ 5. Изображение
- Экспорт изображений в формате TIFF.
- Щелкните правой кнопкой мыши на имени файла изображения, чтобы увидеть меню и выберите Экспортировать или нажмите File | Экспорт | Импортировать.
- Экспорт в формате TIFF для последующего анализа убедившись, что экспортировать RAW, 12-разрядные данные [не "Красный Синий Зеленый '(RGB), используемый для преобразования качества публикации изображений]. Не экспортировать в формат JPEG.
- Обратите внимание, X, Y, Z размеры воксельных и размер Z-шага для последующего использования во время анализа изображений. Например, используя 40X / 1.4. NA линзы объектива эти значения могут быть 0,138 мкм х мкм с 1 мкм Z-размер шага 0,138 (см данные в разделе результатов репрезентативной).
- <сильный> Создание стека изображений для анализа.
- Открыть изображение Количественное программного обеспечения (Рисунок 2)
- Используйте "Действие | Создать новый | Изображения из выбранной последовательности" , чтобы создать единый файл образа из импортированных одиночных последовательностей (рисунок 2, стрелка # 1).
- Введите число каналов, число Z-секций, а число моментов времени.
- В зависимости от структуры * .tiff файлов выберите, например, каналы, Z-плоскости, и моменты времени как порядка плоскостей изображения. Убедитесь, что окончательный стек изображения правильно представляет цветовые каналы, Z-стек, а временные точки исходного изображения.
- Выберите имя изображения (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2). Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и / или поле изображения, а из опций в нижней части списка выберите "Свойства". В пикселе мкм для (X) (Y) и (Z) размера, введите правильные изображения свойства отмеченных выше.
- Вычитание фона до анализа изображений. Коррекция фона может быть выполнена в любом программном обеспечении для анализа изображений. Вычтите фон , используя один из двух вариантов.
- Вариант 1: Выберите "Действие | Создать новый | вычитание фона" (рисунок 2, стрелка # 1). Используйте полученные фоновое изображение, полученное в конце сеанса визуализации, описанной выше, в качестве изображения "Dark Reference" в разделе "Инструменты | Вычитание фона".
- Вариант 2: Проверьте самые темные участки в изображениях, где нет образца, найти среднюю или максимальную яркость пикселей в этом регионе, игнорируя любые необычно яркие пиксели, которые могут быть поддельной флуорофор, случайно яркий пиксель, или некоторые другие явления. Выберите "Действия | Создать новый | Фон Вычитание". Используйте эту яркость пикселя (сделанный отрицательным) в качестве смещения.
- Проверьте для регистрации цвета и при необходимости откорректировать.
- Произведите коррекцию регистрации, выбрав "Действия | Создать новый | Регистрация Коррекция" (Рисунок 2, стрелка # 1) и использовать диалоговое окно , чтобы внести коррективы. После завершения новый пункт папка появится под названием "коррекции регистрации".
- Нанести регистрацию на одну или несколько изображений , представляющих интерес, щелкнув имя изображения (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2) , а затем выбрав пункт "Tools | правильной регистрации" (кнопка инструмента прилегающую к действиям).
- Выберите изображение (рисунок 2, выделенный имя файла слева, стрелка # 2) и нарисуйте область интереса (ROI) вокруг одной ячейки с помощью инструмента фристайл область (рисунок 2, 3 стрелка #). Используйте режим расширенной фокусировки (2D, выпадающее меню на левом верхнем углу), чтобы наблюдать клетку в качестве инструмента обрезки работает только в 2D-визуализации.
- Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "Crop к выделению" и новый элемент изображения формируется.
- Выберите обрезанной ячейку, щелкнув на его имени , а затем выберите вкладку "Измерение" выше (рисунок 2, стрелка # 4).
- Для того, чтобы измерить и определить усвоенные везикулы для GFP, перетащить "Найти объекты" под "Поиск" (рисунок 2, стрелка 5 #) в поле последовательности (рисунок 2, 6 стрелка #).
- Набор "Поиск объектов" Канал к каналу GFP.
- Открыть настройки (значок колеса в диалоговом окне, стрелка # 6) и установите4; Порог с помощью: "СД и" нижний предел "до 6. Установить" Минимальный размер объекта "до 3 мкм 0.
ПРИМЕЧАНИЕ: SD нижний предел будет зависеть от индивидуальных экспериментов. Визуальное подтверждение , что правильные объекты порогами производится путем изучения различных временных точек (рисунок 2, стрелка 7 #). "Измерение | Обратная связь Параметры" диалоговое окно используется для выбора пути , что выбранные порогами объекты визуализируются (рисунок 2, стрелка # 8). - Нажмите кнопку "Measure" в разделе "Поиск объектов" диалоговое окно (Рисунок 2 стрелка # 6) и выбрать каналы и тип измерений. Как правило, выберите "Все каналы" и "интенсивность и объем измерений".
- Для того, чтобы определить пороговую и фильтры для идентификации всей клетки и измерить суммарную интенсивность GFP, повторите вышеуказанные шаги (5.5.4 - 5.5.8), используя следующие параметры: SD 0 и "Минимальный размер объекта" до 2 мкм; м 3 во втором диалоговом окне «Поиск объектов» для идентификации клеток с помощью GFP (Рисунок 2, стрелка # 9)
- Перетащите "Фильтр населения" в разделе "Фильтрация" в поле последовательности под населения 2 (второй "Поиск объектов" окно, рисунок 2, стрелка # 9). Выберите "Объем (мкм 3> 100).
- Визуально убедиться, что только один объект идентифицируется. Вся клетка должна быть порогами и все остальные объекты отфильтровывают. Параметр "Фильтр" (ей), возможно, потребуется корректировка, если клетка мала, например.
- После того, как измерение было стандартизировано, сохранить протокол, щелкнув правой кнопкой мыши на изображение и выберите пункт "Сохранить протокол" с целью повторного использования ( "Восстановить протокол"). Протокол также могут быть экспортированы, чтобы обеспечить запись в том же подкаталоге, что и изображение.
- Перейдите к разделу "Make Измерение", выбрав "Измерения | Сделать измерения Пункт" (Рисунок 2
- Введите правильное название измерения (скопировать пасту с изображения удобно) и анализа кода или даты (а полезное дополнение для ведения учета) и выберите "Все" временные точки. Новый элемент рабочего листа будет создан под изображением. Держите имена файлов кратким.
- Нажмите на имя файла рабочего листа и выберите вкладку "Анализ". Определить, если насыщенными Вокселы присутствуют сначала выбрав "ограничивать анализ:" выберите Население 2 (ячейка).
- Щелкните правой кнопкой мыши на поле под "вкладке Анализ" и в диалоговом окне в разделе "Анализ этих данных:" выберите "Max ([GFP цветового канала])"; под "суммированы:" выберите "Среднее ([GFP цвет канала]", а также в разделе "Организация данных с помощью:" и "строка" выберите "временной точки" и интерфейс командной строкиск "OK".
Примечание: Если данные содержат насыщенные пиксели (например , 65536 для 16-бит или 4,096 для 12-бит), анализ не будет точным (он будет недооценивать содержание везикул). Игнорируйте эту ячейку для анализа. Если не насыщен, переходите к следующему шагу. - Далее, на вкладке "Raw", а затем на вкладке "Анализ" и щелкнув правой кнопкой мыши данные найти "ограничивать анализ:", а затем выбрать для населения 1 везикулы или населения 2 для всей клетки.
- В разделе "Анализ этих данных:" выберите "Sum" (цветового канала GFP); под "суммированы:" выберите "Сумма"; и, в разделе "Организация данных с помощью:" и "строка" выберите "временной точки" или "относительного времени", а затем нажмите кнопку "OK". Анализ выборы могут быть сохранены и использованы повторно.
- Выбрать и копировать / вставить непосредственно из изображения программное обеспечение для количественного определения пустой таблицы или экспортировать данные электронной таблицы, щелкнув правой кнопкой на DATа и выбора сохранить как CSV-файл. Измерение интенсивности вся ячейка будет включена с измерениями каждого пузырьком в популяции, поэтому обязательно, чтобы идентифицировать и отделить его от везикул.
ПРИМЕЧАНИЕ: После построения данных, увеличение общей флуоресценции GFP, содержащаяся в пузырьках быстро возрастает. Фотообесцвечивания, если это происходит, определяется как потеря общей интенсивности клеток GFP с течением времени.
- В Поиск объектов (население 1), установите "Найти объекты" канал для красного канала и значком колеса в этом диалоговом окне , указанном стрелкой # 6 (рисунок 2) набор "Порог с помощью:" СД и "нижнего предела" в 6. Установить "Минимальный размер объекта" до 0,017 мкм 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: SD нижний предел будет зависеть от индивидуальных экспериментов. Визуальное подтверждение того, что правильные объекты в настоящее время порогами должны быть сделаны экзаменаоцен- ками разные моменты времени. "Измерение | Обратная связь Параметры" диалоговое окно используется для выбора пути , что выбранные порогами объекты визуализируются (рисунок 2, стрелка # 8). - Нажмите кнопку "Measure" в "Найти" Объекты "диалогового окна (Рисунок 2 стрелка # 6) и выбрать каналы и типы измерений. Как правило," Все каналы "и" Интенсивность и Том измерения "выбираются.
- Для населения 2, использовать настройки , идентичный используемому для идентификации всей трансфицированной клетки экспрессируют по 1a R-GFP (5.5.9).
- Если несколько клеток (в том числе нетрансфецированной клеток с флуоресцентным красителем-положительными везикулы) присутствуют, кадрирование ячейку на первом этапе анализа имеет решающее значение. В качестве альтернативы, использование "полочкам" следует использовать для ограничения идентификации лизосом внутри трансформированных клеток , экспрессирующих AT 1a R-GFP. Лизосомы должны быть идентифицированы только в пределах GFP клетки ине из близлежащих, нетрансфецированной клеток.
- Анализ и экспорт данных, как описано выше.
Примечание: Пример из порогами клеток и везикул показана на рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом представительном наборе экспериментов клетки НЕК трансфицируют типа ангиотензиновую 1a рецептора (AT 1a R-GFP) , конструкцию (E1,2,3-АТ 1a R) , клонированного в плазмиду pEGFP-N2 13. Время покадровой изображения НЕК были приобретены и играли в кино (см живых изображений сотовый 1 и Живая съемка Cell 2 фильмов). Фильмы и фотоизображение показывают , что после того, как стимуляции лигандом, АТ 1a R-EGFPs локализованы преимущественно в плазматической мембране, но с добавлением Ang II этих рецепторов интернализовать в течение 2,5 мин , чтобы сформировать яркие везикулы и в последующие моменты времени группироваться в более крупных везикул перинуклеарном зона (фигуры 4B, 5 и 6А, живых изображений сотовый 2).
Количественное суммарной интенсивности клеток GFP и общей интенсивности пузырек GFP для ячейки на рисунке 5 рrovide иллюстрацией осложнений , присущие когда Ang II индуцирует рассердило и изменения формы клеток сразу после стимуляции (рис 5A, стрелка при 0 мин после Ang II, верхний ряд, оранжевый порогами объекты). В более поздние времена, локализация GFP-содержащих везикул в перинуклеарном кластере также препятствует (рис 5A, красная стрелка на 29,5 мин). Хотя все объекты должны быть включены в общую измерения интенсивности клеток GFP, оборками , должны быть исключены из измерений везикул , как они представляют собой плазменную мембрану при 1a R-GFP. В противоположность этому , кластерные перинуклеарные везикулы не следует исключать из измерения везикул (последний наблюдаются в области клетки , заключенной в красных кругах на рисунке 5А, стрелка на 29,5 мин после Ang II, нижний ряд). Попытки достичь этого путем фильтрации размера (более или менее 7 мкм 3) не было полезным , поскольку оно не может различить оборками и кластерный Vesicles (рис 5А и 5В, не сравнить Filter> 7, фильтр <7, и без фильтра). Возможной альтернативой было бы рисовать области интереса (ROI), охватывающий цитоплазматической части клетки, но исключая трепал края и периметр клетки. В конечном счете, эта ячейка не будет включена в количественных результатов, потому что были насыщенные пиксели GFP настоящего.
Второй репрезентативный пример показан на фиг.6А , иллюстрирующую ход времени , в котором автофокусировка не использовалась. Усвоены GFP показан как процент общего клеточного GFP (Фиг.6В). Точки время до красной стрелкой на 3 мин вводят в заблуждение, как только часть клетки была в объеме формирования изображения, но 3 мин после Ang II Кроме того, в фокальной плоскости restabilized. Общая GFP в клетке показывает , что эта клетка не photobleach заметно с течением времени (6С ). Между 3 и приблизительно 12 мин, процент GFP интенсивности в везикулы увеличивается затем выравнивается (рис 6б). Далее, лизосомы , идентифицированные с помощью флуоресцентного красителя были использованы для идентификации трансформирования в пределах трансформированных клеток , которые затем подвергали количественному на сумму интенсивности GFP (рис 6D). Через три минуты, интенсивность АТ 1a R-GFP в красных идентифицирующих лизосом не изменяется с течением времени (рис 3D, N = 5, среднее ± стандартная ошибка среднего). Таким образом , нет никаких видимых увеличение поставки AT 1a R-GFPs к лизосом в течение 24 минут после введения Ang II.
Рисунок 1: Насыщенные Пиксели Выявленные в справочной таблицы (LUT). Красная стрелка указывает на насыщенные пиксели, показанные синим цветом.т = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор изображения квантификации программного обеспечения. Ключевые элементы обозначены цифрами и обсуждаются в тексте методов. 1) пункт Действие, 2) Выбранные изображения, 3) от руки ROI инструмент, 4) Вкладка Измерения, 5) Найти объекты, 6) Население 1 Поиск объектов диалоговое окно, 7) Стрелка активации Промежуток времени фильма, 8) Измерения пункт, 9) Второй поиск диалоговое окно, содержащее команду Filter Population Objects. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Цвет коррекции регистрации. Изображения с корректировали иисправлена регистрация пикселей показываются вместе с вкладышами нескольких colocalizing везикул , содержащих AT 1a R-GFP. Красные пиксели сдвигаются на 1 пиксель влево в XY плоскости без коррекции изображения. Врезках в штучной упаковке областей при большем увеличении. Шкала бар = 3,3 мкм, размеры вокселей = 0,138 х 0,138 х 3 мкм 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Иллюстрация Thresholding для идентификации GFP- и флуоресцентным красителем , содержащие везикулы и GFP-целые клетки. (A) Определение целых клеток с использованием AT 1a R-GFP (GFP, верхний ряд) и порогами GFP для всей клетки (идентификатор соты, нижний ряд) показаны на 0 и 2,5 мин после Ang II дополнение. Белые коробки указывают на входыЕТ области , показанные в формуле (В) и (С). (В) по 1a R-GFPs сравниваются при 0 и 2. 5 мин после добавления Ang II в одиночных цветных изображениях (верхний ряд). Пузырьки были определены пороговым показаны в нижнем ряду (ID Ves, фиолетовый). (C) Две цветные изображения (AT 1a R-GFP / флуоресцентного красителя) показаны при 0 и 2,5 мин после Ang II добавления. Лизосомы были определены пороговым показаны красными контурами. Шкала бар = 7,0 мкм, размеры вокселей = 0,114 х 0,114 х 3 мкм 1.4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Иллюстрация действию оборками и кластерном везикулы по измерению Интернализованная GFP рецепторам. (A) Т 1a R-GFP , в Ang II обработанных клеток на 0 (верхний ряд) и 2,5 мин (нижний ряд) показаны в трех экспериментах , фильтрации , когда в первом столбце был применен фильтр , чтобы выбрать только те объекты , больше , чем 7 мкм 3, в второй столбец , чтобы выбрать объекты менее 7 мкм 3, а в третьей колонке не был использован ни один фильтр. Уровень Thresholding была постоянной во всех трех. Стрелки указывают на большие порогами объекты, круги указывают область цитоплазмы, содержащей перинуклеарные везикул в более поздние моменты времени. Порогами районы оранжевого цвета. (B) Количественная суммарной интенсивности GFP в пузырьках показана для порогами областей с или без размера фильтрации (по столбцам A) в двух временных точках (по строкам в). Размеры воксельные были 0,138 х 0,138 х 3 мкм 1. Шкала бар = 5,6 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Отслеживание АТ1 R- GFP интернализации и потенциальных Локализация в лизосомах. (A) Пять выбранных временных точек из AT 1a R-GFP с Lysotracker Красным показаны из сопроводительной фильма (Живая клетка изображений 1 фильм) при 0, 3, 6, 9 и 12 мин пост Ang II. Сетка представляет собой единицу масштаб мкм 3 6,56, размеры вокселей были 0,297 х 0,297 х 3 мкм 1,2, а Z-шаг = 1,2 мкм. (Б) Участок процентах от общего количества GFP в пузырьках с течением времени показывает быстрое интернализации АТ 1a R-GFP. (C) участок общей GFP в камере с течением времени показывает , что относительно немного фотообесцвечивание происходило в течение 24 мин визуализации. (D) Лизосомы были определены путем выявления Lysotracker красных положительных везикулы. Суммарная интенсивность GFP в флuorescent красителя положительным пузырек трансформирования измеряли в каждый момент времени (нормализованная к первой точке времени без компенсации за фотообесцвечивания, которые независимо друг от друга не измеренной). (C - D) До стрелки, измерения не действует , так как фокус должен сместиться. N = 5, среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: живых изображений сотовый 1: (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) HEK клетки трансфицированных AT 1a R-GFP изображался каждые 1 мин в течение 24 мин (25 кадров) после добавления 100 нМ Ang II. Фильм был приобретен с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с планом-Apochromна 63X / 1.4 цели НС нефти, размеры вокселей из 0,279 х 0,279 х 3 мкм 1.2; и 5 ломтиков в общей толщиной 4,794 мкм изображаемого на 3,20 мкс / пиксель. Скорость фильм 2 кадра / сек. Единица = 6,56 мкм.
Фильм 2: живых изображений сотовый 2: (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) HEK клетки трансфицированных AT 1a R-GFP изображался каждые 30 секунд в течение 25 мин (51 кадров) после добавления 100 нМ Ang II. Фильм был приобретен с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 40X / 1.4 цели нефти План-Apochromat НС. Размеры воксельные были 0,11 х 0,11 х 3 мкм 1.4. 7 ломтиков в общей толщиной 8,4 мкм были обследованы на 3,72 с / кадра. Скорость фильм 3 кадра / сек. Шкала бар = 7 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предварительные эксперименты , представленные здесь , показывают , что в течение довольно короткого времени течение 24 мин, без заметного изменения в поставке AT 1a R-GFP в лизосомах не произошло. В общем, поставка интернализированных рецепторов к лизосом может произойти уже в 15-20 мин. Этот эксперимент согласуется с гипотезой о том , что основная масса интернализированный AT 1a R является мишенью для больших, околоядерных эндосомами. Доказательства того, что по крайней мере некоторые AT 1a R поступает в лизосомы была продемонстрирована Ли и др. , Который сравнил клетки через 5 мин и 30 мин после обработки Ang II и обнаружили значительное колокализации LAMP1 с AT 1a R на 30 , но не 5 минут 6.
В данной статье дается подробное описание клеточного препарата, визуализации и анализа этапов и обсуждаются многие присущие подводные камни в этой передовой метод визуализации. Этот метод зависит от критических шагов, обсуждаемых ниже.
Так как хорошее здоровье клеток имеет решающее значение для любого эксперимента живой визуализации клеток, важно избегать использования клеток вне прохода 11 из-за изменений в темпах роста и эффективности трансфекции при более высоких пассажей. Для поддержания здоровых клеток в течение всего эксперимента, инкубационный период трансфекции смеси с клетками не должна превышать 5 ч, поскольку липосома раствор является токсичным для клеток свидетельствует увеличение мембранного блеббинга. Температура, влажность и контроль CO 2 имеет большое значение , прежде чем, а также во время съемки. Сугробы температуры во время формирования изображения может привести к относительно крупных г-раздел заносы и потерю устойчивости фокальной плоскости. Поэтому особую осторожность рекомендуется при добавлении Ang II к клеткам во время съемки, чтобы гарантировать, что фокальная плоскость точно поддерживается.
обработки изображений
Преимущество живых клеток над иммунным окрашиванием с использованием фиксированных клеток являетсячто условия , в естественных условиях можно тщательно контролировать и артефакты , связанные с фиксированными клетками можно избежать. Тем не менее, изображения живых клеток может быть сложной задачей для оптимизации клеточных процессов, которые чрезвычайно быстро, как интернализации рецепторов. Скорость инструмента и необходимость избегать фотообесцвечивания ограничить выбор событий, которые могут быть изучены. Каждый эксперимент визуализации может потребовать определенных вариантов, которые будут сделаны по некоторым параметрам и компромиссов в других; примеры выбора в размер пикселя, накопление линии, коэффициент увеличения, и скорость сканирования, чтобы получить хорошие качественные данные для анализа и избежать передискретизации в то же время. Принципиальные решения этих факторов зависит от баланса между необходимостью получения адекватного размера пикселя различать отдельные везикулы и необходимость получения достаточного временного разрешения событий, которые происходят. Таким образом, некоторые компромиссы должны быть сделаны для того, чтобы получить информацию достаточно быстро, как клетка начинает усваивать GFP-меченый рецептор. В нашемслучай, хотя современное программное обеспечение конфокальной может предложить оптимальный размер пикселя, наши эксперименты использовали значение меньше оптимального размера пикселя в соответствии с уравнением Найквиста 14. Оптимальный выбор настроек для других экспериментов, также будет зависеть от того, насколько ярко-клетки, так как больший размер пикселя позволит более быстрое накопление фотонов, позволяя балансировать с более длительным временем вокселей опережения, чтобы собрать больше фотонов.
Для анализа, чтобы быть успешным, формирования изображения живых клеток также критически требует точного фокусного стабилизации во время съемки в заданный промежуток времени. Координационные сдвиги, а также неспособность изображения всей клетки может иметь огромное влияние на развитие количественной оценки интернализации рецепторов, а также суммарную интенсивность клеточного GFP. Решение этой проблемы координационных сдвигов во ранних временных точках изображения после добавления Ang II была предоставлена софокусных производителями в виде растворов автофокусировкой при этом покровное interferomметрия с ИК лазером в сочетании с обратной связью для автоматического управления фокусом используется для поддержания относительного расстояния от объектива до поверхности покровного , идентифицированного ИК отражения (например , Определенная фокусировки или Адаптивное управление фокусировкой). Оставшаяся проблема микроскописта затем определить правильный Z-диапазон, так что, несмотря на изменения формы, вся клетка остается в объеме формирования изображения. Температура является еще одним важным фактором для поддержания позиции фокуса / Z во время начальных моменты времени после добавления Ang II. Температура объектива, а также камера живой визуализации клеток должна поддерживаться на уровне 37 ° С в течение всего эксперимента.
Другим важным компонентом визуализации, является получение изображений в количественном отношении. Если детектор HyD используется в режиме счета фотонов, параметры визуализации должны быть установлены таким образом, что фотон нагон не происходит. Для ФЭУ и других детекторов, изображения не должны содержать насыщенные пиксели (вокселей). В обоих случаях, спезированных справочной таблицы (LUT) может быть использован для визуализации присутствие насыщенных пикселей и, конечно же, если они присутствуют, то микроскописта должно уменьшить интенсивность лазерного излучения и / или усиления.
Анализ
Хотя подход , описанный здесь применяется к АТ 1a R - рецептора и его колокализации с лизосомы, он применим к экспериментам , в которых относительное количество рецептора в субклеточных отсеков меченного с различными флуоресцентными тегов на вопрос. Если цель состоит в том, чтобы измерить, поддерживают ли рецептор перемещается в органеллы, а затем с помощью коэффициента колокализацию Пирсона с маркером для органелл является проблематичным. Каждый пиксель, где идентифицируется органеллы будет иметь большое количество маркера так, что один из коэффициентов будет всегда около 100%. Таким образом, измерения колокализационные может ввести в заблуждение. С другой стороны, измерение процента рецептора на органеллы по отношению к общей сумме РЕЦЭПтор является гораздо более информативным и яснее интерпретировать. Случай , в котором белок колокализация мог бы лучше всего быть описан с использованием коэффициента корреляции Пирсона будет на 1a R - рецептором и ЛАМПА1, взаимодействие которых было документально подтверждено, хотя и в более сложных колокализационные подход, а именно FLIM / FRET 6.
Использование 3D - визуализации является более точным , чем с использованием репрезентативных срезов клеток с анализом в 2D из - за клеточных движений, которые неизбежны во время хода (Живая съемка 2 фильма). Как видно из изображений живых клеток , показанных на рисунках 3, 4В и 5А , что рецептор главным образом локализованы в плазматической мембране, тем не менее, в течение нескольких минут воздействия на Ang II Локализирует до ярких пятен на мембране и небольшой везикулы , прилегающей к мембране, вероятно , покрытые ямах и ранние эндосомы (цифры 4B 4C). При продолжении прогрессии времени, везикулы перемещаться через клетку , накапливаясь в больших пузырьках , прилежащую к ядру , которые были описаны как мультивезикулярные эндосомах (МВЭС, рисунки 1, 5А) 3, 15. Один срез через ячейку с течением времени будет искажать процесс интернализации и искажать истинные события, особенно если срез не включает поверхность клеток в ранние времена, и МВЭС в последующие моменты времени.
В этом исследовании два подхода к анализу изображений может свести к минимуму эффекты фотообесцвечивание GFP, а также флуоресцентным красителем на количественный результат. Поскольку клетки photobleach (хотя и в ограниченной степени), относительная яркость интернализированных везикул по отношению к интенсивности всей клетки сохраняется, если предположить фотообесцвечивание происходит равномерно. Флуоресцентный краситель-позитивные пузырьки также легко идентифицированы путем выбора стандартного deviatioп среднего варианта интенсивности флуоресценции для пороговой яркие усвоенные везикулы. Это отличает их от фона даже как весь уровень флуоресценции снижается. Таким образом, наши измерения не были чувствительны к воздействию скромных фотообесцвечивания. Тем не менее, сильные фотообесцвечивание потери, такие как 50% от интенсивности клеток с течением времени может иметь большее влияние на количественные результаты. В качестве альтернативы, эффекты фотообесцвечиванию могут быть измерены независимо друг от друга в контрольных экспериментах при отсутствии Ang II в случае АТ 1a R-GFP или в соседних нетрансфецированной клеток в случае флуоресцентных красителей. Эффекты фотообесцвечиванию может затем быть учтены в процессе анализа.
Дополнительные вопросы
В последнее время, клеточные биологи провели критическую оценку и модификацию флуоресцирующих белков для мониторинга мембранном в клетках, чтобы избежать артефактов, генерируемых самим флуоресцентного белка, независимо от белка Beinг помечено. Различные флуоресцентные белки уязвимы для взаимодействия с местным микросреда что приводит к осаждению белка или сшиванием на основе их рКа- е и наличием аминокислоты цистеина, соответственно 16. Другим результатом этих взаимодействий может включать в себя потерю флуоресценции 16. Все эти артефакты влияют на количественные измерения трафика. Константини и др. сгенерировали мономерные флуоресцентные белки для визуализации , которые испытывают недостаток цистеина , чтобы исключить возможные артефакты 16. Таким образом, в зависимости от цели проведения экспериментов с изображениями, переход от EGFP (не мономерного) к мономерной, цистеин в свободной форме было бы выгодно для изучения кислотных и / или снижения везикулярного микросреды. Другим примером может быть их улучшена утилита для FRAP или FRET эксперименты, в которых мультимеризация и сшивание будет воздействовать диффузии белка и белок-белковых взаимодействий.
Другой потенциальный артефакт следует учитывать при визуализации с помощью лизосом Lysotracker Красный вместе с GFP слитых белков является то , что Lysotracker Red было показано , чтобы быть способным фотоконверсии к зеленому 17. Авторы рекомендуют использование эпифлуоресцентной освещения быть сведено к минимуму, обсуждать вхождения этого артефакта, и ссылаться на успешных примеров колокализации с помощью этого реагента. Кроме того, другие маркеры лизосомах также могут быть использованы для проверки результатов колокализационные, например, меченый ЛАМПА1 6.
В будущем, чувствительность и специфичность этого анализа могут быть исследованы на рецептор нацеливание в лизосомы, а также других субклеточных отсеков с использованием ингибиторов везикул транспорта и / или слияния, путем ингибирования лизосом подкисление с помощью bafilomycin , чтобы блокировать деградацию , но не накопление 7, 18 , с помощью хлорохин , чтобы блокировать слияние с лизосомы , следовательно , блокирующих совместной локализации рецептора с лизосомами 2, 5, 6, 7, 18, с использованием положительного контроля , такие как нацеливания меченого Ang II в лизосомы 2, и по сравнению с другими хорошо -described рецепторные системы и лиганда , такие как фактор трансферрин или эпидермальный роста и их родственными рецепторами 3. Интересный положительный контроль,lbeit артефактного, в наших опытах было результатом наблюдается в соседних, нетрансфицированные, AT 1a R-GFP отрицательных клеток. Эти клетки, по-видимому взял GFP высвобождается из трансфицированных клеток и мишенью его лизосом, где колокализация с флуоресцентным красителем был весьма заметным (не показан). Это колокализация, однако, не был чувствителен к Ang II, как и ожидалось.
В заключение отметим, что методы трансфекции, обработки изображений и анализа изображений, представленные здесь, обеспечивают средство, с помощью которого рецептором интернализации в различные субклеточные отсеки могут быть количественно прослежен в живых клетках с течением времени. Относительные сравнения между различными рецепторами или селективно мутировавших рецепторов возможны в отношении кинетики и внутриклеточной локализации конкретных отсеков. Возможные трудности и артефакты, связанные с этой технологией обсуждаются. Тем не менее, быстро живого изображения в 3D в сочетании с анализом изображений может быть использован для измерения рецепторами поглощение и быстроепереходы через цитоплазму в молекулярно определимые отсеков. Это создает основу для измерения различий в результате мутации рецептора или применения агонистов, антагонистов и ингибиторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Научно-исследовательская работа представлена в этой рукописи была поддержана грантом R01 HL121456-01A1 к Kathryn Сандберг. Эта работа была поддержана в дополнение наличием в Leica SP8 АОБ в микроскопии и обработки изображений совместно используемых ресурсов (MISR) в Джорджтаунском университете Медицинского центра, который частично финансируется P30-CA051008 из Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов Америки. Мы выражаем глубокую признательность Leica помощь SP8 изображения Питера Джонсона, а также использование Цейсс LSM880 в лаборатории Томаса Coate, факультет биологии в Джорджтаунском университете, с помощью визуализации, предоставленной Alma Арнольд Carl Zeiss Микроскопия LLC. Содержание в этой рукописи является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
