Summary
ここでは、アンジオテンシンII治療によって開始エンドサイトーシスの間に緑色蛍光タンパク質タグ付きアンジオテンシン1a型受容体を発現画像セルにプロトコルを提示します。この技術は、第二の蛍光マーカーで標識リソソームを含み、その後時間をかけて立体的に受容体とリソソームの共局在を分析するためのソフトウェアを利用します。
Abstract
生細胞イメージングを同時にアンギオテンシンII（アンギオテンシンII）による刺激後のトランスフェクトされたヒト胚性腎臓293（HEK）細胞においてアンジオテンシン1A型（1aが R AT）受容体及び細胞内区画のタイムラプス画像を捕捉するために使用されます。 HEK細胞を一過性増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）でタグ付け1aが R AT含有するプラスミドDNAでトランスフェクトされます。リソソームは、赤色蛍光色素で識別されます。生細胞の画像は、アンギオテンシンII刺激後のレーザー走査型共焦点顕微鏡で捕捉され、経時的三次元（3D、ボクセル）のソフトウェアによって分析されます。ライブセルイメージングは、受容体輸送の調査を可能にし、固定に関連した交絡を回避し、特に、EGFPタグ付き膜受容体の損失や人為的な変位。個々のセルは、時間を通して追跡されるようにこのように、受容体の細胞内局在を撮像し、測定することができます。画像はsufficientlを取得する必要がありますyが急速に急速な小胞の動きをキャプチャします。しかし、高速撮像速度で、収集された光子の数が減少します。妥協はまた、撮像速度を得るためにボクセルサイズなどの撮影パラメータの選択を行わなければなりません。ライブセルイメージングの重要な用途は、タンパク質輸送、移動、増殖、細胞周期、アポトーシス、オートファジーおよびタンパク質 - タンパク質相互作用とダイナミクスを研究するために名前を付けることが、いくつかあります。
Introduction
全体的な目標は、受容体アゴニストで処理した後、特定の細胞内小器官で、時間と受容体の共局在の空間で定量的な証拠を得ることです。したがって、ここでの当面の目標は、タイムラプス共焦点リソソームの画像およびトランスフェクション後のヒト胚性腎細胞（HEK）における受容体の膜貫通を捕捉するために、続いて定量的に、受容体の送達を測定するために3次元の撮像データを集めて分析することですリソソーム。膜貫通型受容体は、生理学的および病態生理学的条件の下で規制されてどのように判断するのに役立つ受容体リガンドによって活性化されると、エンドサイトーシス中のリソソームまたは他の細胞小器官を有する膜貫通受容体の同時輸送を調査します。
図1aのRは、RECの大部分が1主HEK293、モデル細胞系でのAng IIで処理した後、リソソーム内で分解されると推定されますリガンド、アンギオテンシンIIの大部分はリソソーム2、3、4、5で分解され、一方eptorsは、主に原形質膜に後で再利用するための多リサイクルエンドソームに局在します。より最近では、Li ら。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）およびLAMP1で蛍光寿命イメージング顕微鏡（〜10ナノメートルスケール）（FLIM）技術AT 1aが Rの共局在化、受容体の少なくとも一部をを標的と分解されることを示唆しているリソソーム膜タンパク質を用いて実証リソソーム6によります。これらの著者は、リソソーム阻害剤クロロキンは、クロロキンの効果がリソソームと後期エンドソームまたはオートファゴソームの融合をブロックすることであることを示唆している以前の報告と一致している図1a R-LAMP1協会でブロックと指摘しました。他の間接的なアプローチは、 図1aの R Lに決定しますリソソームにおけるocalizationはリソソーム3（a）の Rの存在AT推論するバフィロマイシン、リソソーム阻害剤、4、5、6、7、8を利用しています。
ライブセルイメージングは、細胞体積、およびGFP-キメラ受容体の損失/調光/再分配上の固定の潜在的な影響を回避することができます。以前の研究は、共局在またはリソソームまたは例えば受容体結合代用物で標識された生細胞を用いた受容体の共起を決定するために、固定した細胞に依存してきたβアレスチン1、2、3、4、5、6。スピニングディスク共焦点またはレーザーポイント走査のconfの使用と他のGPCRのライブセルイメージングGaAsPまたはHYDの検出器を搭載したOCAL顕微鏡は、30秒間隔9、10でのzスタックで撮像された個々の細胞内の受容体の内在化および輸送を観察する研究者を可能にしました。生細胞のzスタックが急速に収集された場合でもしかし、分析は2Dのみ10で、すなわち各スタック内の単一平面の選択後に発生する可能性があります。これが問題の内在化GPCRまたはチロシンキナーゼ受容体を研究するために十分かもしれませんが、AT 1aのRsは時間をかけてサイズと位置を変更するため、本質的に十分に各時点での代表的な単一のスライスを使用して、サンプルがより困難である小胞に蓄積します。十分にこれらの変更を追跡することとなるように細胞を介し1aが Rで標識し、サイズおよび位置の異なる小胞の各亜集団を検出するために、我々は、3Dイメージングのための方法を考案した3次元解析の経路を決定します例えば、リソソームなど種々の細胞内区画の標識と組み合わせて使用します。
調べでは、直接細胞およびAng II刺激後の細胞内区画への転送にAT 1aが Rの動きを可視化するために生細胞イメージングのために、このプロトコルを使用することができます。細胞内コンパートメントは、蛍光タンパク質キメラまたは他の蛍光マーカーでタグ付けされています。このプロトコルはまた、野生型受容体に対する変異したまたは薬理学的治療を次の変化を検出するために比較するために、200nmの最小分解能と細胞内小器官における受容体を局在化するための最初のアプローチとして使用することができます。それは、生細胞イメージングのために備えたすべての共焦点顕微鏡上で実施することができるので、技術がアクセス可能です。このアプローチの相対的な容易さは、増加した専門知識と分子間相互作用6を検出FRET / FLIM / BRET技術を実行するために必要な機器とは対照的"外部参照"> 11。これらの測定は、高解像度（〜10 nm）におけるタンパク質 - タンパク質相互作用を定義し、細胞内小器官内局在が推測されます。これらのより高度な技術がフォローアップし、さらに細胞内区画を介して分子の関心の相互作用ではなく、受容体の通過を定義し、それらが直接セル11内の特定の時間と場所でのタンパク質-タンパク質相互作用を実証するために使用されています。画像取得が遅いためFLIM、アクセプタ濃度の独立したFRET技術は、最も頻繁に固定された試料に対して行われます。これとは対照的に、比FRETは、迅速なイメージングと相互作用するタンパク質の高解像度の共局在化を提供します。比FRETの欠点は、撮像画像形成速度を得るため、および低減された解像度及びオルガネラ12のコントラストが得られ、セル全体を含むように広視野落射蛍光を利用しています。生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）は、別であります時間11以上の分子の近接の取得を測定するためのGPCRに適用されている高度な技術。この技術において、タンパク質のフルオロフォアは、分子的に分割され、それぞれが半当該2つのタンパク質の一方に連結されました。ときに関心のバインドの2つのタンパク質が互いに、キメラのタグの部分は、蛍光と時間をかけて定量増加した蛍光を取得するために再組み立て。
ここでは、アンギオテンシンIIの刺激およびAng II刺激後リソソームに1aが R AT内在化の配信の電位変化時にセル内のAT 1aが Rの人身売買を研究するために、画像の定量化と相まって生細胞イメージングのための簡単な方法を提示します。この技術のための究極の使用は、野生型および変異受容体を比較する膜輸送の違いを特徴づけることです。これらの違いは、それがleadi AT 1aが Rの生理活性に影響を与えるメカニズムを同定するのに役立ちます血圧の調節にngの。
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Protocol
初日
1.細胞播種
- 完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。ウシ胎児血清（10％）を補充した完全DMEMの500mLのを作るためにDMEMの450 mLのウシ胎児血清を50 mLのペニシリン/ストレプトマイシンを5 mLのL-グルタミンの5 mLを加え、ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）およびL-グルタミン（1％）。
- シードヒト胚腎臓（HEK）細胞、継代数6-11 / 50,000で十分完全DMEMで8よくチャンバーカバーガラスシステムインチ
- 24時間5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃でチャンバースライドを維持します。
二日目
2.リポソームトランスフェクション
- たてのバイオセーフティーレベル2キャビネットに無菌状態を使用して、1aは R-GFPプラスミドとリポソームソリューションAT作ります。
- concentratを達成するために、低血清培地の178μLで900 ngの/μLストック溶液でのプラスミドDNAの2μLを希釈約10 ngの/μLのプラスミドDNAのイオン。
- 株式の午前1時40希釈を作成するために、低血清培地の175.5μLにリポソーム原液4.5μLに希釈します。
- プラスミド溶液にリポソーム溶液を追加し、トランスフェクション溶液を混合するためにダウンして20回をピペットとする1 mLのピペットを使用して混ぜます。
- 室温（25-27℃）で30分間混合物をインキュベートします。
- この混合物をインキュベートしている間に、1 mLのピペットでゆっくりメディアを取り出し、ゆっくりと400μL、37℃に予め温められ1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。
- 静かにPBSを除去し、200μL/ウェルの37℃に予熱した低血清培地と交換してください。
注：によるピペッティングにより誘発される剪断応力にカバースリップから細胞の剥離を回避するために、細胞を洗浄する際、すべての手順では注意してください。 - 30分間、5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で細胞を維持します。
- かつて潜伏期間は、各ウェルにトランスフェクション混合物の80μLを追加し、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で4.0〜4.5時間、細胞が、わずか5時間インキュベート、以上です。
- トランスフェクションインキュベーション期間が完了した後、ゆっくりと1 mLのピペッターを用いてチャンバーから培地を除去し、穏やかに300μL/ウェルの完全DMEMと交換し、5％の加湿インキュベーターCO 2中で37℃で24時間、細胞をインキュベート。
デイスリー
3.血清飢餓
- 静かに1 mLのピペットを使用してメディアを取り出し、ゆっくりとフェノールレッドを含まない無血清DMEMの300μLと交換してください。
- 10〜12時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃の室内を維持します。
4日目
4.ライブセルイメージング
- ステイン細胞内区画（この場合はリソソーム）。
- 阿保最終色素濃度のために各ウェルにUT 30分、細胞内のリソソームを撮影し、1μM蛍光色素ストック溶液から22.5μLを追加する前に（フェノールレッドを含まない無血清DMEMの499.5μLに希釈した0.5μLの1 mMの蛍光染料） 75 nMで。
- 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で25-30分間インキュベートした後、静かに染料を除去し、ゆっくりとフェノールレッドを含まない新鮮な無血清DMEMの300μLを追加します。
- イメージングのための顕微鏡を準備します。
- 自動顕微鏡の起動時にレンズへの損傷を避けるために、ステージを下に調整します。
- 顕微鏡パワー、スキャナの電源、レーザーパワー、その後、レーザ発光をオンにして、最終的には目視観察用のメタルハライドランプ（共焦点顕微鏡メーカーの説明書を参照してください）。
- イメージングソフトウェアプログラムを開き、アルゴン（488 nm）のレーザーとパワーアップのソフトウェアターン30〜50％です。電源が依存に注意してくださいレーザーの年齢。実験内では一定の設定を維持することが重要です。
- 赤色発光レーザー（ 例えば 、568ナノメートルまたは594 nm）をオンにします。
- 12ビットの深さにイメージングフォーマットを設定します。
- アルゴンレーザーラインの488nmおよび1エアリーディスクユニットに568 nm以下594 nmのレーザー用ピンホールを設定します。 GFPは非常に暗い場合は、2エアリーディスク装置の設定を使用しますが、適切にチャンネルを一致させます。
- ダイクロイックフィルターセットを使用する場合、GFP蛍光色素のための適切な発光波長を選択します。赤色発光蛍光色素のための680nmの - または、GFPおよびエム599のために499から580 nmの発光波長（エム）を設定します。
- それは表面にじみやクロスオーバーが発生しないか確認してください。順番に各レーザーの電源をオフにして、それぞれのための両方の排出チャンネルをチェックしてください。アルゴンレーザーがオフの場合、緑色発光はゼロであるべきです。緑色発光レーザがオフである場合、赤色発光チャネルはゼロであるべきです。
注：最も安全な方法は、別のトラックに画像それぞれにある（sequential）。 - 所望であれば、明視野チャネルを含めます。それは共局在測定をゆがめる可能性があるため、差動コントラストイメージング（DIC）を避けてください。
- ライブイメージング、選択線順次のではなく、フレームシーケンシャルのため。
- イメージングのためのセルを選択します。
- このような63X / 1.4 NA油の画像セルに客観的（または40X / 1.4 NA）として、1.4の開口数（NA）対物レンズを利用しています。目的を中心と客観的に高粘度、低自家蛍光イマージョンオイルの滴を追加します。
- 顕微鏡のステージにインキュベーターからトランスフェクトされた細胞でチャンバーを転送します。フラットスライドを維持し、チャンバはしっかりと固定し、動きが抑制されることを保証するために注意してください。
- オイルの滴がちょうどスライドの底に触れるまで目標を上に移動。右の焦点面は、この位置に近いです。自動顕微鏡では、この位置だけでなく、レムに使用する下降位置を保存イメージング実験のainderサンプルを変更容易にします。
- 薄暗いセルを選択してください。 図1a R-GFP AT過剰発現する細胞は、細胞内の受容体を誤った方向に行くと、通常の機能を破壊します。
- 原形質膜によって定義されたセルの輪郭は、可視光および好ましくは他の細胞と重複していないことを確認してください。
- フォーカスや視野のセルを中央に配置します。
- 共焦点モードに切り替えます。
- 高速撮像モードを選択します。ステージXYコントロールのフォーカス制御と、他方では、モニター上で可視化目的の細胞を集中し、中央に配置します。
- セルを上下に注力により、目的の細胞が十分に広がっており、その底部または腹側がカバースリップと密接に並置されていることを確認してください。
- 画像へのzステージパラメータ3Dでセルを設定します。
- Zスタックの上部と下部のダイアログ（または同等の）のためのOnボタンを選択し、Cの底部に集中しますエルその後、「開始」を押します。その後、細胞およびプレスの上部に焦点を当て、「終わり。」セル全体がzスタックに含まれていることを再確認してください。
- 1.0μmのZ-ステップサイズを設定します。
- 撮影設定を行います。
- 最終的なピクセルサイズは、x 0.279μmで0.14μmのXY寸法中のx0.14μmで約0.279ミクロンになるように、レンズによっては、ズーム2]を選択します。
- この実験でHEK細胞では、細胞の明るさに応じて、ボクセル当たり約1マイクロ秒にスキャン速度を設定し、2平均化またはラインで2蓄積を選択します。
- レーザー強度とイメージングGFP蛍光色素のゲインを調整します。一般的に、counterstainsはあえぎとHYD検出器は、GFPチャネルのために必要であるのに対し、ガリウム砒素リン（GaAsP系）やハイブリッド検出器（HYD）は、この第二の色チャンネルのために利用されるべきであるはるかに明るいため、光電子増倍検出器（PMT）とはないだろう。 HYDまたはGaAsPからは検出した場合ORSは注意を発揮し、非常に低電力でレーザーで始まり、蛍光色素のために使用されています。
- スキャンとスキャンの頻度の期間を設定し、例えば、25分以上にわたるすべての30-60 sはリソソームにAT 1aが R-GFPの標的見ること。
- 時間をかけて焦点面の安定性を維持するためにオートフォーカスを設定します。
- イメージング実験を開始します。
- 5μgの/μL（4.7793ミリモル）に予め100×アンギオテンシンII入荷準備して（10μM）998μL培地に本の2.1μLを追加します。
- 直前イメージング（最終濃度100 nM）をに含むウェル300μLへのリガンド（アンギオテンシンII）の100倍原液の3μLを添加することによってリガンド刺激を開始します。
- 所望の時間と周波数のために3Dでスタートし、画像をクリックしてください。
- 顕微鏡での作業を終了する前に、分析中にバックグラウンド減算で後で使用するためにzスタックを収集します。光子計数モードでは、これはありません背景があるので、必要な基本的に0照明ではオンになって、他のすべての撮像条件と同じ、ないサンプルとサンプル画像を取ります。分析中の背景差分を（下記）を参照してください。
5日目
5.画像解析
- TIFF形式へのエクスポート画像。
- 右メニューを表示し、エクスポート]を選択するか、ファイルをクリックし、画像のファイル名をクリックしてください|エクスポート|インポート。
- 、12ビットのデータをRAWをエクスポートすることを確認してその後の分析のためのtiffへのエクスポート[ない「赤青緑」出版品質の画像に使用（RGB）変換]。 JPEG形式にエクスポートしないでください。
- 画像解析中に後で使用するために、X、Y、Zのボクセル寸法およびzのステップサイズに注意してください。例えば、40X / 1.4を使用。 NA対物レンズ、これらの値は、x 0.138ミクロン1ミクロンとのzステップサイズ（代表結果セクション内のデータを参照してください）0.138μmである可能性があります。
- <strong>の分析のための画像スタックを作成します。
- オープンイメージ定量ソフトウェア（ 図2）
- インポートされた単一の配列から単一のファイルイメージを生成するために「選択された配列からの画像| |新規作成アクション」（ 図2、矢印＃1）を使用します。
- チャネル数、z軸部の数、及び時間ポイントの数を入力します。
- 画像平面の順序として、例えば、選択* .TIFFファイルの構造に応じて、チャネル、z平面、及び時点。最終的な画像スタックが正しく、元画像のカラーチャンネル、zスタック、および時間点を表していることを確認してください。
- イメージ名（ 図2、左側にファイル名をハイライト表示され、矢印＃2）を選択します。右の画像および/または画像フィールドをクリックし、リストの下部にあるオプションから「プロパティ」を選択します。 （X）（Y）および（Z）サイズミクロンピクセルで、正しい画像特性が上記の入力します。
- 前の画像分析にバックグラウンドを減算します。バックグラウンド補正は、任意の画像解析ソフトウェアで行うことができます。 2つのオプションのいずれかを使用してバックグラウンドを減算します。
- オプション1：選択して「アクション|新規作成|背景差分」（ 図2、矢印＃1）。 「|背景を引きツール」の「ダーク・リファレンス」の画像のように、上記のイメージングセッションの終了時に得られる取得した背景画像を使用してください。
- オプション2：、何のサンプルが存在しない画像で最も暗い領域を検査し、その領域内の画素の平均値や最大輝度を見つけ、スプリアスフォア、ランダムに明るいピクセル、または他のいくつかの現象である可能性のある異常に明るいピクセルを無視して。 "アクションを背景差分| |新規作成」を選択します。オフセットとして（負製）このピクセルの明るさを使用してください。
- カラーレジストレーションをチェックし、必要であれば正しいです。
- 選択することで、レジ補正を生成する"アクション|新規作成|登録修正」（ 図2、矢印＃1）と調整を行うために、ダイアログボックスを使用します。完了すると、新しいフォルダのアイテムは、「登録補正」と題する表示されます。
- イメージ名をクリックすることにより、目的の画像のうちの1つまたは複数に登録を適用します（ 図2を 、左側にファイル名を強調し、矢印＃2）とし、 "ツール|正しい登録」を選択する（アクションに隣接するツールボタン）。
- 画像を選択します（ 図2、矢印＃2、左側にファイル名をハイライト表示）し、フリースタイル領域ツール（ 図2、矢印＃3）を用いて、単一セルの周囲の関心領域（ROI）を描きます。トリミングツールは2Dのみの可視化で動作するように、細胞を観察する（図2Dは、左上のドロップダウンメニュー）拡張フォーカスモードを使用します。
- 右の画像をクリックして、「選択へのクロップ」を選択し、新しいイメージのアイテムが生成されます。
- その名前をクリックすることで、トリミングされたセルを選択して（ 図2、矢印＃4）上記の「測定」タブを選択します。
- GFPのための内在化小胞を定義し、測定するために、ドラッグして「検索」（ 図2、矢印＃5）シーケンスボックス（ 図2、矢印＃6）への下に「オブジェクトを検索します」。
- GFPのチャンネルにチャンネル「オブジェクトの検索」に設定します。
- オープン設定（ダイアログボックスのホイールアイコン、矢印＃6）とのセット4;使用してしきい値：「SDへと「0〜3μmで最小オブジェクトサイズ」「6.設定を「下限。
注：SD下限は、個々の実験に依存するであろう。正しいオブジェクトが閾値化されていることを視覚的に確認が異なる時点（ 図2、矢印＃7）を調べることによって行われます。 「測定|フィードバックオプション」ダイアログボックスが（ 図2の矢印＃8）閾値化オブジェクトが可視化され、選択方法を選択するために使用されます。 - 「オブジェクトの検索」ダイアログボックスで「測定」をクリックします（ 図2の矢印＃6）と測定値のチャンネルと種類を選択します。一般的に、「すべてのチャンネル」と「強さとボリュームの測定」を選択します。
- 2μにSD 0と「最小オブジェクトサイズ」：次のパラメータを使用して、 - 全細胞の同定のためのしきい値とフィルタを定義するには、総GFPの強度を測定するために、上記の手順（5.5.8 5.5.4）を繰り返します; m個の第2の「オブジェクトの検索」GFPを用いて細胞を同定するためのダイアログ・ボックス（ 図2、矢印＃9）で3
- 人口2の下のシーケンスボックスに「フィルタリング」の下にドラッグして「フィルタ人口」（第2「オブジェクトの検索」ボックス、 図2、矢印＃9）。 「ボリューム（μmの3> 100）を選択します。
- 視覚的に一つだけのオブジェクトが識別されていることを確認してください。セル全体の閾値されるべきであり、他のすべてのオブジェクトが離れて濾過しました。細胞が小さい場合、「フィルタ」パラメータ（複数可）は、例えば、調整を必要とすることができます。
- 測定が標準化された後、（「プロトコルの復元」）画像を右クリックしてプロトコルを保存し、再利用するために「保存プロトコル」を選択します。プロトコルは、画像と同じサブディレクトリに記録を提供するためにエクスポートすることができます。
- 選択して「測定を行う」に進み、「測定値を|測定項目の作成」を参照してください（ 図2
- 正しい測定名（画像からのコピーペーストが便利です）と、解析コードまたは日付（記録の保存に役立つほか）を入力し、「すべての時点」を選択します。新しいワークシート・アイテムは、画像の下に作成されます。簡潔なファイル名を保管してください。
- ワークシートのファイル名をクリックし、「分析」タブを選択します。人口2（セル）を選択します。飽和ボクセルが最初」に分析を制限する」を選択することによって存在しているかどうかを確認します。
- 右「[分析]タブ」の下と「これらのデータを分析します」の下のダイアログボックス内のフィールドをクリックし、「マックス（[GFPのカラーチャンネル]）」を選択します。 "によって要約：「下」を意味する（[GFPのカラーチャンネル]」を選択します。そして下の"によってデータを整理： "と"行 ""タイムポイント」とCLIを選択ckの「OK」。
注：データが飽和画素が含まれている場合（ 例えば 65,536 16ビットまたは12ビットのための4096のために）、分析は、（それが小胞内容を過小評価します）正確ではありません。分析のためにそのセルを無視してください。飽和していない場合は、次のステップに進みます。 - その後、細胞全体のための小胞や人口2のために人口1を選択します。次に、「生」タブの下に、次に「分析」タブを右クリックし、データを下には、「に分析を制限する」を見つけます。
- 「これらのデータを分析します」の下の「合計」（GFPのカラーチャンネル）を選択します。 "によって要約：「下の「合計」を選択します。そして「行」「タイムポイント」または「相対時間」を選択し、「OK」をクリックします：と、 "によってデータを整理」の下に。分析の選択を保存し、再利用することができます。
- 選択してコピー/空白のスプレッドシートに画像定量ソフトから直接貼り付けたり、DATを右クリックして、スプレッドシートのデータをエクスポート.csvファイルとして保存を選択。全細胞強度測定は、そのように識別し、小胞から分離するようにしてください集団の各小胞の測定に含まれます。
注：データをプロットした後、小胞の中に含まれる全GFP蛍光の増加が急激に上昇します。退色、それが発生した場合、経時的に総細胞GFP強度の消失として検出されます。
- 、オブジェクト（人口1）を検索し、矢印＃6（ 図2）によって示されているダイアログボックス内の赤チャンネルに、ホイールアイコンに「オブジェクトの検索」チャンネルを設定セットに「しきい値使用して：「SD及び「下限」に0.017〜3μmで6セット「最小オブジェクトサイズ」。
注：SD下限は、個々の実験に依存するであろう。正しいオブジェクトが試験によってなされるべきである閾値処理されている視覚的に確認異なる時点をining。 「測定|フィードバックオプション」ダイアログボックスが（ 図2の矢印＃8）閾値化オブジェクトが可視化され、選択方法を選択するために使用されます。 - オブジェクトの「検索」で「測定」をクリックしてください」ダイアログ（ 図2矢印＃6）と測定値のチャンネルと種類を選択します。一般的に、「すべてのチャンネル」と「強さとボリュームの測定」を選択されています。
- 人口2については、全体を識別するために使用されるものと同一の利用設定が1Aの R-GFP（5.5.9）での発現細胞をトランスフェクトしました。
- （蛍光色素陽性の小胞と非トランスフェクト細胞を含む）複数のセルが存在する場合、分析の最初の段階でセルをトリミングすることが重要です。あるいは、「区画化」の使用は、 図1aの R-GFP ATを発現するトランスフェクトされた細胞内のリソソームの識別を制限するために使用されるべきです。リソソームは、GFPのみ細胞内で識別されなければならず、ない近く、非トランスフェクト細胞から。
- 上記のようにデータを分析し、輸出。
注：閾値処理細胞及び小胞の例が図4に示されています。
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Representative Results
この実験の代表的なセットでは、HEK細胞のpEGFP-N2プラスミド13にクローニングし（1A R-GFP AT）アンジオテンシンタイプ1A受容体コンストラクト（E1,2,3-AT 1aが R）でトランスフェクトしました。 HEKのタイムラプス画像を取得し、映画（ ライブセルイメージング1とライブセルイメージング2ムービーを参照してください）のように演奏されました。映画や静止画は、リガンド刺激後、1aは R-EGFPs AT形質膜に主に局在しているが、アンギオテンシンIIを添加して、これらの受容体は明るい小胞を形成するために、2.5分以内に内在化し、より大きな小胞の後の回のクラスタになっていることを示し核周囲領域（ 図4B、5、及び図6A、ライブセルイメージング2）。
総細胞GFP強度と、図5のpのセルの総小胞のGFP強度の定量化アンギオテンシンIIは、すぐに刺激に続く（ 図5A、0分後のAng II、上段にある矢印、オレンジが閾値化オブジェクトを示す）細胞の形状の変化を波打ちと誘導する場合、固有の合併症のイラストをrovide。それ以降の時間で、核周囲クラスタ内のGFPを含む小胞の局在はまた、（ 図5A、29.5分で赤矢印）を妨害します。すべてのオブジェクトが総細胞のGFP強度測定に含まれるべきであるが、それらは図1a R-GFP AT形質膜を表すように、フリルは、小胞の測定から除外すべきです。これとは対照的に、クラスタ化された核周囲小胞は、小胞の測定から除外すべきではない（後者は図5（a）、29.5分後にアンギオテンシンII、下段にある矢印の赤い丸で囲まれたセルの領域に見られます）。それはフリルとクラスタ化されたVを区別ができなかったとして、サイズフィルタリング（以上または7μmの3未満）によって、これを達成する試みは有用ではありませんでしたesicles（ 図5Aおよび5B、フィルター> 7を比較し、フィルター<7、およびフィルタなし）。可能な代替は、細胞の細胞質部分を包含するが、細胞の波打ちエッジと境界を除く関心領域（ROI）を描画することであろう。 GFPの存在の飽和画素があったので、最終的には、この細胞は、定量的な結果には含まれないであろう。
第二の代表的な例は、オートフォーカスが使用されなかった時間の経過を示す図6Aに示されています。内在化GFPは、パーセント総細胞GFP（ 図6B）として示されています。セルの一部のみがアンギオテンシンIIの添加後に撮像ボリュームが、3分であったように3分の前に赤い矢印の時点では誤解を招くされ、焦点面が再度安定。セル内の総GFPは、このセルが（ 図6C時間をかけてかなり退色しなかったことを示しています ）。 3〜約12分間、その後、小胞の増加レベルはオフ（ 図6B）のパーセントGFP強度。次に、蛍光色素によって識別リソソームは、次いでGFP強度（ 図6D）の和を定量したトランスフェクトされた細胞内のROIを同定するために使用しました。 3分後、赤に識別リソソームにおけるAT 1aが R-GFPの強度は、時間をかけて（ 図3Dを 、N = 5、平均値の平均値±標準誤差）は変化しません。したがって、アンギオテンシンII投与後、最大24分間のリソソームへのAT 1aのR-GFPをの配信には検出可能な増加はありません。
図1：ルックアップテーブル（LUT）で同定された飽和画素。赤い矢印が青で示さ飽和画素を示しています。トン= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：画像定量化ソフトウェアの概要。主な項目は、数字で示され、メソッドのテキスト内で議論されています。 1）アクションアイテムは、2）選択した画像、3）フリーハンドROIツール、4）測定]タブ、5）オブジェクトを検索し、6）人口1のオブジェクトの検索]ダイアログボックスで、7）アローが活性化タイムラプスムービー、8）測定項目、 9）は、第2の検索は、Filter人口コマンドを含むダイアログボックスオブジェクト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：カラーレジ補正。補正されていないとのイメージと補正後の画素登録は1aが R-GFP AT含むいくつかの共局在化小胞のインセットと一緒に示されています。赤色の画素が補正されていない画像のXY平面内で左に1画素シフトされます。挿入図は、より高い倍率で箱入りの領域を示しています。スケールバー=3.3μmで、ボクセルの大きさ= 0.138 X 0.138×1μmの3。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：しきい値設定のイラストは、GFP蛍光色素含有小胞とGFP-全体の細胞を同定します。 （A）1aは R-GFP（GFP、一番上の行）AT用いて全細胞の同定および全細胞（IDセル、一番下の行）のためにGFPを閾値は、アンギオテンシンIIの添加後0および2.5分で示されています。ホワイトボックスはインを示しています（B）及び（C）に示す他の領域。 図1a R-GFPのAT（B）は、単一のカラー画像（一番上の行）でのAng IIの添加後0および2. 5分で比較されます。しきい値により識別小胞は、一番下の行（ID VES、紫）に示されています。 （C）（1aが R-GFP /蛍光染料AT）2色の画像は、0と2.5分後のアンギオテンシンII添加で示されています。しきい値により識別リソソームは、赤いアウトラインで示されています。スケールバー=7.0μmで、ボクセルの大きさ= 0.114 X 0.114 X 1.4μmの3。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 内在化GFP受容体の測定に関するフリルやクラスタ化された小胞の効果のイラスト。 （A）A TのAng IIにおける図1a R-GFPは0（一番上の行）で細胞を処理し、2.5分（一番下の行）が最初の列にフィルタのみで、7μmの3より大きいオブジェクトを選択するために適用された3フィルタリング実験で示されています選択する2番目の列は、7μmの3以下のオブジェクト、および第3列に何のフィルターは使用しませんでした。しきいレベルは、すべての3つの中で一定でした。矢印は円が後の時点で核周囲小胞を含む細胞質の領域を示す、大きな閾値化オブジェクトを示しています。閾値領域はオレンジ色です。小胞におけるGFP全強度の（B）定量は、（Aの行によって）2つの時点で（A列によって）サイズフィルタリングの有無にかかわらず、閾値化領域のために示されています。ボクセル寸法は0.138 X 0.138×1〜3μmでした。スケールバー=5.6μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：リソソームにAT1 R- GFP内部移行および潜在的なローカリゼーションを追跡。 （A）リソトラッカーレッドでAT 1aのR-GFPのファイブ選択した時点を0、3、6、9、および12分後のAng IIに添付映画（ライブセルイメージング1映画）から示されています。グリッドは6.56μmの3の単位スケールを表し、ボクセルの寸法は0.297 X 0.297 X 1.2μmの3、およびz-ステップ=1.2μmでした。 （B）経時小胞のパーセント総GFPのプロットは、AT 1aのR-GFPの急速な内部移行を示しています。 （C）時間をかけて、細胞内の総GFPのプロットは、比較的少ない光退色は、イメージングの24分の間に発生したことを示しています。 （D）リソソームは、リソトラッカーレッド陽性小胞を同定することによって同定しました。フロリダ州内の総GFP強度uorescent色素陽性小胞のROIは、（独立して測定されなかった光退色のための補償なし最初の時点に正規化）各時点で測定しました。 （C - D）の矢印に先立ち、測定値は焦点がずれているので有効ではありません。 N = 5は、平均±平均の標準誤差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
映画1：ライブセルイメージング1：（右クリックしてダウンロード） AT 1aが R-GFPをトランスフェクトしたHEK細胞を、100 nMでのAng IIの添加後24分（25フレーム）毎に1分を画像化しました。映画は、プラン-Apochromのレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて取得しました。63X / 1.4 NA油の目的で、0.279のx 0.279のx 1.2μmの3のボクセル寸法;および3.20マイクロ秒/ピクセルで撮像された4.794ミクロンの厚さの合計5スライス。動画速度は2フレーム/秒です。単位= 6.56ミクロン。
映画2：ライブセルイメージング2：（右クリックしてダウンロード） AT 1aが R-GFPをトランスフェクトしたHEK細胞を、100 nMでのAng IIの添加後25分（51フレーム）ごとに30秒を画像化しました。映画は、プランアポクロマート40X / 1.4 NA油目的としたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて取得しました。ボクセルの大きさは、x 0.11のx 1.4 0.11〜3μmでした。 8.4ミクロンの厚さの合計7スライスは3.72秒/フレームで画像化しました。動画速度は3フレーム/秒です。スケールバー= 7ミクロン。
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Discussion
ここで紹介する予備実験は、24分のかなり短い時間経過にわたって、リソソームへのAT 1aのR-GFPの配信には明らかな変化が発生していないことを示しています。一般的に、リソソームへの内在化受容体の送達は、早くも15〜20分として発生する可能性があります。この実験は、 図1aの R AT内在化の大部分が大きい、核周囲エンドソームに標的化されるという仮説と一致しています。 図1aの R少なくとも一部がリソソームに到達したという証拠を、Li らによって実証されました。 、アンギオテンシンII処置後5分および30分で細胞を比較し、30でAT 1aが RとLAMP1の重要な共局在が見つかりましたがない5分6人。
本論文では、細胞調製、イメージング、および分析ステップの詳細な説明を提供し、この高度なイメージング技術に多くの固有の落とし穴について説明します。この方法は、以下で説明する重要なステップに依存します。
細胞の健康は、任意の生細胞イメージング実験のために重要であるので、原因成長率と高い通路でのトランスフェクション効率の変化の通路11を超えて細胞を使用して回避することが重要です。リポソーム溶液が増加し、膜ブレブ形成によって証明される細胞に毒性であるため、実験を通して健康な細胞を維持するためには、細胞のトランスフェクションミックスの潜伏期間は5時間を超えてはなりません。温度、湿度、CO 2制御は前だけでなく、撮影時に重要です。撮影中の温度ドリフトは比較的大手のzセクションドリフトと焦点面の安定性の損失を引き起こす可能性があります。したがって、特別な注意は、焦点面が正確に維持されることを保証するために撮像中の細胞へのAng IIの添加中をお勧めします。
イメージング
固定した細胞を用いて免疫染色を超える生細胞イメージングの利点はインビボ条件を厳密に制御することができ、固定された細胞に関連するアーティファクトを回避することができます。しかし、ライブセルイメージングは、受容体の内在化のように、非常に迅速であり、細胞プロセスを最適化するために挑戦することができます。インストゥルメント・スピードと研究することができるイベントの選択を制限退色回避する必要があります。各撮像実験は、他ではいくつかのパラメータとの妥協で行われるために、特定の選択肢を要求する可能性があります。例としては、分析のために良質のデータを取得すると同時に、オーバーサンプリングを回避するために画素サイズ、ライン蓄積、ズーム倍率、及び走査速度の選択です。これらの要因の重要な決定は、個々の小胞を区別するために、適切なピクセルサイズを得るために必要と発生したイベントの十分な時間分解能を得るための必要性をバランスに依存します。したがって、いくつかのトレードオフは、細胞がGFP標識受容体を内在し始めるとすぐに十分な情報を取得するためになされなければなりません。私たちの中で近代的な共焦点ソフトウェアは、最適なピクセルサイズを示唆することができますが場合は、我々の実験は、ナイキスト式14に応じた最適な画素サイズよりも小さい値を使用していました。他の実験の設定の最適な選択肢は、より大きな画素サイズがより多くの光子を収集するために、より長いボクセル滞留時間とのトレードオフできるように光子の速い蓄積を可能にするため、細胞がどのように明るいに依存します。
分析を成功させるには、生細胞イメージングはまた、批判的にタイムラプス撮影時の正確な焦点の安定化を必要とします。焦点シフトだけでなく、画像に失敗セル全体は、受容体の内在化の定量化の際に深刻な影響だけでなく、全細胞のGFP強度を持つことができます。アンギオテンシンIIを添加した後、撮像の最も早い時点の間に、焦点シフトのこの問題に対する解決策は、オートフォーカス用溶液の形で共焦点製造業者によって提供されたことによりカバースリップinterferom自動フォーカス制御へのフィードバックと結合されたIRレーザーでメトリは、IR反射によって識別されたカバースリップの表面に客観からの相対距離を維持するために使用されている（ 例えば 、明確なフォーカスまたはAdaptiveフォーカス制御）。顕微鏡使用の残りの問題は、形状変化にもかかわらず、セル全体が撮像容積に残るように正しいzの範囲を特定することです。温度は、アンギオテンシンIIの添加後の初期の時点の間にフォーカス/ Zの位置を維持するための別の重要な要因です。目的の温度、ならびに生細胞イメージング室は、実験全体を通して37℃に維持されるべきです。
イメージングの別の重要な要素は、定量的に画像を取得します。 HYD検出器は光子計数モードで使用されている場合は、その光子パイルアップが発生しないように、撮像パラメータを設定する必要があります。光電子増倍管および他の検出器の場合、画像が飽和画素（ボクセル）を含めることはできません。両方の場合において、SPEルックアップテーブル（LUT）は、それらが存在する場合、飽和画素のもちろんの存在を可視化するために使用することができるcialized、顕微鏡使用は、レーザー強度および/または利得を減少すべきです。
分析
ここで説明するアプローチは、AT 1aが R受容体とリソソームとの共局在化に適用されるが、それは、種々の蛍光タグで標識された細胞内区画中の受容体の相対量は、問題になっている実験にも適用可能です。目標は、受容体は細胞小器官に移動したか否かを測定する場合は、オルガネラためのマーカーとの共局在ピアソン係数を使用して問題があります。係数の一つが常に100％近くになるように細胞小器官が識別されたすべてのピクセルは、マーカーの高い量を持つことになります。このように、共局在の測定値は誤解を招く可能性があります。一方、レジェップの合計量に対する細胞小器官上の受容体の割合を測定しますTorは、はるかに有益と解釈するのがより明確です。タンパク質の共局在が最高のピアソンの相関係数を用いて記述されることがある場合は、その相互作用はあるが、より洗練された共局在化アプローチ、すなわちFLIM / FRET 6により、文書化された1aが R受容体とLAMP1 ATだろう。
3Dイメージングの使用は、時間経過（ ライブ イメージング2映画 ）の間に避けられないの細胞運動の2次元で解析を用いた細胞の代表的なスライスを使用して、より正確です。これは、 図4（b）、 図3に示した生細胞の画像から明らかであり、受容体は主に原形質膜に局在する図5（a）は 、しかしながら、アンギオテンシンIIへの曝露の数分以内に明るい膜上のスポットおよび小に局在します膜に隣接する小胞、おそらくコーティングされたピットおよび初期エンドソーム（ 図4B >、4C）。時間の継続的な進行と、小胞は多エンドソームとして記載されている核に隣接して、より大きな小胞に蓄積するセルを移動3、15（MVEs、1、図5（a）は図 ）。スライスが早い時間に細胞表面、およびそれ以降の時間にMVEsが含まれていなかった場合は特に、内在化プロセスをゆがめ、真のイベントを偽ることになる時間をかけて細胞を介して単一のスライス。
本研究では、画像解析のための2つのアプローチは、定量的結果にGFPの退色、並びに蛍光色素の影響を最小限に抑えることができます。細胞は（限られた範囲ではあるが）光退色したように、セル全体の強度に対する内在化小胞の相対的な明るさは、光退色が均一に発生すると仮定すると、維持されています。蛍光色素陽性の小胞も簡単に標準deviatioを選択することによって識別されます明るい内在化小胞を閾値の平均蛍光強度オプションのn個。これはあっても、蛍光低下のレベル全体としてのバックグラウンドからそれらを区別します。したがって、我々の測定は、ささやかな光退色の影響に敏感ではなかったです。しかし、時間の経過とともに、このような細胞の強度の50％の損失などの強い光退色は、定量的な結果に応じて、より大きな影響を与える可能性があります。代替的に、光退色の効果は、コントロール実験で独立に測定することができるAT 1aが R-GFPの場合、または蛍光染料の場合には、隣接する非トランスフェクト細胞中のAng IIが存在しません。光退色の影響は、分析中にで因数分解することができました。
追加の懸念
近年、細胞生物学者は、タンパク質バインとは無関係に、蛍光タンパク質自体によって生成されたアーティファクトを回避するために、細胞内の膜輸送を監視するための蛍光タンパク質の重要な評価と修正を行いましたgがタグ付けされました。様々な蛍光タンパク質は、それぞれ16彼らのpKaのとアミノ酸システインの存在に基づいてタンパク質沈殿又は架橋につながる局所微小環境との相互作用に対して脆弱です。これらの相互作用の別の結果は、蛍光16の損失を含んでいてもよいです。これらの成果物のすべては、人身売買の定量的な測定に影響を与えます。コンスタンら。潜在的な成果物16を除去するために、システインを欠いているイメージングのための単量体蛍光タンパク質を生成しました。したがって、イメージング実験の目的に応じて、単量体にEGFP（非モノマー）からの切り替え、システインを含まない形態は、酸性および/または小胞の微小環境を減少させる研究に有利であろう。別の例は、多量体化および架橋は、タンパク質の拡散とタンパク質間相互作用に影響を与えるFRAPまたはFRET実験のための彼らの改良されたユーティリティであろう。
別の潜在的なアーティファクトは、GFP融合タンパク質と共にリソトラッカーレッドを用いてリソソームを撮像するときリソトラッカーレッドグリーン17に光変換することができることが示されていることである考慮する。著者は、このアーティファクトの発生を議論し、落射蛍光照明の使用を最小限にすることをお勧めしますし、この試薬を用いて共局在化の成功事例を参照してください。加えて、リソソームの他のマーカーは、例えば、LAMP1 6をタグ付けし 、共局在の結果を検証するために使用することができます。
今後は、このアッセイの感度および特異性は、18の劣化はなく、蓄積7をブロックするバフィロマイシン用いたリソソームの酸性化を阻害することにより受容体が小胞輸送及び/又は融合の阻害剤を使用することによって、リソソームならびに他の細胞内区画に標的化するために検査することができ、結果的にそのようなリソソーム2の標識アンギオテンシンIIの標的としてのポジティブコントロールを使用して、リソソーム2、5、6、7、18とレセプターの共局在化をブロックリソソームとの融合をブロックするためにクロロキンを用いて、および他のに比較して十分に例えばトランスフェリンまたは上皮成長因子およびその同族受容体3として、受容体およびリガンドシステム-described。興味深いポジティブコントロール、lbeitアーチファクト、我々の実験では図1aの R-GFP陰性細胞AT、トランスフェクトされていない、隣接して観察結果でした。これらの細胞は明らかにトランスフェクトされた細胞から放出されたGFPを取り上げ、蛍光色素と共局在化は非常に顕著であったリソソームに標的に（図示せず）。予想通り、この共局在化は、しかし、アンギオテンシンIIに敏感ではありませんでした。
結論として、ここに提示トランスフェクション、画像化、および画像解析のための方法は、種々の細胞内コンパートメントへの受容体の内在化を定量的に経時的に生細胞内で追跡することができる手段を提供します。異なる受容体または選択的に変異した受容体との間の相対的な比較は、特定の区画への動態および細胞内局在に関して可能です。この技術に関連した可能性のある困難やアーチファクトが議論されています。それにもかかわらず、画像解析と結合された3次元で高速ライブ画像化は、受容体の取り込みおよび迅速に測定することができます定義可能な区画を分子的にする細胞質を介して遷移します。これは、受容体またはアゴニスト、アンタゴニスト、および阻害剤の適用の突然変異に起因する差異の測定のための段階を設定します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この原稿で提示の研究活動は、キャスリン・サンドバーグへの助成金R01 HL121456-01A1によってサポートされていました。この作品は、部分的に、米国の国立衛生研究所からP30-CA051008によって資金を供給されているジョージタウン大学メディカルセンターの顕微鏡およびイメージング共有リソース（MISR）でライカSP8 AOBSの利用による加算でサポートされていました。私たちは感謝ライカSP8イメージングピーター・ジョンソン案内、カールツァイス顕微鏡LLCのアルマ・アーノルドによって提供されるイメージング支援とジョージタウン大学のトーマスCoate、生物学科の研究室でツァイスLSM880の使用を認めます。この原稿の内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
