Summary
Här presenterar vi ett protokoll till bild celler som uttrycker grönt fluorescerande protein-märkt angiotensin typ 1A receptorer under endocytos initieras av angiotensin II behandling. Denna teknik omfattar märknings lysosomer med en andra fluorescerande markör, och sedan använder programvara för att analysera samlokalisering av receptor och lysosom i tre dimensioner över tiden.
Abstract
Live-cell imaging används för att samtidigt fånga tidsförlopp bilder av angiotensin typ 1A receptorer (AT 1a R) och intracellulära fack i transfekterade humana embryonala njur-293 (HEK) celler efter stimulering med angiotensin II (Ang II). HEK-celler är övergående transfekterade med plasmid-DNA innehållande AT 1a R taggade med förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP). Lysosomer identifieras med en röd fluorescerande färgämne. Live-cellbilder fångas på en laserskanning konfokalmikroskop efter Ang II stimulering och analyserades med programvara i tre dimensioner (3D, voxlar) över tiden. Live-cell imaging gör utredningar receptorhandel och undviker blandar ihop i samband med fixering, och i synnerhet förlust eller artefactual förskjutning av EGFP-märkta membranreceptorer. Således, såsom enskilda celler spåras genom tiden, subcellulära lokalisering av receptorer kan avbildas och mätas. Bilder måste förvärvas sufficiently snabbt för att fånga snabba vesikel rörelse. Men vid högre avbildningshastigheter, är antalet fotoner samlats minskas. Kompromisser måste också göras i valet av imaging parametrar som voxel storlek för att få utskriftshastighet. Betydande applikationer i levande cell imaging är att studera protein trafficking, migration, proliferation, cellcykeln, apoptos, autophagy och protein-proteininteraktioner och dynamik, för att bara nämna några.
Introduction
Det övergripande målet är att få kvantitativa belägg i tid och rum av receptor colocalization med specifika subcellulära organeller efter behandling med en receptoragonist. Således är det omedelbara målet för att fånga tidsförlopp konfokala bilder av lysosomer och en transmembranomspännande receptor i humana embryonala njurceller (HEK) efter transfektion och att därefter montera och analysera bilddata i 3D för att kvantitativt mäta leveransen av receptorn till lysosomer. Undersöker samtidig handel med en transmembranreceptor med lysosomer eller andra organ under endocytos när den aktiveras av receptorligand kan bidra till att avgöra hur transmembranreceptor regleras under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden.
AT 1a R antas brytas ned i lysosomer efter behandling med Ang II i modellceller system, främst HEK293 en även om majoriteten av receptors är primärt lokaliserade i multivesikulära återvinnings endosomer för senare återvinning till plasmamembranet medan huvuddelen av liganden, Ang II, degraderas i lysosomen 2, 3, 4, 5. Mer nyligen, Li et al. demonstreras med användning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) och fluorescenslivstid avbildning mikroskopi (FLIM) tekniker som AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm-skala) med LAMP1, ett lysosomalt membranprotein vilket tyder på att åtminstone en del av receptorn är riktad till och bryts ned genom lysosomer 6. Dessa författare noterade att lysosomala inhibitor klorokin den blockerade AT 1a R-LAMP1 förening som är i linje med tidigare rapporter som tyder på att en effekt av klorokin är att blockera fusion av sena endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andra indirekta metoder för att avgöra 1a R localization i lysosomer har utnyttjat bafilomycin, ett lysosomalt hämmare att sluta AT 1a R närvaro i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live-cell imaging undviker potentiella effekterna av fixering på cellvolymen, och förlust / mörkläggning / omfördelning av GFP-chimär receptor. Tidigare studier har förlitat sig på fixerade celler för att bestämma colocalization eller samtidig förekomst av receptorn med lysosomer eller med hjälp av levande celler märkta med receptorbindande surrogat såsom β-arrestin en, två, tre, fyra, fem, sex. Live-cell imaging andra GPCR med hjälp av snurrande skiva konfokala eller laserpunkt skanning confocal mikroskop utrustade med Gaasp eller hyd detektorer aktiverade utredare att observera internalisering och handel med receptorer i enskilda celler avbildas i z-stackar på 30 s intervall 9, 10. Men även då levande cell z-stackar snabbt samlas, kan analys endast ske efter urval av ett enda plan i varje stapel, dvs i 2D 10. Även om detta kan vara tillräckligt för att studera intern GPCR eller tyrosinkinasreceptor i fråga, AT 1a Rs ackumuleras i vesiklar som ändrar storlek och position över tid och därmed är till sin natur svårare att på ett adekvat prov med hjälp av en representativ enda skiva vid varje tidpunkt. Att grundligt fastställa vilken rutt märkt AT 1a R genom cellen och för att upptäcka varje subpopulation av vesiklar som skiljer sig i storlek och position, har vi utvecklat en metod för 3D-avbildning och 3D-analys för att spåra dessa förändringar och att vara används i samband med märkning av olika intracellulära avdelningar såsom lysosomer.
Utredarna kan använda detta protokoll för levande cell imaging att direkt visualisera rörelse AT 1a R in i cellen och dess överföring till subcellulära fack efter Ang II stimulering. Subcellulära fack är märkta med fluorescerande protein chimärer eller andra fluorescerande markörer. Detta protokoll kan också användas som ett första försök att lokalisera receptorer i subcellulära organeller med en upplösning på minst 200 nm för att jämföra muterat jämfört med vild-typ-receptorer eller för att upptäcka förändringar följande farmakologiska behandlingar. Tekniken är tillgänglig, eftersom den kan utföras på någon konfokal mikroskop utrustat för live-cell imaging. Den relativa lätthet med detta tillvägagångssätt kontrasterar med ökad kompetens och utrustning som behövs för att utföra FRET / FLIM / Bret tekniker som upptäcker molekylära interaktioner 6,"xref"> 11. Dessa mätningar definierar protein-proteininteraktioner med hög upplösning (~ 10 nm) och lokalisering inom subcellulära organeller är oavsiktliga. Dessa mer avancerade tekniker används för att följa upp och ytterligare definiera molekylära interaktioner av intresse, snarare än passagen av receptorer genom subcellulära fack och de direkt visar protein-proteininteraktioner på bestämda tider och platser i cellen 11. FLIM, en FRET teknik oberoende av acceptor koncentration, oftast utförs på fasta prover eftersom bilden förvärvet är långsammare. Däremot ger förhållandet FRET snabb avbildning och hög upplösning colocalization av interagerande proteiner. Nackdelen med förhållandet FRET är att avbildning använder Vidvinkel epi-fluorescens för att få utskriftshastighet och att inkludera hela cellen, vilket resulterar i lägre upplösning och kontrast organ 12. Bioluminescence resonansenergiöverföring (BRET) är en annanavancerad teknik som har använts för GPCR att mäta förvärv av molekylära närhet över tiden 11. I denna teknik ett protein fluorofor är molekylärt uppdelas och varje halva kopplade till en av två proteiner i fråga. När de två proteiner av intresse binder varandra, de delar av det chimära taggen återmontera att förvärva fluorescens och den ökade fluorescensen kvantifierades över tiden.
Här presenterar vi en enkel teknik för levande cell imaging tillsammans med bild kvantifiering för att studera handel med AT 1a R i cellen på Ang II stimulering och potentiella förändringar i leverans av intern AT 1a R lysosomer efter Ang II stimulering. Den slutliga användningen för denna teknik är att karakterisera skillnader i membran trafficking som jämför vildtyp och muterade receptorer. Dessa skillnader kommer att bidra till att identifiera mekanismen (s) som påverkar fysiologiska aktiviteter AT 1a R leading till regleringen av blodtrycket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag ett
1. Cell Seeding
- Förbered komplett Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). Tillsätt 50 ml fetalt bovint serum, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml av L-glutamin till 450 ml DMEM för att göra 500 ml fullständigt DMEM kompletterat med fetalt bovinserum (10%), penicillin / streptomycin (1%) och L-glutamin (1%).
- Seed mänskliga embryonala njure (HEK) -celler, passage nummer 6-11 vid 50.000 / brunn i en åtta väl kammare coverglass systemet i fullständig DMEM.
- Bibehålla den chambered slide vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 24 timmar.
Andra dagen
2. Liposom Transfektion
- Färskt göra AT 1a R-GFP plasmid och liposom lösningar med sterila förhållanden med en skyddsnivå 2 skåp.
- Späd 2 pl plasmid DNA vid 900 ng / l stamlösning i 178 mikroliter av minskade serum media för att uppnå en Koncentration av plasmid-DNA på cirka 10 ng / mikroliter.
- Späd 4,5 mikroliter av liposomer stamlösning i 175,5 mikroliter av minskade serum medier för att skapa en 1:40 utspädning av lager.
- Lägga liposomlösningen till plasmiden lösning och blanda genom att använda en 1 ml pipett för att pipettera upp och ner 20 gånger för att blanda transfektion lösning.
- Inkubera blandningen under 30 minuter vid rumstemperatur (25-27 ° C).
- Medan denna blandning inkubering, ta bort materialet långsamt med en 1 ml pipett och tillsätt långsamt 400 | il av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som är förvärmda till 37 ° C.
- Försiktigt bort PBS och ersätta med 200 mikroliter / brunn av minskad serummedier förvärmas till 37 ° C.
OBS: Var försiktig vid alla steg när tvättning av cellerna för att undvika avlossning av celler från täck på grund av ren stress som pipettering. - Bibehålla cellerna vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 30 min.
- NärInkubationstiden är över, tillsätt 80 mikroliter av transfektion mix till varje brunn och inkubera cellerna under 4,0-4,5 h men inte mer än 5 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
- Efter transfektion Inkubationstiden är klar, sakta ut media från kamrarna med hjälp av en 1 ml pipett och försiktigt ersätta med 300 mikroliter / brunn av komplett DMEM och inkubera celler i 24 timmar vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 .
dag tre
3. serumsvält
- Ta bort materialet försiktigt med hjälp av en 1 ml pipett och långsamt ersätta med 300 mikroliter av serumfritt DMEM utan fenolrött.
- Bibehålla kammaren vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 under 10-12 h.
dag fyra
4. Levande cell imaging
- Fläck intracellulära fack (lysosomer i detta fall).
- aboUT 30 min före avbildning lysosomer i celler, tillsätt 22,5 | il från en 1 fiM fluorescerande färgämne stamlösning (0,5 | il av 1 mM fluorescerande färgämne utspätt i 499,5 mikroliter av serumfritt DMEM utan fenolrött) till varje brunn för en slutlig färgämneskoncentration av 75 nM.
- Inkubera under 25-30 minuter vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2 och sedan försiktigt bort färgämnet och tillsätt långsamt 300 | il av färskt serumfritt DMEM utan fenolrött.
- Förbereda mikroskopet för avbildning.
- Justera scenen ner för att undvika skador på linsen under starten av ett automatiserat mikroskop.
- Slå på mikroskop makt, scanner makt, lasereffekt och sedan laseremission, och slutligen metallhalogenlampa för visuell observation (se konfokalmikroskop tillverkarens anvisningar).
- Öppna bildvisningsprogram och i programvaran slå på argon (488 nm) laser och effekt upp till 30-50%. Notera kraften beror påålder av laser. Inom experiment är det viktigt att upprätthålla konstanta inställningar.
- Slå på röd-emitterande laser (t.ex. 568 nm eller 594 nm).
- Ställ avbildningsformatet till 12-bitars djup.
- Ställ in hål för argonlaser linjen 488 nm och för 568 nm eller 594 nm laser för att en Airy skivenhet. Om GFP är mycket svagt, använd inställningen 2 Airy skivenheter, men matcha kanalerna på lämpligt sätt.
- Vid användning av dikroiska filteruppsättningar, välja lämpliga emissionsvåglängder för GFP och fluorescerande färgämne. Eller ställa in emissionsvåglängd (Em) vid 499-580 nm för GFP och Em 599-680 nm för röd-emitterande fluorescerande färgämne.
- Kontrollera att blöda igenom och crossover förekommer inte. Stäng av varje laser i sin tur och kontrollera både utsläpps kanaler för varje. När Argon laser är avstängd, ska den gröna utsläpp vara noll. När den gröna mitterande laser är avstängd, bör den röda utsläppskanalen vara noll.
OBS: Det säkraste sättet är att bilden var i separata spår (SEQUrential-). - Inkludera en bright kanal om så önskas. Undvika differentiell kontrast imaging (DIC), eftersom det kan skeva colocalization mätningar.
- För levande avbildning väljer linje sekventiell snarare än ram sekventiell.
- Markera celler för avbildning.
- Använd en 1,4 numerisk bländare (NA) mål, såsom en 63X / 1.4 NA olja mål till bildceller (eller 40X / 1.4 NA). Centrera målet och tillsätt en droppe med hög viskositet, låg autofluorescens immersionsolja på målet.
- Överför kammaren med de transfekterade cellerna från inkubatorn till det stadium av mikroskopet. Var noga med att hålla bilderna platt och se till att kammaren är väl sitter och hindras från att röra sig.
- Flytta målet fram till droppe olja precis nuddar vid botten av bilden; rätt fokalplanet är nära till denna position. I automatiska mikroskop, spara denna position liksom nedfällt läge ska användas för remainder av bild experiment för att underlätta förändrade prover.
- Välja dim celler. Celler som överuttrycker AT 1a R-GFP kommer misdirect receptorn i cellen och störa normal funktion.
- Kontrollera att konturerna av cellen, som definieras av plasmamembranet, är synliga och helst inte överlappar med andra celler.
- Fokus och centrera cellen i synfältet.
- Växla till konfokala läge.
- Välj en snabb bildläget. Med en hand på fokusstyrning och den andra på scenen XY kontroll, fokus och centrera cellen av intresse visualiseras på monitorn.
- Kontrollera att cellen av intresse är väl spridda och dess botten eller ventrala sidan intill ett nära samarbete med täck genom att fokusera upp och ned genom cellen.
- Ställ in z-stegsparametrar till bilden en cell i 3D.
- Välj på knappen för Z-stack topp och dialog botten (eller motsvarande) och fokusera på botten av cell tryck "börja". Därefter inriktas till toppen av cellen och tryck på "änden." Kontrollera igen att hela cellen är inkluderad i z-stack.
- Ställa in Z-stegstorleken till 1,0 | im.
- Ställ inställningar avbildning.
- Välja Zoom 2, beroende på linsen, så att den slutliga pixelstorleken är ca 0,279 | j, m x 0,279 pm till 0,14 um x 0,14 um i XY-dimension.
- För HEK celler i detta experiment, ställa skanningshastighet på cirka 1 xs per voxel och välj två medelvärdes eller 2 ansamlingar av linje, beroende på ljusstyrka celler.
- Justera laserintensitet och vinna för avbildning GFP och fluorescerande färgämne. I allmänhet kommer counterstains vara mycket ljusare och därför Fotomultiplikator detektor (PMT) och inte galliumarsenidfosfid (GaAsP) eller Hybrid detektorer (HYD) bör användas för detta andra färgkanal medan GASP och Hyd detektorer är nödvändiga för GFP-kanalen. Om HYD eller Gaasp upptäckerorer används för det fluorescerande färgämnet, utöva försiktighet och börja med lasern vid en extremt låg effekt.
- Ange längd av skanning och frekvens av skanning, till exempel varje 30-60 s under 25 minuter eller längre se inriktning av AT 1a R-GFP till lysosomer.
- Ställ in autofokus att upprätthålla fokalplan stabilitet över tid.
- Börja avbildningsexperiment.
- Förbereda i förväg 100x Ang II lager på 5 mikrogram / mikroliter (4,7793 mM) och tillsätt 2,1 mikroliter av detta till 998 mikroliter medium (10 ^ M).
- Börja ligand stimulering genom tillsats av 3 | il av en 100 x stamlösning av ligand (Ang II) till brunnen innehållande 300 mikroliter omedelbart före avbildning (slutlig koncentration 100 nM).
- Klicka på Start och bild i 3D för önskad tid och frekvens.
- Innan efterarbete vid mikroskopet, samla en z-stack för senare användning i bakgrunden subtraktion under analysen. I fotonräknande läge, är detta intenödvändigt eftersom bakgrunden är väsentligen 0. Med belysningen påslagen och alla andra avbildningsbetingelser samma, men med inget prov ta ett prov bild. Se bakgrundssubtraktion (nedan) under analys.
dag fem
5. Bildanalys
- Exportera bilder till TIFF-format.
- Högerklicka på bilden filnamnet för att se menyer och välj Exportera eller klicka på Arkiv | export | importera.
- Export till TIFF för efterföljande analyser och se till att exportera RAW, 12-bitars data [inte "Röd Blå Grön" (RGB) omvandling för publicering bildkvalitet]. Inte exportera till JPEG-format.
- Notera X-, Y-, Z-voxel dimensioner och z-stegstorleken för senare användning under bildanalys. Exempelvis med användning av ett 40X / 1,4. NA objektiv dessa värden kan vara 0,138 um x 0,138 pm med ett pm z-steg storlek (se data i resultat avsnittet representant).
- <strong> Skapa bildstapel för analys.
- Öppna bild Kvantitativ programvara (Figur 2)
- Använd "Action | Skapa ny | Bilder från utvald sekvens" för att generera en enda fil bild från importerade enstaka sekvenser (Figur 2, pil 1 #).
- Ange antalet kanaler, antalet z-sektioner och antalet tidpunkter.
- Beroende på strukturen av de * TIFF filer väljer, till exempel, kanaler, z-planet, och tidpunkter som ordningen på bildplan. Kontrollera att den slutliga bilden stacken representerar färgkanaler, z-stack och tidpunkter för den ursprungliga bilden korrekt.
- Markera bilden namn (Figur 2, markerat filnamn till vänster, pil # 2). Högerklicka på bilden och / eller bildfältet och från alternativen längst ned på listan välj "Egenskaper". I fim pixel för (X) (Y) och (Z) storlek, ange rätt bildegenskaper angivits ovan.
- Subtrahera bakgrund före bildanalys. Bakgrundskorrigering kan åstadkommas på något bildanalysmjukvara. Subtrahera bakgrunden med ett av två alternativ.
- Alternativ 1: Välj "Action | Skapa ny | bakgrundssubtraktion" (Figur 2, pil # 1). Använd den förvärvade bakgrundsbild som erhålls vid slutet av bildsession beskrivs ovan som "Dark Reference" Bild under "Verktyg | Subtrahera Bakgrund".
- Alternativ 2: Kontrollera de mörkaste områdena i bilderna där det finns inget prov, hitta den genomsnittliga eller maximala ljusstyrkan pixlar i denna region, bortser från eventuella ovanligt ljusa pixlar som kan vara falsk fluorofor, en slumpmässigt ljus pixel, eller något annat fenomen. Välj "Åtgärder | Skapa ny | bakgrundssubtraktion". Använd denna pixel ljusstyrka (som negativ) som Offset.
- Kontrollera om färgregistrering och korrigera vid behov.
- Generera en registreringskorrigering genom att välja "Åtgärder | Skapa ny | Registration Correction" (Figur 2, pil # 1) och använder dialogrutan för att göra justeringar. Efter avslutad en ny post mappen visas med titeln "Registrering Correction".
- Applicera registreringen till en eller flera av bilderna av intresse genom att klicka på bildnamnet (Figur 2, markerat filnamn till vänster, pil # 2) och sedan välja "Verktyg | Korrekt registrering" (verktygsknappen intill Åtgärder).
- Välj en bild (Figur 2, markerat filnamn till vänster, pil # 2) och dra ett område av intresse (ROI) runt en enda cell med hjälp av freestyle regionen verktyget (Figur 2, pil 3 #). Använd Extended fokusläget (2D, rullgardinsmenyn på övre vänster) att observera cell som beskärningsverktyget fungerar bara i 2D visualisering.
- Högerklicka på bilden och välj "Beskär till markering" och en ny bildobjekt genereras.
- Välj den beskurna cellen genom att klicka på dess namn och sedan välja "Measurement" -fliken ovan (Figur 2, pil # 4).
- Att definiera och mäta internaliserade vesiklar för GFP, dra "Hitta objekt" under "Finding" (Figur 2, pil 5 #) i sekvens box (Figur 2, pil 6 #).
- Ställ in "Hitta objekt" Channel till GFP-kanalen.
- Öppna inställningar (hjul ikon i dialogrutan pil # 6) och ange4; Threshold använder: "till SD och" nedre gräns "till 6. Ställ" Minsta objektstorlek "till 0 pm 3.
OBS! SD undre gränsen kommer att bero på individuella experiment. Visuell bekräftelse att rätt objekt tröskel görs genom att undersöka olika tidpunkter (Figur 2, pil 7 #). Den "Mätning | Feedback alternativ" i dialogrutan används för att välja det sätt som valda tröskel föremål visualiseras (Figur 2, pil # 8). - Klicka på "Measure" i "Sök objekt" i dialogrutan (Figur 2 pil # 6) och välj kanaler och typ av mätningar. Typiskt, välj "Alla kanaler" och "intensitet och volymmätningar".
- Att definiera tröskel och filter för identifiering av hela cellen och för att mäta total GFP intensitet, upprepa stegen ovan (5.5.4 - 5.5.8) med hjälp av följande parametrar: SD 0 och "minsta objektstorlek" till 2 μ; m 3 i den andra "Hitta objekt" i dialogrutan för att identifiera celler med hjälp av GFP (Figur 2, pil 9 #)
- Drag "Filter Population" under "filtrering" till sekvensen rutan under befolkning 2 (den andra "Sök objekt" låda, figur 2, pil # 9). Välj "Volym (^ m 3> 100).
- Visuellt säkerställa att endast ett objekt identifieras. Hela cell bör tröskel och alla andra objekt filtreras bort. "Filter" parameter (s) kan behöva justeras om cellen är liten, till exempel.
- När mätningen har standardiserats, spara protokollet genom att högerklicka på bilden och välj "Spara protokoll" för att återanvända ( "Restore Protocol"). Protokollet kan också exporteras för att tillhandahålla en post i samma underkatalog som bilden.
- Fortsätt till "Gör Measurement" genom att välja "Mätningar | Gör Mätning Punkt" (Figur 2
- Ange rätt mätbeteckningen (kopiera klistra in från bilden är bekvämt) och analys kod eller datum (ett bra tillägg för registrering) och välj "varje tidpunkt". En ny kalkylbladsobjekt skapas under bilden. Håll filnamn koncis.
- Klicka på filnamnet kalkylbladet och välj fliken "Analysera". Bestäm om mättade voxlar finns genom att först välja "Begränsa Analys till:" välj Population 2 (cellen).
- Högerklicka på fältet under fliken "Analysera" och i dialogrutan under "Analysera dessa data:" välj "Max ([GFP färgkanal])"; under "Summerade per:" välj "Mean ([GFP färgkanal]", och under "Organisera data med" och "Rad" välj "Tidpunkt" och click "OK".
OBS: Om data innehåller mättade pixlar (t.ex. 65.536 för 16-bitars eller 4096 för 12-bitars), kommer analysen inte vara korrekt (det kommer att underskatta vesikler innehåll). Bortse från den cellen för analys. Om inte mättad, gå vidare till nästa steg. - Därefter under "Raw" -fliken och sedan under "Analys" -fliken och högerklicka data hitta "Begränsa Analys till:" välj sedan Population en för blåsor eller befolknings 2 för hela cellen.
- Under "Analysera dessa data:" välj "Sum" (GFP färgkanal); under "Summerade per:" välj "Sum"; och under "Organisera data med" och "Rad" välj "Tidpunkt" eller "Relativ tid" och klicka sedan på "OK". Analys val kan sparas och återanvändas.
- Välj och kopiera / klistra in direkt från bild kvantifiering programvara till ett tomt kalkylblad eller exportera kalkylbladsdata genom att högerklicka på data och välja Spara som CSV-fil. Hela cellintensitetsmätning kommer att ingå i mätningar av varje vesikel i populationen så se till att identifiera och skilja den från blåsor.
OBS: Efter att plotta data ökningen av den totala GFP fluorescens som finns i vesiklar snabbt stiger. Fotoblekning, om det inträffar, detekteras som förlust av totala cell GFP intensitet över tiden.
- I hitta objekt (Befolkning 1), som "Hitta objekt" kanal till den röda kanalen och i hjul ikon inom denna dialogruta anges av pilen # 6 (Figur 2) set "Threshold använder:" till SD och "nedre gräns" till 6. Ställ in "Minsta objektstorlek" till 0,017 pm 3.
OBS! SD undre gränsen kommer att bero på individuella experiment. Visuell bekräftelse att rätt objekt att tröskel bör göras av examenining olika tidpunkter. Den "Mätning | Feedback alternativ" i dialogrutan används för att välja det sätt som valda tröskel föremål visualiseras (Figur 2, pil # 8). - Klicka på "Measure" i "Sök" objekt "dialogen (Figur 2 pil # 6) och välj kanaler och typer av mätningar. Normalt" Alla kanaler "och" intensitet och volymmätningar "väljs.
- För Population 2, använda inställningar som är identiska med den som används för att identifiera hela transfekterad cell som uttrycker AT 1a R-GFP (5.5.9).
- Om flera celler (inklusive otransfekterade celler med fluorescerande färgämnespositiva vesiklar) är närvarande, beskära cellen vid det första steget av analysen är kritisk. Alternativt bör användningen av "compartmentalize" användas för att begränsa identifiering av lysosomer inom den transfekterade cellen som uttrycker AT 1a R-GFP. Lysosomer får endast identifieras inom GFP cellen ochinte från närliggande, otransfekterade celler.
- Analysera och exportera data som ovan.
OBS: Ett exempel på tröskel celler och vesiklar visas i Figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta representativt urval av experiment, var HEK celler med angiotensin typ 1a receptor (AT 1a R-GFP) konstruera (E1,2,3-AT 1a R) klonades in i pEGFP-N2-plasmiden 13. Time-lapse bilder av HEK förvärvades och spelade som en film (Se levande cell imaging en och levande cell imaging 2 filmer). Filmerna och stillbilder visar att efter ligand stimulering, AT 1a R-EGFPs är lokaliserade främst i plasmamembranet, men med tillägg av Ang II dessa receptorer blivit intern inom 2,5 minuter för att bilda ljusa vesiklar och vid senare tillfällen kluster i större vesiklar i en perinukleär zon (figurerna 4B, 5 och 6A, levande cell imaging 2).
Kvantifiering av totalt cell GFP intensitet och total vesikler GFP intensitet för cellen i Figur 5 provide en illustration av de komplikationer inneboende när Ang II framkallar ruffling och cellformförändringar omedelbart efter stimulering (figur 5A, pil på 0 min efter Ang II, övre raden, visar apelsin tröskel objekt). I senare tider, lokaliseringen av GFP-innehållande vesiklar i en perinukleär kluster stör också (figur 5A, röd pil på 29,5 min). Även om alla objekt bör ingå i den totala cell GFP intensitetsmätning, bör volanger uteslutas från vesikler mätningar som de representerar plasmamembranet AT 1a R-GFP. Däremot bör de klustrade perinukleära vesiklar inte uteslutas från vesikeln mätningen (den senare ses i ett område av cellen inneslutna i röda cirklar i figur 5A, pilen vid 29,5 min efter Ang II, nedre raden). Försök att åstadkomma detta genom storlek filtrering (mer eller mindre än 7 pm 3) inte var användbart eftersom det inte kunde diskriminera volanger och klustrade vesicles (Figurerna 5A och 5B, jämför Filter> 7, Filter <7, och inget filter). Ett möjligt alternativ skulle vara att dra en Regioner av intresse (ROI) som omfattar den cytoplasmatiska delen av cellen men exklusive ruffling kant och omkretsen av cellen. I slutändan skulle denna cell inte ingå i kvantitativa resultat eftersom det var mättade pixlar av GFP närvarande.
Ett andra representativt exempel visas i Figur 6A illustrerar ett tidsförlopp där autofokus inte användes. Den intern GFP visas som procent totalt cellulärt GFP (Figur 6B). De tidpunkter före den röda pilen på 3 min är vilseledande eftersom endast en del av cellen var i avbildningsvolymen men tre minuter efter Ang II Dessutom fokalplanet restabilized. Den totala GFP i cellen visar att denna cell inte photobleach märkbart över tiden (Figur 6C ). Mellan 3 och ca 12 min, procent GFP intensitet i vesiklar ökar sedan planar ut (Figur 6B). Därefter tillsattes lysosomer identifierats av fluorescerande färgämne som används för att identifiera ROI inom en transfekterad cell som därefter kvantifieras för summan av GFP intensitet (figur 6D). Efter tre minuter, inte intensiteten av AT 1a R-GFP i rött identifierade lysosomer inte variera över tid (Figur 3D, n = 5, medelvärde ± standardfel av medelvärdet). Det finns alltså ingen detekterbar ökning i leverans av AT 1a R-GFP till lysosomerna i upp till 24 minuter efter Ang II administration.
Figur 1: Mättade Pixlar identifierade i en uppslagstabell (LUT). Den röda pilen visar mättade pixlar som visas i blått.t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över Image Kvantifiering Software. Nyckelplagg indikeras med siffror och diskuteras inom metoder text. 1) Åtgärd post, 2) Vald bild, 3) fri hand ROI verktyg, 4) fliken Mätningar, 5) Hitta objekt, 6) Population en hitta objekt dialogrutan 7) Arrow aktiverande time lapse film, 8) Mätningar objekt 9) en andra hitta objekt dialogruta med ett filter Population kommando. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: färgregistrering korrigering. Bilder med okorrigerade ochkorrigerad registrering pixel visas tillsammans med inläggningar av flera colocalizing vesiklar innehållande 1a R-GFP. De röda pixlar skiftas en pixel åt vänster i XY-planet för den okorrigerade bilden. Inläggningar visar boxed områden med högre förstoring. Skala bar = 3,3 pm, voxel dimensioner = 0,138 x 0,138 x 1 mm 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Illustration av Tröskling att identifiera GFP- och fluorescerande färgämne-innehållande blåsor och GFP-helceller. (A) Identifiering av hela celler med hjälp av AT 1a R-GFP (GFP, övre raden) och tröskel GFP för hela cellen (ID Cell, nedersta raden) visas vid 0 och 2,5 minuter efter Ang II tillägg. Vita rutor indikerar inset områden som visas i (B) och (C). (B) AT 1a R-GFP jämförs vid 0 och 2. 5 min efter Ang II tillägg i enstaka färgbilder (översta raden). Blåsor som identifierats av tröskel visas i den nedersta raden (ID Ves, lila). (C) Två färgbilder (AT 1a R-GFP / fluorescerande färgämne) visas vid 0 och 2,5 minuter efter Ang II tillägg. Lysosomer identifierats av tröskel visas med röda konturer. Skala bar = 7,0 pm, voxel dimensioner = 0,114 x 0,114 x 1,4 pm 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Illustration av effekterna av Ruffles och klustrade Blåsor på Mätning av internaliserade GFP receptorer. (A) En T 1a R-GFP i Ang II behandlade celler vid 0 (översta raden) och 2,5 minuter (nedersta raden) visas i tre filtrerings experiment där i den första kolumnen ett filter har tillämpats för att välja endast föremål större än 7 pm 3, i andra kolumnen för att välja objekt mindre 7 pm 3, och i den tredje kolumnen inget filter användes. Tröskelnivån var konstant i alla tre. Pilar indikerar stora tröskel föremål, cirklarna indikerar ett område av cytoplasman innehållande perinukleära vesiklar vid senare tidpunkter. Tröskel områden är orange. (B) Kvantifiering av GFP totala intensiteten i vesiklar visas för tröskel områden med eller utan storleksfiltrering (genom kolonn i A) vid två tidpunkter (efter rad i A). Voxel dimensioner var 0,138 x 0,138 x 1 mm 3. Skalstreck = 5,6 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Tracking AT1 en R- GFP Interna och Potential lokalisering i Lysosomer. (A) Fem utvalda tidpunkter AT 1a R-GFP med Lysotracker Red visas från den medföljande filmen (levande cell imaging en film) vid 0, 3, 6, 9, och 12 minuter efter Ang II. Gallret representerar en enhetsskala av 6,56 um 3, voxel dimensioner var 0,297 x 0,297 x 1,2 pm 3, och z-steg = 1,2 pm. (B) Ett diagram över den procentuella totala GFP i vesiklar över tiden illustrerar den snabba internalisering av AT 1a R-GFP. (C) Ett diagram över den totala GFP i cellen över tiden visar att relativt lite fotoblekning inträffade under 24 min av avbildning. (D) Lysosomer identifierades genom att identifiera Lysotracker Röd-positiva vesiklar. Den totala GFP intensitet inom fluorescent färg positiv vesikler ROI mättes vid varje tidpunkt (normaliserad till den första tidpunkten med ingen ersättning för fotoblekning som inte oberoende uppmätt). (C - D) Före pilen mätningarna inte är giltiga eftersom fokus flyttats. N = 5, medelvärde ± standardfel av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Levande cell imaging 1: (Högerklicka för att ladda ner) HEK cell transfekterad med AT 1a R-GFP avbildades varje 1 minut under 24 min (25 bilder) efter tillsats av 100 nM Ang II. Film förvärvades med hjälp av en laserskanning konfokalmikroskop med en Plan-Apochromvid 63X / 1.4 NA olja mål, voxel dimensionerna 0,279 x 0,279 x 1,2 pm 3; och 5 skivor för totalt 4,794 um tjocklek avbildas vid 3.20 ps / pixel. Filmen hastigheten är 2 bilder / s. Enhet = 6,56 jim.
Film 2: levande cell imaging 2: (Högerklicka för att ladda ner) HEK cell transfekterad med AT 1a R-GFP avbildades var 30 s för 25 minuter (51 bilder) efter tillsats av 100 nM Ang II. Film förvärvades med hjälp av en laserskanning konfokalmikroskop med en Plan-Apochromat 40X / 1.4 NA olja mål. Voxel dimensioner var 0,11 x 0,11 x 1,4 pm 3. 7 segment för totalt 8,4 um tjocklek avbildades vid 3,72 s / ram. Filmen hastigheten är 3 bilder / s. Skalstreck = 7 | j, m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preliminära experiment som presenteras här visar att över en ganska kort tid under 24 minuter, ingen märkbar förändring i leveransen av AT 1a R-GFP till lysosomer inträffade. I allmänhet kan leverans av internaliserade receptorer lysosomer ske så tidigt som 15-20 minuter. Detta experiment är i överensstämmelse med hypotesen att den största delen av internaliserade AT 1a R är riktad till stora, perinukleära endosomer. Bevis för att åtminstone en del AT 1a R anländer i lysosomer visades av Li et al. , Som jämförde celler vid 5 min och 30 min efter behandling Ang II och fann signifikant samlokalisering av LAMP1 med AT 1a R vid 30 men inte 5 min 6.
Detta dokument ger en detaljerad beskrivning av cellberedningen, imaging och analysstegen och diskuterar de många inneboende fallgropar i denna avancerade avbildningsteknik. Denna metod beror på kritiska steg som diskuteras nedan.
Eftersom god hälsa celler är avgörande för varje levande cell imaging experiment, är det viktigt att undvika att använda celler bortom passage 11 på grund av förändringar i tillväxttakten och transfektionseffektivitet vid högre passager. För att bibehålla friska celler i hela experimentet bör inkubationstid transfektion blandas med celler inte överstiga 5 timmar sedan liposomlösningen är giftigt för celler framgår av ökad membranblåsbildning. Temperatur, luftfuktighet och CO 2 kontroll är betydande såväl före som under avbildning. Drivor i temperatur under avbildning kan orsaka relativt stora z-avsnitt drivor och förlust av fokalplanet stabilitet. Därför extra försiktighet rekommenderas vid tillsats av Ang II till cellerna under avbildning för att säkerställa att fokalplanet noggrant upprätthålls.
imaging
En fördel med levande cell imaging över immunfärgning med hjälp av fixerade celler äratt de in vivo-betingelser kan styras noggrant och artefakter associerade med fixerade celler kan undvikas. Emellertid kan levande cell imaging vara svårt att optimera för cellulära processer som är extremt snabb, som receptorinternalisering. Instrument hastighet och behovet av att undvika fotoblekning begränsa valet av händelser som kan studeras. Varje avbildning experiment kan kräva vissa val som ska göras i vissa parametrar och kompromisser i andra; exempel är val i pixelstorlek, linje ackumulation, zoomfaktor, och skanning hastighet för att få bra kvalitetsdata för analys och undvika översampling samtidigt. Kritiska beslut i dessa faktorer beror på att balansera behovet av att erhålla tillräcklig pixelstorleken att urskilja enskilda blåsor och behovet av att erhålla tillräcklig tidsupplösning av de händelser som inträffar. Således några kompromisser måste göras för att få information snabbt nog som cellen börjar internalisera GFP-märkt receptor. I vårfall, även om modern konfokal programvara kan föreslå den optimala pixelstorlek, våra experiment använde ett värde mindre än den optimala pixelstorleken enligt Nyquist ekvation 14. Optimala val av inställningar för andra experiment kommer också att bero på hur ljus cellerna eftersom större pixelstorlek möjliggör snabbare ackumulering av fotoner som möjliggör en avvägning med längre voxel uppehållstid för att samla fler fotoner.
För analys för att lyckas, live-cell imaging också kritiskt kräver noggrann fokus stabilisering under time-lapse avbildning. Focal skift samt underlåtenhet att bilden hela cellen kan ha stor inverkan på kvantifiering av receptorinternalisering samt totalt cellulärt GFP intensitet. Lösningen på detta problem med bränn skift under tidigaste tidpunkterna för avbildning efter tillsats av Ang II har tillhandahållits av konfokala tillverkare i form av autofokus lösningar där täck interferomgeometri med en IR-laser i kombination med återkoppling till automatiserad fokusstyrning används för att upprätthålla relativa avståndet från objektiv på täckglas ytan identifieras av IR-reflexion (t.ex. Bestämd Focus eller Adaptive fokuskontroll). Den återstående problemet med mikroskop är då att identifiera rätt z-intervallet, så att trots formförändringar, förblir hela cellen i avbildningsvolymen. Temperaturen är en annan viktig faktor för att bibehålla fokus / Z-position under första tidpunkter efter tillsats av Ang II. Temperaturen i målet samt levande cell imaging kammare bör hållas vid 37 ° C under hela experimentet.
En annan viktig del av avbildning, förvärvar bilder kvantitativt. Om en Hyd detektor används i Photon läge Räkna, måste avbildningsparametrarna ställas in så att foton pileup inte inträffar. För PMTs och andra detektorer, måste bilderna inte innehålla mättade pixlar (voxlar). I båda fallen, en specialized uppslagstabell (LUT) kan användas för att visualisera närvaron av mättade pixlar och naturligtvis om de är närvarande, bör mikroskop minska laserintensiteten och / eller vinst.
Analys
Även om den metod som beskrivs här anbringas till ATn 1a R receptor och dess colocalization med lysosomer, är den tillämpbar på experiment i vilka den relativa kvantiteten av receptorn i subcellulära fack märkta med olika fluorescerande taggar är på fråga. Om målet är att mäta huruvida receptor flyttas till organell, sedan använda en Pearsons colocalization koefficient med en markör för organell är problematisk. Varje pixel, där organellen är identifierad kommer att ha en hög mängd av markören, så att en av koefficienterna alltid kommer att vara nära 100%. Således kunde colocalization mätningar vara vilseledande. Å andra sidan, mätning av den procent av receptorn på organellen kontra totala mängden av recepTor är mycket mer informativ och tydligare att tolka. Ett fall i vilket protein colocalization kan bäst beskrivas med hjälp av Pearsons korrelationskoefficient vore AT 1a R-receptorn och LAMP1 vars interaktion har dokumenterats, om än med en mer sofistikerad colocalization strategi, nämligen FLIM / FRET 6.
Användningen av 3D-röntgen är mer exakt än att använda representativa skivor av celler med analys i 2D på grund av cellulära rörelser som är oundvikliga under tidsförloppet (Live Imaging 2 film). Det framgår av de levande cellbilder som visas i figurerna 3, 4B och 5A att receptorn är primärt lokaliserad vid plasmamembranet, men inom några minuter av exponering för Ang II den lokaliserar till ljusa fläckar på membranet och små vesiklar intill membranet, förmodligen belagda gropar och tidiga endosomer (figurerna 4B 4C). Med fortsatt progression av tid, vesiklarna rör sig genom cellen ackumulera i större vesiklar angränsande till kärnan som har beskrivits såsom multivesikulära endosomer (MVEs, fig 1, 5A) 3, 15. En enda skiva genom cellen över tiden skulle snedvrida internaprocessen och förvränga den verkliga händelser i synnerhet om skivan inte innehöll cellytan vid tidiga tidpunkter, och MVEs på senare tid.
I denna studie, kan två metoder för bildanalys minimera effekterna av fotoblekning av GFP liksom fluorescerande färg på kvantitativa resultat. Som celler photobleach (om än i begränsad omfattning), är den relativa ljusstyrkan av internaliserade vesiklar i förhållande till hela cellen intensitet bibehålls, förutsatt fotoblekning sker jämnt. Fluorescerande färgämne positiv vesiklar är också lätt identifieras genom att välja standard deviation av medelfluorescensintensiteten alternativ för tröskel ljusa internaliserade vesiklar. Detta skiljer dem från bakgrunds även när hela nivån på fluorescens minskar. Således, våra mätningar var inte känslig för effekterna av blygsam fotoblekning. Dock kan starka fotoblekning, såsom 50% förlust av cellintensiteten över tiden ha en större inverkan på kvantitativa resultat. Alternativt skulle effekterna av fotoblekning mätas oberoende i kontrollexperiment frånvarande Ang II i fallet med AT 1a R-GFP eller i angränsande otransfekterade celler i fallet med fluorescerande färgämnen. Effekterna av fotoblekning kan sedan vägas in vid analys.
ytterligare oro
På senare tid har cellbiologer genomfört kritisk bedömning och modifiering av fluorescerande proteiner för att övervaka membran handel med celler för att undvika artefakter som genereras av fluorescerande proteinet självt, oberoende av protein being taggade. Olika fluorescerande proteiner är känsliga för interaktion med lokala mikro leder till proteinutfällning eller tvärbindning baserat på deras pKa och närvaro av aminosyran cystein, respektive 16. Ett annat resultat av dessa interaktioner kan innebära förlust av fluorescens 16. Alla dessa artefakter påverkar kvantitativa mätningar av trafficking. Constantini et al. har genererat mono fluorescerande proteiner för avbildning som saknar cystein att eliminera potentiella artefakter 16. Således, beroende på målet för imaging experiment, byta från EGFP (icke-monomera) till ett monomert, skulle cystein-fri form vara fördelaktigt för studier av sura och / eller reducerande vesikulära mikromiljöer. Ett annat exempel skulle vara deras förbättrade verktyg för FRAP eller FRET experiment där multimerise och tvärbindning skulle påverka protein diffusion och protein-proteininteraktioner.
En annan potentiell artefakt att tänka på när avbildning lysosomer använder Lysotracker Red tillsammans med GFP fusionsproteiner är att Lysotracker Red har visat sig kunna photoconversion till grönt 17. Författarna rekommenderar att användningen av epifluorescence belysning minimeras, diskutera förekomster av denna artefakt, och hänvisar till framgångsrika fall av colocalization använder denna reagens. Dessutom kan andra markörer för lysosomerna också användas för att kontrollera colocalization resultat, till exempel, taggade LAMP1 6.
I framtiden kan undersökas för receptormålsökning till lysosomer liksom andra subcellulära fack genom att använda hämmare av vesikler transporter och / eller fusion kan känsligheten och specificiteten för denna analys, genom att hämma lysosom försurning använder bafilomycin att blockera nedbrytning men inte ansamling 7, 18 , genom att använda klorokin att blockera fusion med lysosomer följaktligen blockerande co-lokalisering av receptorn med lysosomer 2, 5, 6, 7, 18, genom användning av positiva kontroller, såsom målsökning av märkt Ang II till lysosomer 2, och genom jämförelse med andra väl -described receptor och ligand system såsom transferrin eller epidermal tillväxtfaktor och deras besläktade receptorer 3. En intressant positiv kontroll, enlbeit artefactual, i våra experiment var ett resultat observerades i angränsande, otransfekterade, AT 1a R-GFP-negativa celler. Dessa celler tog tydligen upp GFP frigörs från transfekterade celler och riktade den till lysosomer där samlokalisering med fluorescerande färg var ganska framträdande (ej visad). Detta colocalization var dock inte känslig för Ang II som förväntat.
Sammanfattningsvis, de metoder för transfektion, bildframställning, och bildanalys presenteras här ger ett medel med vilket receptorinternalisering till olika subcellulära avdelningar kan kvantitativt spåras inom levande celler över tiden. Relativa jämförelser mellan olika receptorer eller selektivt muterade receptorer är möjligt med hänsyn till kinetik och subcellulära lokalisering till specifika avdelningar. Eventuella svårigheter och artefakter i samband med denna teknik diskuteras. Icke desto mindre kan snabbt levande avbildning i 3D tillsammans med bildanalys kan användas för att mäta receptorupptag och snabbövergångar genom cytoplasman till molekylärt definierbara fack. Detta skapar förutsättningar för mätning av skillnader till följd av mutation av receptorn eller tillämpningen av agonister, antagonister och hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet forskning som presenteras i detta manuskript stöddes av bidrag R01 HL121456-01A1 till Kathryn Sandberg. Detta arbete stöddes dessutom av tillgången på en Leica SP8 AOB-bakterier i Mikroskopi och Imaging delad resurs (MISR) vid Georgetown University Medical Center som delvis finansieras av P30-CA051008 från National Institutes of Health i USA. Vi tackar Leica SP8 avbildning hjälp av Peter Johnson, och användningen av Zeiss LSM880 i laboratorium Thomas Coate, Biologiska institutionen vid Georgetown University med avbildning bistånd från Alma Arnold Carl Zeiss Microscopy LLC. Innehållet i detta manuskript är enbart ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
