Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Published: March 27, 2017 doi: 10.3791/55177
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2, 4
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Summary

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Abstract

Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om gelijktijdig vastleggen time-lapse beelden type 1a angiotensine receptoren (AT 1a R) en intracellulaire compartimenten in getransfecteerde humane embryonale nier-293 (HEK) cellen na stimulatie met angiotensine II (Ang II). HEK cellen tijdelijk getransfecteerd met plasmide DNA dat op 1a R tag versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP). Lysosomen worden geïdentificeerd met een rode fluorescerende kleurstof. Levende cellen beelden worden vastgelegd op een laser scanning confocale microscoop na Ang II stimulatie en software geanalyseerd in drie dimensies (3D voxels) tijd. Live-cell imaging maakt onderzoek naar receptoren handel en vermijdt verwart geassocieerd met fixatie, en met name het verlies of artefact verplaatsing van EGFP-gelabelde membraanreceptoren. Dus, zoals afzonderlijke cellen worden gevolgd in de tijd, de subcellulaire lokalisatie van receptoren kunnen worden afgebeeld en gemeten. Afbeeldingen moeten worden verworven sufficiently snel tot een snelle blaasje beweging vast te leggen. Maar bij hogere belichtingssnelheden, het aantal fotonen verzameld verminderd. Compromissen moeten worden gemaakt in de keuze van beeldvormende parameters zoals voxel om beeldvorming snelheid te winnen. Significante toepassingen van levende cellen beeldvorming om eiwittransport, migratie, proliferatie, celcyclus, apoptose, autofagie en eiwit-eiwit interactie en dynamiek bestuderen om maar enkele te noemen.

Introduction

Het algemene doel is om kwantitatieve gegevens in tijd en ruimte van de receptor colocalization met specifieke subcellulaire organellen krijgen na behandeling met een receptor agonist. Aldus onmiddellijke doel is hier om time-lapse confocale beelden van lysosomen en een transmembraan spanning receptor in humane embryonale niercellen (HEK) na transfectie en vervolgens verzamelen en analyseren van de beeldgegevens in 3D kwantitatief meten van de afgifte van receptor vastleggen lysosomen. Onderzoeken van de gelijktijdige handel in een transmembraan receptor met lysosomen of andere organellen tijdens endocytose wanneer geactiveerd door receptor ligand kan helpen bepalen hoe de transmembraan receptor wordt gereguleerd onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

AT 1a R wordt geacht te zijn afgebroken in lysosomen na behandeling met Ang II model celsystemen, vooral HEK293 1 hoewel de meerderheid van receptors zijn voornamelijk gelokaliseerd in multivesiculaire recycling endosomen voor latere overdracht naar de plasmamembraan terwijl het grootste deel van de ligand, Ang II, afgebroken in het lysosoom 2, 3, 4, 5. Meer recent, Li et al. aangetoond met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) technieken die op 1a R colocalizes (op ~ 10 nm schaal) LAMP1, een lysosomale membraaneiwit suggereren dat ten minste enkele van de receptor is gericht op en afgebroken door lysosomen 6. Deze auteurs opgemerkt dat de lysosomale remmer chloroquine geblokkeerde AT 1a R-LAMP1 vereniging die is in overeenstemming met eerdere rapporten suggereren dat een effect van chloroquine is om fusie van de late endosomen of autofagosomen met lysosomen te blokkeren. Andere indirecte methoden om te bepalen op 1a R localization in lysosomen hebben gebruikt bafilomycine, een lysosomale remmers afgeleid op 1a R aanwezig in lysosomen 3, 4, 5, 6, 7, 8.

Live-cell imaging vermijdt mogelijke gevolgen van fixatie op celvolume en verlies / dimmen / herverdeling van GFP-chimere receptor. Eerdere studies hebben ingeroepen gefixeerde cellen aan colocalization of samen voorkomen van de receptor met lysosomen of met levende cellen gemerkt met receptorbinding surrogaten bepalen zoals β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging van andere GPCR's met behulp van draaiende schijf confocale laser of point scanning confokale microscopen uitgerust met de Gaasp of hyd detectoren ingeschakeld onderzoekers aan de internalisering van en handel in receptoren in individuele cellen afgebeeld in z-stacks op 30 s intervallen 9, 10 observeren. Maar zelfs als levende cellen z-stacks snel worden verzameld, kan de analyse pas na selectie van een enkel vlak binnen elke stapel, dwz in 2D 10. Hoewel dit voldoende kan zijn voor het bestuderen van geïnternaliseerde GPCR of tyrosine kinase receptor in kwestie, de AT 1a Rs ophoopt in blaasjes die grootte en de positie in de tijd en zijn derhalve inherent moeilijk voldoende monster met een representatief snee op elk tijdstip. Om de route van het gemerkte AT 1a R door de cel en elke subpopulatie van vesicles die verschillen in grootte en positie detecteren grondig te bepalen, hebben wij een methode ontwikkeld voor 3D beeldvorming en 3D analyse om deze veranderingen te volgen en te in combinatie met kenmerken van verschillende intracellulaire compartimenten zoals lysosomen.

Onderzoekers kunnen dit protocol live-cell imaging om de beweging van AT 1a R direct zichtbaar in de cel en het naar subcellulaire compartimenten na Ang II stimulatie. Subcellulaire compartimenten zijn gelabeld met fluorescerend eiwit chimaera's of andere fluorescente merkers. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een eerste benadering van receptoren in subcellulaire organellen met een minimale resolutie van 200 nm lokaliseren ter vergelijk gemuteerd versus wild-type receptoren of aan veranderingen na farmacologische behandelingen detecteren. De techniek is bereikbaar omdat het op elke confocale microscoop uitgerust voor levende cellen beeldvorming kan worden uitgevoerd. Het relatieve gemak van deze benadering contrasteert met verhoogde deskundigheid en apparatuur die nodig FRET / FLIM / BRET technieken welke moleculaire interacties detecteren 6 uit te voeren,"xref"> 11. Deze metingen definiëren eiwit-eiwit interacties met hoge resolutie (~ 10 nm) en lokalisatie binnen subcellulaire organellen is afgeleid. Deze meer geavanceerde technieken worden gebruikt om te volgen en verder te definiëren moleculaire interacties plaats, in plaats van de doorgang van receptoren, subcellulaire compartimenten en zij rechtstreeks eiwit-eiwit interacties op bepaalde tijdstippen en plaatsen aantonen binnen de cel 11. FLIM, een FRET techniek onafhankelijk van de acceptor concentratie, wordt meestal uitgevoerd op vaste monsters sinds beeldacquisitie is langzamer. Daarentegen verhouding FRET biedt snelle beeldvorming en hoge resolutie colokalisatie van interagerende eiwitten. Het nadeel van verhouding FRET is dat beeldvorming gebruikt groothoek epi-fluorescentie imaging snelheid te winnen en de gehele cel, wat resulteert in gereduceerde resolutie en contrast van organellen 12 omvatten. Bioluminescentie resonantie energie-overdracht (BRET) is een andergeavanceerde techniek die is toegepast op GPCR's aan de overname van de moleculaire nabijheid te meten in de tijd 11. In deze techniek een eiwit fluorofoor moleculair verdeeld en elke helft gekoppeld aan één van twee eiwitten betrokken. Wanneer de twee eiwitten van belang binden elkaar, het delen van het chimere tag opnieuw assembleren fluorescentie en de verhoogde fluorescentie gekwantificeerd tijd krijgen.

Hier presenteren we een eenvoudige techniek voor live cell imaging in combinatie met image kwantificering tot smokkel van AT 1a R studeren in de cel na Ang II stimulatie en de mogelijke verandering in de levering van geïnternaliseerde AT 1a R om lysosomen na Ang II stimulatie. Het uiteindelijke gebruik van deze techniek is om verschillen in membraantransport vergelijken wildtype en gemuteerde receptoren te karakteriseren. Deze verschillen zullen helpen om het mechanisme (s) die van invloed zijn fysiologische activiteiten van AT 1a R leadi identificerenng tot regulering van de bloeddruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag een

1. Cel zaaien

  1. Bereid compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM). Voeg 50 ml foetaal runderserum, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml L-glutamine tot 450 ml DMEM tot 500 ml te maken van compleet DMEM aangevuld met foetaal runderserum (10%), penicilline / streptomycine (1%) en L-glutamine (1%).
  2. Seed humane embryonale nier (HEK) cellen, passage nummer 11/06 op 50.000 / putje in een 8 goed chambered dekglaasje systeem in volledige DMEM.
  3. Handhaaf de chambered glijbaan bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur.

Dag twee

2. Liposoom Transfectie

  1. Vers maken AT 1a R-GFP plasmide en liposoom-oplossingen met behulp van steriele omstandigheden met een bioveiligheidsniveau 2 kast.
  2. Verdun 2 pi plasmide-DNA in 900 ng / ul voorraadoplossing in 178 ui gereduceerd serum medium een ​​concentrat bereikenion van plasmide-DNA van ongeveer 10 ng / ul.
  3. Verdun 4,5 pi van liposoom voorraad oplossing in 175,5 ul van verminderde serum media om een ​​1:40 verdunning van de voorraad te creëren.
  4. Voeg de liposoomoplossing het plasmide-oplossing en meng met een pipet 1 ml pipet op en neer 20 keer om de transfectie oplossing te mengen.
  5. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (25-27 ° C).
  6. Terwijl dit mengsel te incuberen, verwijder de langzaam met 1 ml pipet en voeg langzaam 400 ul van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die vooraf verwarmd tot 37 ° C.
  7. Verwijder de PBS en vervangen door 200 ul / putje gereduceerd serum medium voorverwarmd tot 37 ° C.
    LET OP: Wees voorzichtig bij alle stappen bij het wassen van de cellen om losmaken van cellen van het dekglaasje te voorkomen als gevolg van pure stress veroorzaakt door pipetteren.
  8. Handhaaf de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 30 minuten.
  9. Zodra deincubatieperiode voorbij is, voeg 80 ul transfectiemix aan elk putje en incubeer de cellen gedurende 4,0-4,5 uur maar niet meer dan 5 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
  10. Na de transfectie incubatietijd is voltooid, langzaam verwijderen van de inhoud van de kamers met een 1 ml pipet en voorzichtig vervangen door 300 pl / putje volledig DMEM en incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 .

Dag drie

3. Serum Starvation

  1. Verwijder het medium voorzichtig met een pipet 1 ml en langzaam vervangen door 300 gl serumvrij DMEM zonder fenolrood.
  2. Handhaaf de kamer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 10-12 uur.

dag vier

4. Live-cell imaging

  1. Vlek intracellulaire compartimenten (lysosomen in dit geval).
    1. about 30 min voorafgaand aan lysosomen beeldvorming in cellen, voeg 22,5 ul van een 1 uM fluorescerende kleurstof voorraadoplossing (0,5 gl 1 mM fluorescente kleurstof opgelost in 499,5 gl serumvrij DMEM zonder fenolrood) aan elk putje om een ​​uiteindelijke kleurstofconcentratie van 75 nM.
    2. Incubeer 25-30 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 en verwijder voorzichtig de kleurstof en langzaam vers serumvrij DMEM voeg 300 ul zonder fenolrood.
  2. Bereid de microscoop voor beeldvorming.
    1. Stel de fase om schade aan de lens tijdens het opstarten van een geautomatiseerde microscoop voorkomen.
    2. Schakel de stroom microscoop, scanner vermogen, laservermogen en laseremissie, en tenslotte het metaalhalogenide lamp voor visuele waarneming (zie confocale microscoop instructies van de fabrikant).
    3. Open de imaging software programma en in de software afslag op de argon (488 nm) laser en vermogen tot 30-50%. Let op de stroom afhangtleeftijd laser. In experimenten is het cruciaal om constant instellingen te behouden.
    4. Zet op rood-emitterende laser (bv 568 nm of 594 nm).
    5. Set imaging formaat naar 12-bit diepte.
    6. Stel de pinhole voor de argon laser lijn 488 nm en voor de 568 nm of 594 nm laser tot 1 Airy disk unit. Als de GFP is erg zwak, gebruik dan een instelling van 2 Airy disk eenheden, maar op de juiste wijze overeenkomen met de kanalen.
    7. Bij het gebruik van dichroïsche filter sets, selecteert u de juiste emissie-golflengten voor GFP en de fluorescerende kleurstof. Of zet de emissiegolflengte (Em) bij 499-580 nm voor GFP en Em 599-680 nm voor de rode-emitterende fluorescerende kleurstof.
    8. Controleer of bloeden door en crossover niet voorkomen. Schakel elke laser op zijn beurt en laat zowel de emissie-kanalen voor elk. Wanneer de Argon laser is uitgeschakeld, moet de groene emissie nul. Wanneer de groene emitterende laser is uitgeschakeld, moet de rode emissie kanaal nul.
      LET OP: De veiligste methode is om het beeld elk in afzonderlijke tracks (loverttieel).
    9. Onder andere een helderveld kanaal indien gewenst. Vermijd differentieel contrast imaging (DIC), omdat het colocalisatie metingen kunnen scheef.
    10. Voor live imaging, selecteer lijn sequentiële dan Frame Sequential.
  3. Selecteer de cellen voor beeldvorming.
    1. Gebruik van een 1,4 numerieke apertuur (NA) doel, zoals een 63x / 1,4 NA olie doelstelling afbeeldingscellen (of 40X / NA 1,4). Centreer de doelstelling en voeg een druppel hoge viscositeit, lage autofluorescentie immersie olie op het doel.
    2. Breng de kamer met de getransfecteerde cellen uit de incubator tot het stadium van de microscoop. Wees voorzichtig om de dia's plat te houden en ervoor te zorgen dat de kamer goed op zijn plaats zit en weerhouden van beweging.
    3. Beweeg het doel tot de druppel olie onder de bodem van de slede raakt; de juiste focal plane ligt in de buurt van deze positie. In automatische microscopen, dan deze positie en de onderste stand gebruiken voor de remainder van de beeldvorming experiment te faciliteren veranderende monsters.
    4. Kies dim cellen. Overexpressie AT 1a R-GFP zal de receptor in de cel misleiden en verstoren de normale functie.
    5. Controleer of de omtrek van de cel bepaald door de plasmamembraan, zichtbaar en bij voorkeur niet overlapt met andere cellen.
    6. Focus en centreren de cel in het gezichtsveld.
    7. Overschakelen naar confocale mode.
    8. Selecteer een snelle imaging-modus. Met één hand op de focus controle en de andere op het podium XY control, focus en centreren van de cel van belang zijn zichtbaar op de monitor.
    9. Controleer of de cel van belang goed verspreid en de bodem- of buikzijde afgewisseld samen met het dekglaasje door te focussen op en neer door de cel.
  4. Stel de z-stage parameters beeld een cel in 3D.
    1. Selecteert u de toets voor de Z-stack bovenste en onderste venster (of equivalent) en gericht naar de bodem van de cell druk op 'begin'. Vervolgens richten zich naar de top van de cel en druk op de "end." Controleer opnieuw dat de gehele cel in de z-stack.
    2. Stel de Z-stapgrootte 1,0 urn.
  5. Stel imaging-instellingen.
    1. Selecteer Zoom 2, afhankelijk van de lens, zodat de uiteindelijke pixelgrootte ongeveer 0,279 urn x 0,279 urn tot 0,14 urn x 0,14 urn in het XY dimensie.
    2. Voor HEK cellen in dit experiment, stelt scansnelheid tot ongeveer 1 microseconde per voxel en selecteer 2 middeling of 2 ophopingen door lijn, afhankelijk van de helderheid van cellen.
    3. Pas laserintensiteit en krijgen voor beeldvorming van GFP en de fluorescerende kleurstof. In het algemeen zal counterstains veel helderder Photomultiplier detector (PMT) en niet galliumarsenide fosfide (Gaasp) of Hybrid detectoren (Hyd) moet worden gebruikt voor deze tweede kleur kanaal terwijl snik en hyd detectors nodig zijn voor het GFP-kanaal en daarom. Als de HYD of Gaasp detecterenors worden gebruikt voor de fluorescerende kleurstof uitoefenen voorzichtigheid en beginnen met de laser op een extreem laag vermogen.
    4. Stel de duur van de scan en de frequentie van het scannen, bijvoorbeeld elke 30-60 s meer dan 25 minuten of langer te zien targeting van AT 1a R-GFP te lysosomen.
    5. Zet de autofocus aan focal plane stabiliteit in de tijd te handhaven.
  6. Begin de beeldvorming experiment.
    1. Bereiden op voorhand 100x Ang II voorraad bij 5 ug / ul (4,7793 mmol) en voeg 2,1 pi van deze 998 ul medium (10 pm).
    2. Begin ligand stimulatie door toevoeging van 3 pi van een voorraadoplossing van 100x ligand (Ang II) het putje met 300 ul onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming (eindconcentratie 100 nM).
    3. Klik op de afbeelding start en in 3D voor de gewenste tijd en frequentie.
    4. Voor het einde van het werk bij de microscoop, het verzamelen van een z-stack voor later gebruik in de achtergrond aftrekken tijdens de analyse. In foton telmodus, dit is nietnodig omdat de achtergrond in hoofdzaak 0. verlichting ingeschakeld en alle andere beeldvormende omstandigheden hetzelfde, maar zonder monsterneming een voorbeeldafbeelding. Zie Achtergrond aftrekken (zie hieronder) onder analyse.

dag vijf

5. Image Analysis

  1. Afbeeldingen Exporteren naar TIFF-formaat.
    1. Klik met de rechtermuisknop op de naam van het beeldbestand om menu's te zien en selecteer Exporteren of klik op Bestand | export | importeren.
    2. Exporteren naar tiff voor verdere analyses en zorg ervoor dat de RAW, 12-bit data [niet de 'Red Blue Green' (RGB) conversie gebruikt voor publicatie kwaliteit foto's] exporteren. Niet naar jpeg-formaat exporteren.
    3. Let op de X, Y, Z voxel afmetingen en de grootte z-stap om later tijdens beeldanalyse. Bijvoorbeeld met behulp van een 40x / 1,4. NA objectief van deze waarden kunnen 0,138 micrometer x 0,138 urn met 1 micrometer z-stapgrootte (zie gegevens in de resultaten representatief gedeelte) zijn.
  2. <strong> image stack voor analyse.
    1. Afbeelding openen Kwantificering software (figuur 2)
    2. Gebruik "Actie | Nieuw | Beelden uit de geselecteerde sequentie" naar een enkel bestand afbeelding van geïmporteerd enkele sequenties (figuur 2, pijl # 1) te genereren.
    3. Voer het aantal kanalen, het aantal z-profielen, en het aantal tijdstippen.
    4. Afhankelijk van de structuur van de * TIFF bestanden selecteert, bijvoorbeeld, kanalen, z-vlak en tijdstippen de volgorde van de beeldvlakken. Controleer of het uiteindelijke beeld stapel correct vertegenwoordigt de kleur kanalen, z-stack, en de tijdstippen van het originele beeld.
    5. Selecteer de afbeelding naam (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2). Klik met de rechtermuisknop op het beeld en / of het beeldveld, en uit de opties aan de onderkant van de lijst selecteer "Eigenschappen". In de urn pixel voor (X) (Y) en (Z) grootte, voert u het juiste beeld eigenschappen zoals hierboven vermeld.
  3. Aftrekken achtergrond voorafgaand aan beeldanalyse. Achtergrondcorrectie kan op elke beeldanalyse software. Aftrekken achtergrond met behulp van één van de twee opties.
    1. Optie 1: Kies "Actie | Nieuwe | Achtergrond Aftrekken" (figuur 2, pijl # 1). Gebruik de verworven afbeelding achtergrond verkregen aan het einde van de opnamesessie hierboven beschreven als de "Dark Reference" Afbeelding onder "Tools | Aftrekken Background".
    2. Optie 2: Controleer de donkerste gebieden in het beeld waar geen monster bereken de gemiddelde of maximale helderheid van pixels in dat gebied ervan, wanneer buitengewoon heldere pixels die parasitaire fluorofoor, een willekeurig defecte pixel of een ander verschijnsel kan zijn. Selecteer "Actie | Nieuwe | Achtergrond aftrekken". Gebruik deze helderheid pixel (negatieve gemaakt) als offset.
  4. Controleer of de kleur registratie en corrigeer indien nodig.
      (figuur 3) beoordeling van de noodzaak voor de correctie door te schakelen ofwel de rode of groene kleur kanaal uit en weer aan. Visueel, als de registratie is uitgeschakeld door nog 1 pixel, is het duidelijk voor het oog.
    1. Genereer een registratie correctie door te kiezen voor "Acties | Nieuw | Registratie Correction" (figuur 2, pijl # 1) en gebruik het dialoogvenster om aanpassingen te maken. Na voltooiing van een nieuwe map onderdeel zal verschijnen met de titel "Registratie Correction".
    2. Breng de registratie van één of meer van de beelden van belang door te klikken op de afbeelding naam (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2) en vervolgens te kiezen voor "Extra | correcte registratie" (Tool knop naast acties).
  5. Maak meting sequentie te analyseren AT 1a R-GFP blaasje en volledige cel intensiteit volgendebehandeling met Ang II.
    1. Selecteer een afbeelding (figuur 2, benadrukt bestandsnaam links, pijl # 2) en teken een regio van belang (ROI) rond een enkele cel met behulp van het freestyle regio gereedschap (figuur 2, pijl # 3). Gebruik de uitgebreide Focus-modus (2D, drop-down menu in de linker bovenhoek) naar de cel te observeren als het bijsnijden tool werkt alleen in 2D visualisatie.
    2. Klik rechts op de afbeelding en selecteer "Crop naar selectie 'en een nieuw beeld item wordt gegenereerd.
    3. Selecteer de bijgesneden cel door te klikken op de naam en selecteer het tabblad 'Meting "hierboven (figuur 2, pijl # 4).
    4. Te definiëren en te meten geïnternaliseerd blaasjes voor GFP, drag "Find Objects" onder "Finding" (figuur 2, pijl # 5) in sequentie box (figuur 2, pijl # 6).
    5. Stel "Find Objects" Channel aan het GFP-kanaal.
    6. Open instellingen (wiel pictogram in het dialoogvenster pijl # 6) en stel4; Drempel met: "naar SD en" ondergrens "tot 6. Set" Minimumformaat object "naar 0 micrometer 3.
      NB: De SD ondergrens zal afhangen van de individuele experimenten. Visuele bevestiging dat de juiste objecten thresholded gemaakt door onderzoek verschillende tijdstippen (figuur 2, pijl # 7). De "Measurement | Beoordeling Opties" dialoogvenster wordt gebruikt om de wijze waarop thresholded geselecteerde objecten worden gevisualiseerd kiest (figuur 2, pijl # 8).
    7. Klik op "Measure" in "Zoek objecten" dialoogvenster (Figuur 2 pijl # 6) en selecteer de kanalen en het type van de metingen. Typisch, selecteer "Alle kanalen" en "Intensiteit en Volume Metingen".
    8. De drempelwaarde en filters definiëren voor identificatie van de gehele cel en totale GFP intensiteit meten Herhaal de bovenstaande stappen (5.5.4 - 5.5.8) met de volgende parameters: SD 0 en "minimale objectgrootte" tot 2 μ; m 3 in de tweede "Find objecten" dialoogvenster om cellen met behulp van GFP te identificeren (figuur 2, pijl # 9)
    9. Drag "Filter Bevolking" onder "Filtering" om de volgorde vak onder de bevolking 2 (de tweede box "Find Objects", figuur 2, pijl # 9). Selecteer "Volume (micrometer 3> 100).
    10. Visueel gewaarborgd dat slechts één voorwerp wordt geïdentificeerd. De gehele cel moet worden thresholded en alle andere objecten gefilterd weg. De "Filter" parameter (s) kan een aanpassing nodig als de cel is klein, bijvoorbeeld.
    11. Zodra de meting is gestandaardiseerd, sla het protocol door met de rechtermuisknop te klikken op de afbeelding en selecteer "Save Protocol" met het oog op hergebruik ( "Restore Protocol"). Het protocol kan ook worden geëxporteerd naar een record te bieden in dezelfde submap als het beeld.
    12. Ga verder met "Make Measurement" door "Metingen | Maak Measurement Item" (figuur 2
    13. Voer de juiste meting naam (kopieer en plak uit het beeld is handig) en analyse-code of de datum (een handige toevoeging voor het bijhouden) en selecteer "alle tijdspunten". Een nieuw werkblad post zal worden gecreëerd onder het beeld. Houd bestandsnamen beknopt.
  6. Te analyseren en de gegevens te exporteren.
    1. Klik op de bestandsnaam werkblad en selecteer het tabblad "Analyseren". Bepaal of verzadigd voxels aanwezig door eerst te kiezen voor "Beperk Analyse aan:" zijn te selecteren Bevolking 2 (de cel).
    2. Klik met rechts op het veld onder het tabblad "Analyseren" en in het dialoogvenster onder "Analyseer deze gegevens:" selecteer "Max ([GFP kleurkanaal])"; onder "Samengevat door:" select "Mean ([GFP kleurkanaal]", en onder "Organiseer de gegevens door:" en "Rij" select "Timepoint" en click "OK".
      LET OP: Als de gegevens bevat verzadigde pixels (bijvoorbeeld 65536 voor 16-bits of 4096 voor 12-bit), zal de analyse niet klopt (het zal blaasje inhoud onderschatten). Negeer die cel voor analyse. Zo niet verzadigd, ga dan naar de volgende stap.
    3. Vervolgens onder het tabblad "Raw" en vervolgens onder het tabblad "Analysis" en rechts-klikken op de gegevens te vinden "Beperk Analyse aan: 'en selecteer Bevolking 1 voor blaasjes of Population 2 voor de gehele cel.
    4. Onder "Analyseer deze gegevens:" select "Sum" (GFP kleurkanaal); onder "Samengevat door:" "Sum" te selecteren; en, in het kader van "Het organiseren van de gegevens door:" en "Rij" select "Timepoint" of "Relative Time" en vervolgens op "OK". Analyse selecties kunnen worden opgeslagen en hergebruikt.
    5. Selecteren en copy / paste direct uit afbeelding kwantificatie software naar een lege spreadsheet of de spreadsheet gegevens exporteren door rechts te klikken op de DATeen en het selecteren opslaan als CSV-bestand. De gehele cel verschillende meetwaardes zullen worden opgenomen in de metingen van elk blaasje in de populatie dus zorg ervoor om te identificeren en te scheiden van de blaasjes.
      OPMERKING: Na het uitzetten van de gegevens stijgt de totale GFP fluorescentie opgenomen in vesicles snel stijgt. Fotobleken, als het zich voordoet, wordt gedetecteerd als verlies van totale cellen GFP-intensiteit in de tijd.
  7. Maak meting volgorde om GFP aanwezig in lysosomen te analyseren.
    1. In de objecten te vinden (Bevolking 1), ingesteld "Find Objects" Channel voor het rode kanaal en in het wiel icoon binnen die dialoogvenster aangegeven door pijl # 6 (figuur 2) set "Drempel met:" naar SD en "ondergrens" naar 6. Stel "Minimumformaat object" naar 0,017 micrometer 3.
      NB: De SD ondergrens zal afhangen van de individuele experimenten. Visuele bevestiging dat de juiste objecten worden thresholded moet worden gemaakt door examenining verschillende tijdstippen. De "Measurement | Beoordeling Opties" dialoogvenster wordt gebruikt om de wijze waarop thresholded geselecteerde objecten worden gevisualiseerd kiest (figuur 2, pijl # 8).
    2. Klik op "Measure" in "zoeken" objecten "dialoogvenster (Figuur 2 pijl # 6) en selecteer de kanalen en soorten metingen. Typisch," Alle kanalen "en" Intensiteit en Volume Metingen "worden geselecteerd.
    3. Voor Population 2, gebruik instellingen hetzelfde als bij de hele getransfecteerde cel die op 1a R-GFP (5.5.9) te identificeren.
    4. Als meerdere cellen (inclusief getransfecteerde cellen met fluorescerende kleurstof-positieve vesicles) aanwezig zijn, snijden de cel in de eerste fase van het onderzoek kritisch. Als alternatief kan het gebruik van "grendelen" worden gebruikt om identificatie van lysosomen binnen de getransfecteerde cel die op 1a R-GFP beperken. Lysosomen mag alleen worden geïdentificeerd binnen de GFP cel enniet uit de buurt, ongetransfecteerde cellen.
    5. Analyseren en exporteren van gegevens als hierboven.
      Opmerking: Een voorbeeld van thresholded cellen en blaasjes is weergegeven in figuur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In deze representatieve reeks experimenten werden HEK cellen getransfecteerd met type 1a angiotensine receptor (AT 1a R-GFP) construct (E1,2,3-AT 1a R) gekloneerd in het plasmide pEGFP-N2 13. Time-lapse beelden van HEK werden verworven en speelde als een film (zie live cell imaging 1 en live cell imaging 2 films). De films en foto blijkt dat na ligand stimulatie, AT 1a R-EGFPs zijn voornamelijk gelokaliseerd in het plasmamembraan, maar met de toevoeging van Ang II deze receptoren worden geïnternaliseerd binnen 2,5 minuten tot helder blaasjes vormen en op latere tijdstippen clusteren in grotere blaasjes een perinucleaire zone (figuren 4B, 5 en 6A, live cell imaging 2).

Kwantificering van totaal cel GFP intensiteit en totale vesicle GFP intensiteit van de cel in figuur 5 provide een illustratie van de complicaties die inherent zijn wanneer Ang II induceert ruffling en celvorm veranderingen onmiddellijk na stimulatie (Figuur 5A, pijl op 0 min na Ang II, bovenste rij, oranje geeft aan thresholded objecten). Op latere tijdstippen, de lokalisatie van GFP-bevattende vesicles in een perinucleaire cluster interfereert ook (Figuur 5A, rode pijl bij 29,5 min). Hoewel alle voorwerpen moeten worden opgenomen in de totale cel GFP intensiteit meting dient de ruches worden uitgesloten van vesicle metingen mocht plasmamembraan vertegenwoordigen AT 1a R-GFP. Daarentegen moet de geclusterde perinucleaire blaasjes niet buiten de vesicle meting (deze worden gezien in een gebied van de cel omsloten rode cirkels in figuur 5A pijl bij 29,5 min na Ang II, onderste rij). Pogingen om dit te bereiken grootteklasse filtering (meer dan of minder dan 7 pm 3) niet bruikbaar, omdat het niet ruches en geclusterde v kon onderscheidenesicles (figuren 5A en 5B, vergelijk Filter> 7, Filter <7, en zonder filter). Een mogelijk alternatief zou zijn om een ​​Regions of Interest (ROI) te trekken omvat het cytoplasmatische deel van de cel, maar met uitzondering van de ruffling rand en omtrek van de cel. Uiteindelijk zou deze cel niet in kwantitatieve resultaten omdat er verzadigde pixels van GFP aanwezig.

Een tweede representatief voorbeeld wordt weergegeven in Figuur 6A illustreert een tijdsverloop waarbij de autofocus niet gebruikt. De geïnternaliseerd GFP wordt getoond als percentage totaal cellulair GFP (Figuur 6B). De tijdstippen vóór de rode pijl 3 min misleidend zijn slechts een deel van de cel was de beeldvolume maar 3 minuten na Ang II bovendien het brandvlak gestabiliseerd. De totale GFP in de cel toont aan dat deze cel niet merkbaar was photobleach na verloop van tijd (figuur 6C ). Tussen 3 en ongeveer 12 min, procent GFP intensiteit in blaasjes toeneemt dan vlakt af (figuur 6B). Vervolgens lysosomen die door fluorescerende kleurstof gebruikt om ROI binnen een getransfecteerde cel die vervolgens werden gekwantificeerd voor de som van GFP intensiteit (figuur 6D) identificeren. Na drie minuten, is de intensiteit van AT 1a R-GFP in rood geïdentificeerde lysosomen niet constant in de tijd (Figuur 3D, n = 5, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde). Er is derhalve geen detecteerbare toename in afgifte van AT 1a R-GFP naar de lysosomen tot 24 minuten na Ang II toediening.

Figuur 1
Figuur 1: Verzadigde Pixels geïdentificeerd in een Lookup Table (LUT). De rode pijl geeft aan verzadigd pixels verschijnen in blauw.t = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Overzicht van Afbeelding Kwantificering Software. Key items zijn aangegeven met nummers en binnen de methoden tekst besproken. 1) Het optreden punt, 2) Geselecteerde afbeelding 3) de vrije hand ROI tool, 4) tabblad Metingen, 5) Vind objecten, 6) Bevolking 1 voorwerpen te vinden dialoogvenster 7) Arrow activeren time lapse film, 8) Metingen punt, 9) een tweede Zoek objecten dialoogvenster dat een filter Bevolking commando. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Color correctiediagram. Beelden met ongecorrigeerde engecorrigeerde registratie pixel worden samen getoond met inzetstukken van verschillende colocalizing blaasjes met AT 1a R-GFP. De rode pixels verschoven 1 pixel naar links in het XY-vlak van het gecorrigeerde beeld. Inzetstukken tonen boxed gebieden op hogere vergroting. Schaal bar = 3,3 micrometer, voxel afmetingen = 0,138 x 0,138 x 1 micrometer 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Illustratie van Thresholding kunnen identificeren GFP en fluorescente kleurstof-bevattende blaasjes en GFP-geheel Cells. (A) Identificatie van hele cellen met behulp van AT 1a R-GFP (GFP, bovenste rij) en thresholded GFP voor de hele cel (ID Cell, onderste rij) getoond op 0 en 2,5 minuten na Ang II toevoeging. Witte dozen geven inset gebieden getoond in (B) en (C). (B) op 1a R-GFP vergeleken bij 0 en 2. 5 min na Ang II toevoeging in één kleurenbeelden (bovenste rij). Blaasjes geïdentificeerd door drempelwaarden worden getoond in de onderste rij (ID Ves, paars). (C) Twee-color afbeeldingen (AT 1a R-GFP / fluorescerende kleurstof) getoond op 0 en 2,5 min na Ang II toevoeging. Lysosomen geïdentificeerd door drempelwaarden worden getoond door rode contouren. Schaal bar = 7,0 micrometer, voxel afmetingen = 0,114 x 0,114 x 1,4 micrometer 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Illustratie van de effecten van ruches en geclusterde blaasjes op de meting van geïnternaliseerde GFP receptoren. (A) A T 1a R-GFP in Ang II behandelde cellen bij 0 (bovenste rij) en 2,5 min (onderste rij) worden in drie filtering experimenten waarbij in de eerste kolom een filter werd toegepast om alleen objecten groter dan 7 pm 3 selecteren, in de tweede kolom selecteren minder 7 pm 3 objecten, en in de derde kolom geen filter gebruikt. Thresholding niveau was constant in alle drie. Pijlen geven thresholded grote objecten, cirkels geven een gebied van cytoplasma met perinucleaire blaasjes op latere tijdstippen. Thresholded gebieden zijn oranje. (B) Kwantificering van GFP totale intensiteit in blaasjes wordt getoond thresholded gebieden met en zonder formaat filteren (kolom A) op twee tijdstippen (voor rij A). Voxel afmetingen waren 0,138 x 0,138 x 1 micrometer 3. Schaal bar = 5,6 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 6
Figuur 6: Tracking AT1 een R- GFP internalisatie en Potentiële lokalisatie in Lysosomen. (A) Vijf gekozen tijdstippen van AT 1a R-GFP met Lysotracker Red zijn blijkt uit de begeleidende film (Live cell imaging 1 movie) op 0, 3, 6, 9, en 12 min na Ang II. Het rooster vormt een schaalverdeling van 6,56 micrometer 3, voxel afmetingen waren 0,297 x 0,297 x 1,2 pm 3, en de z-stap = 1,2 um. (B) Een grafiek van het percentage totale GFP in blaasjes in de tijd illustreert de snelle internalisering van AT 1a R-GFP. (C) Een grafiek van de totale GFP in de cel in de tijd illustreert die relatief weinig fotobleken opgetreden tijdens 24 min beeldvorming. (D) Lysosomen werden geïdentificeerd door het identificeren Lysotracker Red-positieve vesicles. De totale GFP intensiteit binnen flfluorescerende kleurstof-positieve blaasje ROI werd gemeten op elk tijdstip (Genormaliseerd naar het eerste tijdstip met geen compensatie voor fotobleken die niet onafhankelijk werd gemeten). (C - D) Voorafgaand aan de pijl, de metingen zijn niet geldig, omdat de focus verlegd. N = 5, gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

film 1
Film 1: Live-cell imaging 1: (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) HEK cellen getransfecteerd met AT 1a R-GFP werd in beeld gebracht om de 1 min gedurende 24 min (25 frames) na de toevoeging van 100 nM Ang II. Movie werd verkregen met behulp van een laser scanning confocale microscoop met een Plan-Apochrombij 63X / 1.4 NA olie doelstelling, voxel afmetingen van 0,279 x 0,279 x 1,2 micrometer 3; en 5 schijfjes voor een totaal van 4,794 micrometer dik afgebeeld op 3,20 ps / pixel. De film bedraagt ​​2 frames / s. Unit = 6,56 urn.

Movie 2
Movie 2: Live-cell imaging 2: (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) HEK cellen getransfecteerd met AT 1a R-GFP werd in beeld gebracht om de 30 s voor 25 min (51 frames) na de toevoeging van 100 nM Ang II. Movie werd verkregen met behulp van een laser scanning confocale microscoop met een Plan-Apochromat 40X / 1.4 NA olie doelstelling. Voxel afmetingen waren 0,11 x 0,11 x 1,4 micrometer 3. 7 segmenten voor een totaal van 8,4 urn dikte werden afgebeeld op 3,72 s / frame. De film bedraagt ​​3 beelden / s. Schaal bar = 7 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voorlopige experimenten hier gepresenteerde illustreren dat over een vrij korte tijdsverloop van 24 min, geen merkbare verandering in de levering van AT 1a R-GFP aan de lysosomen plaatsgevonden. In het algemeen kan afgifte van geïnternaliseerd receptoren lysosomen al 15-20 min optreden. Dit experiment is consistent met de hypothese dat het merendeel van de geïnternaliseerde AT 1a R is gericht op grote perinucleaire endosomen. Bewijs dat althans een aantal op 1a R komt in lysosomen werd aangetoond door Li et al. Die cellen op 5 min en 30 min na behandeling Ang II vergeleken en vonden significante colokalisatie van LAMP1 AT 1a R 30 maar niet 5 min 6.

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de cel voorbereiding, beeldvorming en analyse stappen en bespreekt de vele valkuilen die inherent zijn in deze geavanceerde beeldvormende techniek. Deze werkwijze hangt af kritische stappen hieronder besproken.

Omdat de gezondheid van de cellen is cruciaal voor live cell imaging experiment is het belangrijk om het gebruik van cellen na passage 11 door veranderingen in groei en transfectie-efficiëntie bij hogere passages. Gezonde cellen gedurende het experiment te handhaven, dient de incubatietijd van transfectie mix met cellen niet meer bedraagt ​​dan 5 uur sinds liposoomoplossing is giftig voor cellen aangetoond door verhoogde membraan blebbing. Temperatuur, vochtigheid en CO 2 controle is belangrijk zowel voor als tijdens de beeldvorming. Afwijkingen in de temperatuur tijdens de beeldvorming kan relatief grote z-sectie drifts en verlies van focal plane stabiliteit veroorzaken. Dus buiten voorzichtigheid is geboden bij toevoeging van Ang II aan de cellen tijdens de beeldvorming zodat het brandvlak nauwkeurig gehandhaafd.

In beeld brengen

Een voordeel van de live-cell imaging via immunokleuring met behulp van vaste cellendat de in vivo condities dicht worden gecontroleerd en artefacten geassocieerd met gefixeerde cellen kan worden vermeden. Echter, live-cell imaging uitdagend te optimaliseren voor cellulaire processen die zeer snel zijn, like receptor internalisatie zijn. Instrument snelheid en moet worden voorkomen fotobleken beperken de keuze van gebeurtenissen die kunnen worden bestudeerd. Elke imaging experiment kunnen bepaalde keuzes worden gemaakt in een aantal parameters en compromissen in andere eisen; voorbeelden zijn keuzes in pixelgrootte, lijn accumulatie, zoomfactor en scansnelheid om een ​​goede kwaliteit van de gegevens voor analyse te krijgen en oversampling op hetzelfde moment te voorkomen. Cruciale beslissingen in deze factoren afhankelijk evenwicht tussen de noodzaak om een ​​adequate pixelgrootte afzonderlijke blaasjes onderscheiden en de noodzaak om voldoende tijdsresolutie van de gebeurtenissen die zich voordoen. Aldus bepaalde compromissen moeten worden gemaakt om informatie snel genoeg verwerven begint de cel GFP-gemerkte receptor internaliseren. In onzegeval, hoewel moderne confocale software de optimale pixelgrootte kunnen suggereren onze experimenten gebruikten een waarde lager dan de optimale pixelgrootte volgens de Nyquist vergelijking 14. Optimale keuzes van instellingen voor andere experimenten zullen ook afhangen van hoe helder de cellen sinds grotere pixelgrootte snellere accumulatie van fotonen waardoor een afweging met een langere voxel verblijftijd in staat zal stellen om meer fotonen te verzamelen.

Voor de analyse om succesvol te zijn, de live-cell imaging vereist ook kritisch accurate focal stabilisatie tijdens de time-lapse imaging. Focal verschuivingen evenals gebrek aan imago van de gehele cel kan diepgaande invloed op kwantificering van receptor internalisatie evenals totale cellulaire GFP intensiteit hebben. De oplossing voor dit probleem van focale verschuivingen gedurende vroegste tijdstippen van beeldvorming na toevoeging van Ang II is door confocale fabrikanten in de vorm van oplossingen waarbij autofocus dekglaasje interferometry met een IR-laser in combinatie met terugkoppeling naar automatische scherpstelling controle wordt gebruikt om de relatieve afstand van het doel te houden aan het dekglaasje oppervlak geïdentificeerd door de IR reflectie (bijv Definite Focus of Adaptive Focus Control). De resterende probleem van de microscopist is dan om de juiste z-range te identificeren, zodat ondanks de vormveranderingen in de beeldvorming volume van de gehele cel blijft. Temperatuur is een kritieke factor voor de focus / Z-positie tijdens de eerste tijdspunten na toevoeging van Ang II handhaven. De temperatuur van het doel en de live cell imaging kamer moet tijdens het experiment op 37 ° C.

Een ander cruciaal onderdeel van beeldvorming, is het verwerven van beelden kwantitatief. Als een hyd detector wordt gebruikt in de Photon Counting modus, moet de beeldvormende parameters worden ingesteld dat foton pileup niet optreedt. Voor PMT's en andere detectoren, moet de beelden niet verzadigd pixels (voxels) bevatten. In beide gevallen een speseerde opzoektabel (LUT) kan worden gebruikt om de aanwezigheid van verzadigde pixels en natuurlijk wanneer zij aanwezig zijn visualiseren, moet de microscopist laserintensiteit en / of winst verminderen.

Analyse

Hoewel de hier beschreven benadering wordt toegepast op de AT 1a R receptor en zijn colocalization met lysosomen, is van toepassing op experimenten waarin de relatieve hoeveelheid van de receptor in subcellulaire compartimenten gelabeld met verschillende fluorescente labels is betrokken. Als het doel is om of de receptor zich naar het organel te meten, vervolgens met behulp van een Pearson's coëfficiënt colokalisatie met een marker voor het organel problematisch. Elke pixel wanneer het organel is vermeld, een grote hoeveelheid van de markering, zodat een van de coëfficiënten altijd dichtbij 100% zal zijn. Zo zou colocalization metingen misleidend zijn. Aan de andere kant meet het percentage receptor op het organel versus totale receptor is veel informatiever en duidelijker te interpreteren. Een geval waarin eiwit colocalization het best kan worden omschreven met Pearson correlatiecoëfficiënt zou op 1a R receptor en LAMP1 wier wisselwerking is gedocumenteerd, zij het met een meer verfijnde benadering colocalization, namelijk FLIM / FRET 6.

Het gebruik van 3D beeldvorming is nauwkeuriger dan het gebruik van representatieve plakjes cellen met analyse 2D door cellulaire beweging die onvermijdelijk zijn in het tijdsverloop (Live Imaging film 2). Uit de levende cellen beelden getoond in figuren 3, 4B en 5A dat de receptor voornamelijk gelokaliseerd op het plasmamembraan, echter binnen een paar minuten na blootstelling aan Ang II te lokaliseert om lichtvlekken op het membraan en kleine blaasjes grenzend aan het membraan waarschijnlijk beklede putjes en vroege endosomen (figuren 4B 4C). Bij voortzetting voortschrijden van de tijd, de vesicles bewegen door de cel ophopen in grotere blaasjes naast de kern die zijn beschreven als multivesiculaire endosomen (MVEs, figuren 1, 5A) 3, 15. Een enkel sneetje door de cel na verloop van tijd zou de internalisatie proces verstoren en een verkeerde voorstelling van de ware gebeurtenissen in het bijzonder als het segment niet het celoppervlak op vroege tijdstippen, en de MVEs op latere tijdstippen heeft opgenomen.

In dit onderzoek zijn twee benaderingen voor het analyseren van de effecten van fotobleken GFP en fluorescente kleurstof op de kwantitatieve resultaten te minimaliseren. Als cellen photobleach (zij het in beperkte mate), is de relatieve helderheid van geïnternaliseerde blaasjes ten opzichte van de gehele cel intensiteit gehandhaafd, uitgaande fotobleken treedt gelijkmatig. Fluorescerende kleurstof-positieve blaasjes zijn ook gemakkelijk te herkennen door het selecteren van de standaard deviation van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit optie voor drempelvorming heldere geïnternaliseerd blaasjes. Dit onderscheidt hen van de achtergrond, zelfs als het hele niveau van de fluorescentie daalt. Aldus onze metingen waren niet gevoelig voor de effecten van bescheiden fotobleken. Het is echter mogelijk sterk fotobleken zoals 50% verlies van cel intensiteit na verloop van tijd een grotere invloed op de kwantitatieve resultaten. Als alternatief zou de effecten van fotobleken gemeten zelfstandig controleproeven afwezig Ang II bij AT 1a R-GFP of aangrenzende getransfecteerde cellen bij fluorescente kleurstoffen. De effecten van fotobleken kan dan worden meegewogen in tijdens de analyse.

extra Concerns

Recentelijk zijn cel biologen kritische beoordeling en wijziging van fluorescerende eiwitten uitgevoerd voor het bewaken van membraantransport in cellen artefacten die door het fluorescerende eiwit zelf, onafhankelijk van het eiwit voorkomen being tag. Diverse fluorescente eiwitten zijn gevoelig voor interacties met de lokale micro-omgeving leidt tot proteïne precipitatie of verknopen op basis van de pKa en de aanwezigheid van het aminozuur cysteïne, respectievelijk 16. Een andere uitkomst van deze interacties kunnen zijn verlies van fluorescentie 16. Al deze artefacten beïnvloeden kwantitatieve metingen van mensenhandel. Constantini et al. hebben monomere fluorescerende eiwitten voor beeldvorming die cysteïne om mogelijke artefacten 16 elimineren gebrek gegenereerd. Dus afhankelijk van het doel van de beeldvormende experimenten schakelen van EGFP (niet-monomeer) een monomeer, cysteine-vrije vorm zou voordelig voor studies van zure en / of verminderen vesiculaire micro-omgevingen zijn. Een ander voorbeeld is de verbeterde bruikbaarheid voor FRAP is of FRET experimenten waarbij multimerisatie en verknoping zou beïnvloeden diffusie eiwit en eiwit-eiwit interacties.

Een andere mogelijke artefact te overwegen wanneer beeldvorming lysosomen gebruik Lysotracker Red samen met GFP fusie-eiwitten is dat Lysotracker Red is aangetoond in staat photoconversion te zijn voor groen 17. De auteurs bevelen aan dat het gebruik van epifluorescentie verlichting worden geminimaliseerd, te bespreken gebeurtenissen van dit artefact, en verwijzen naar succesvolle voorbeelden van colocalization het gebruik van dit reagens. Bovendien kunnen andere markers van de lysosomen ook worden gebruikt colocalization resultaten verifiëren, bijvoorbeeld, hebben LAMP1 6.

In de toekomst kan de gevoeligheid en specificiteit van deze test voor receptor richtend naar lysosomen en andere subcellulaire compartimenten met remmers van vesikel transport en / of fusie worden behandeld door het remmen lysosoom aanzuren gebruikt bafilomycine afbraak maar niet accumulatie 7 blokkeren, 18 , met chloroquine fusie met lysosomen derhalve blokkeren co-lokalisatie van receptor met lysosomen 2, 5, 6, 7, 18, met positieve controles, zoals het doelwit gemerkte Ang II lysosomen 2 te blokkeren, en in vergelijking met andere goed -described receptor en ligand systemen zoals transferrine of epidermale groeifactor en hun verwante receptoren 3. Een interessante positieve controle, eenlbeit artefact, in onze experimenten was een resultaat waargenomen in aangrenzende, niet-getransfecteerde, AT 1a R-GFP-negatieve cellen. Deze cellen hebben blijkbaar tot GFP afgegeven uit getransfecteerde cellen en gericht aan lysosomen waar de colokalisatie met fluorescerende kleurstof nogal prominent (niet getoond). Dit colocalization was echter niet gevoelig voor Ang II zoals verwacht.

Concluderend, de werkwijzen voor transfectie, beeldvorming en beeldanalyse die hier een middel waarmee receptor internalisatie verschillende subcellulaire compartimenten kwantitatief te traceren in levende cellen in de tijd. Relatieve vergelijkingen tussen verschillende receptoren of selectief gemuteerde receptoren zijn mogelijk wat betreft kinetiek en subcellulaire lokalisatie specifieke compartimenten. Eventuele moeilijkheden en artefacten in verband met deze technologie worden besproken. Toch kan snel voor live-imaging in 3D in combinatie met beeldanalyse worden gebruikt om receptor opname en snel te metenovergangen door het cytoplasma definieerbare moleculair compartimenten. Dit zet de toon voor het meten van verschillen als gevolg van mutatie van de receptor of de toepassing van agonisten, antagonisten en remmers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Het onderzoek dat in dit manuscript werd ondersteund door subsidie ​​R01 HL121456-01A1 aan Kathryn Sandberg. Dit werk werd ondersteund in aanvulling op de beschikbaarheid van een Leica SP8 AOB in de Microscopie en Imaging Shared Resource (MISR) aan Georgetown University Medical Center, die deels wordt gefinancierd door P30-CA051008 van de National Institutes of Health van de Verenigde Staten van Amerika. Wij dankbaar erkennen Leica SP8 imaging bijstand van Peter Johnson, en het gebruik van de Zeiss LSM880 in het laboratorium van Thomas Coate, Departement Biologie aan de Georgetown University met imaging bijstand van Alma Arnold van Carl Zeiss Microscopy LLC. De inhoud van dit manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II (Ang II) Sigma-Aldrich A9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific 11960-044 Warm in 37 °C water bath before use 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F2442 Warm in 37 °C water bath before use
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Gibco -ThermoFisher Scientific 15140-122 Warm in 37 °C water bath before use
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco (life technologies) 25030-081 Warm in 37 °C water bath before use
Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells American Type Culture Collection (ATCC)  CRL-1573 Passage number 5 - 12
Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System Sigma-Aldrich 155409
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019 Store at 4 °C 
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco- ThermoFisher Scientific 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use
PBS 10x  Fisher BioReagents BP3994 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)  Gibco -ThermoFisher Scientific 31053-028 Warm in 37 °C water bath before use
LysoTracker Red DND-99 molecular probes -ThermoFisher Scientific L7528 Store aliquotes in dark at -20 °C . 
Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software PerkinElmer Visualization and Quantitation Modules For 3D image analysis of image stacks
Leica SP8 AOBS Leica Microsystems laser scanning confocal microscope For image collection
Zeiss LSM 880 Carl Zeiss laser scanning confocal microscope For image collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

Tags

Molecular Biology live-cell imaging laser scanning confocale microscopie angiotensine type 1 receptor transfectie endosomen intracellulaire blaasjes driedimensionale beeldanalyse lysosomen transmembrane receptoren verbeterde groen fluorescerend eiwit
Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kadam, P., McAllister, R., Urbach,… More

Kadam, P., McAllister, R., Urbach, J. S., Sandberg, K., Mueller, S. C. Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55177, doi:10.3791/55177 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter