Summary
Her presenterer vi en protokoll til bildet celler uttrykker grønt fluorescerende protein-merket angiotensin type 1A reseptorer under endocytose initiert av angiotensin II-behandling. Denne teknikken innbefatter merking lysosomer med et andre fluorescerende markør, og deretter anvendelse av programvare for å analysere de ko-lokalisering av reseptor og lysosomet i tre dimensjoner over tid.
Abstract
Levende celle avbildning blir brukt til å samtidig fange time-lapse bilder av angiotensin type 1A-reseptorer (AT 1a R) og intracellulære i transfekterte humane embryonale nyre-293 (HEK) celler etter stimulering med angiotensin II (Ang II). HEK celler er transient transfektert med plasmid DNA inneholder AT 1a R tagget med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Lysosomer er identifisert med en rød fluorescerende fargestoff. Levende-celle bildene er tatt på en laser scanning confocal mikroskop etter Ang II stimulering og analysert av programvare tredimensjonalt (3D, voxel) over tid. Levende-cell imaging gjør undersøkelser i reseptoren menneskehandel og unngår forundrer forbundet med fiksering, og i særdeleshet, tap eller gjenstands forskyvning av EGFP-merkede membranreseptorer. Således, som de enkelte celler blir sporet gjennom tid, den subcellulære lokalisering av reseptorene kan avbildes og måles. Bildene må være kjøpt sufficiently raskt å fange raske vesikkel bevegelse. Likevel, med høyere bildehastighet, er antall fotoner innsamlede redusert. Kompromisser må også gjøres ved valg av avbildningsparametre som voxel størrelse for å oppnå avbildning hastighet. Betydelige anvendelser av levende celle bildebehandling er å studere protein trafficking, migrasjon, spredning, cellesyklus, apoptose, autofagi og protein-protein interaksjon og dynamikk, for å nevne noen.
Introduction
Det overordnede målet er å få kvantitative bevis i tid og rom av reseptor colocalization med spesifikke subcellulære organeller etter behandling med en reseptor agonist. Dermed umiddelbare mål her er å fange opp time-lapse confocal bilder av lysosomer og et trans spenner reseptor i humane embryonale nyreceller (HEK) etter transfeksjon og deretter å montere og analysere bildedata i 3D for å kvantitativt måle levering av reseptoren til lysosomer. Gransker samtidig smugling av et trans reseptoren med lysosomer eller andre organeller under endocytose når den aktiveres av ligand kan bidra til å bestemme hvordan den transmembrane reseptor er regulert under fysiologiske og patofysiologiske forhold.
AT 1a R antas å bli degradert i lysosomer etter behandling med Ang II i modell celler systemer, primært HEK293 en selv om de fleste av receptors er primært lokalisert i multivesikulære gjenvinnings endosomer for senere gjenvinning for å plasmamembranen mens mesteparten av liganden, Ang II, er degradert i lysosomet 2, 3, 4, 5. Mer nylig, Li et al. demonstreres ved anvendelse Förster resonans energioverføring (FRET) og fluorescens levetid avbildningsmikroskopi (FLIM) teknikker som AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm skala) med LAMP1, en lysosomal membranprotein som tyder på at i det minste noen av reseptoren er rettet mot og degradert av lysosomer 6. Disse forfatterne bemerkes at det lysosomale inhibitoren klorokin blokkert AT 1a R-LAMP1 krets som er i overensstemmelse med tidligere rapporter som tyder på at en effekt av klorokin er å hindre sammensmelting av sene endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andre indirekte metoder for å bestemme AT 1a R localization i lysosomer har utnyttet bafilomycin, en lysosomal inhibitor å antyde AT 1a R tilstedeværelse i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Levende-cell imaging unngår potensielle effektene av fiksering på cellevolumet, og tap / dimming / omfordeling av GFP-kimære reseptor. Tidligere studier har stolt på fikserte celler for å bestemme colocalization eller samtidig forekomst av reseptoren med lysosomer eller ved hjelp av levende celler merket med reseptorbindende surrogater slik som β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Levende-cell imaging av andre GPCR ved hjelp av roterende disk confocal eller laserpunkt scanning confocal mikroskoper utstyrt med Gaasp eller hyd detektorer aktivert etterforskere å observere intern og smugling av reseptorer i enkeltceller fotografert i z-stabler på 30 s intervaller 9, 10. Men selv når levende celle z-stabler er raskt samlet inn, kan analysen kun skje etter valget av en enkelt plan i hver stabel, dvs. i 2D 10. Selv om dette kan være tilstrekkelig for å studere internalisert GPCR eller tyrosinkinase-reseptoren i spørsmålet, AT 1a Rs akkumuleres i vesikler som endrer størrelse og posisjon over tid, og dermed er iboende vanskeligere å tilstrekkelig prøve ved bruk av en representativ enkelt stykke ved hvert tidspunkt. Å grundig bestemme ruten for den merkede AT 1a R gjennom cellen og for å detektere hver undergruppe vesikler forskjellige i størrelse og posisjon, har vi utviklet en metode for 3D-avbilding og 3D-analyse for å spore disse endringene og å være brukes i forbindelse med merking av forskjellige intracellulære såsom lysosomer.
Etterforskerne kan bruke denne protokollen for live-cell imaging å direkte visualisere bevegelsen av AT 1a R inn i cellen og dens overføring til subcellulære avdelinger følgende Ang II stimulering. Subcellulære avdelinger er merket med fluorescerende proteinkimærer eller andre fluorescerende markører. Denne protokollen kan også brukes som en første tilnærming for å lokalisere reseptorer i subcellulære organeller med en oppløsning på minst 200 nm for å sammenligne muterte versus villtype-reseptorer eller for å oppdage endringer etterfølgende farmakologiske behandlinger. Teknikken er tilgjengelig, siden det kan utføres på hvilken som helst konfokalt mikroskop utstyrt for levende celle avbildning. Det er relativt enkelt med denne tilnærmingen står i kontrast til økt kompetanse og utstyr som trengs for å utføre FRET / FLIM / BRET teknikker som oppdager molekylære interaksjoner 6,"xref"> 11. Disse målingene definere protein-protein interaksjoner med høy oppløsning (~ 10 nm) og lokalisering innen subcellulære organeller er utledes. Disse mer avanserte teknikker brukes til å følge opp og videre definere molekylære interaksjoner av interesse, snarere enn passering av reseptorer gjennom subcellulære avdelinger, og de direkte viser protein-protein interaksjoner til bestemte tider og steder i cellen 11. FLIM, en FRET teknikk uavhengig av akseptor konsentrasjon, er oftest utført på faste prøver siden bildet oppkjøpet er tregere. I kontrast, gir forholdet FRET rask bildebehandling og høy oppløsning colocalization av samspill proteiner. Ulempen med forholdet FRET er at bilde benytter vidfelt epi-fluorescens å få bildebehandling fart og til å omfatte hele cellen, noe som resulterer i redusert oppløsning og kontrast for organ 12. Bioluminesens resonans energi overføring (BRET) er en annenavansert teknikk som har vært brukt til GPCR å måle oppkjøpet av molekylære nærhet over tid 11. I denne teknikken et protein fluoroforen er molekylært delt, og hver halvdel er knyttet til en av to proteiner i spørsmålet. Når de to proteiner av interesse bindes hverandre, de delene av det kimære tag re-montere for å erverve fluorescens og den økede fluorescens kvantifisert over tid.
Her presenterer vi en enkel teknikk for live-cell imaging kombinert med bilde kvantifisering å studere smugling av AT 1a R i cellen ved Ang II stimulering og potensiell endring i levering av internalisert AT 1a R til lysosomer følgende Ang II stimulering. Den endelige bruk av denne teknikken er å karakterisere forskjeller i membran handelen som sammenlignet villtype og muterte reseptorer. Disse forskjellene vil bidra til å identifisere mekanismen (e) som påvirker fysiologiske aktiviteter AT 1a R leading til regulering av blodtrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag en
1. Cell Seeding
- Forbered komplett Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM). Tilsett 50 ml føtalt bovint serum, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml L-glutamin til 450 ml DMEM for å lage 500 ml komplett DMEM supplert med føtalt bovint serum (10%), penicillin / streptomycin (1%) og L-glutamin (1%).
- Seed menneskelige embryonale nyre (HEK) celler, passasje nummer 6-11 på 50000 / brønn i en åtte vel kamret dekkglass system i fullstendig DMEM.
- Opprettholde kamret lysbildet ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO 2 i 24 timer.
dag to
2. Liposome Transfeksjon
- Fersk gjøre AT 1a R-GFP plasmid og liposomoppløsninger bruker sterile forhold med en biosikkerhetsnivå 2 skap.
- Fortynn 2 mL av plasmid DNA på 900 ng / mL stamløsning i 178 mL av reduserte serum medier for å oppnå en Konsentraterion av plasmid DNA på omtrent 10 ng / mL.
- Fortynn 4,5 mL av liposomer stamløsning i 175,5 mL av reduserte serum media for å skape en 1:40 fortynning av aksjen.
- Tilsett liposomoppløsningen til plasmidet løsning og bland ved anvendelse av en 1 ml pipette for å pipettere opp og ned 20 ganger for å blande transfeksjon løsning.
- Inkuber blandingen i 30 minutter ved romtemperatur (25-27 ° C).
- Mens denne blandingen inkubasjon, fjerne media langsomt med en 1 ml pipette og sakte legge 400 mL av 1x fosfatbufret saltvann (PBS) som er forvarmet til 37 ° C.
- Fjern forsiktig PBS og erstatte med 200 ul / brønn redusert serum media forvarmet til 37 ° C.
MERK: Vær forsiktig på alle trinn når vaske cellene for å unngå avløsning av celler fra dekkglass på grunn av ren spenning indusert ved pipettering. - Opprettholde cellene ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 i 30 minutter.
- Først nårInkubasjonstiden er over, tilsett 80 ul transfeksjonsbuffer blanding til hver brønn og inkuberes cellene i 4,0-4,5 time men ikke mer enn 5 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
- Etter transfeksjon Inkubasjonstiden er fullført, langsomt fjerne mediet fra kamrene ved hjelp av en 1 ml pipette og forsiktig erstatt med 300 ul / brønn komplett DMEM og inkuberes cellene i 24 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 .
dag tre
3. Serum Sult
- Fjern materialet forsiktig ved anvendelse av en 1 ml pipette og langsomt erstatt med 300 ul serumfritt DMEM uten fenolrødt.
- Opprettholde kammeret ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 i 10-12 timer.
dag fire
4. Live-Cell Imaging
- Flekk intracellulære kamre (lysosomer i dette tilfellet).
- AboUT 30 minutter før avbildning lysosomer i celler tilsettes 22,5 mL av en 1 pM fluorescerende fargestoff stamoppløsning (0,5 mL av 1 mM fluorescerende fargestoff fortynnes med 499,5 ul serumfritt DMEM uten fenolrødt) til hver brønn for en endelig fargekonsentrasjons av 75 nM.
- Inkuber i 25-30 min ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 og deretter forsiktig fjerne fargestoff og tilsett langsomt 300 ul friskt serumfritt DMEM uten fenolrødt.
- Forbered mikroskop for bildebehandling.
- Juster scenen ned for å unngå skade på objektivet ved oppstart av en automatisert mikroskop.
- Slå på mikroskopet strømmen, skanner makt, laser makt og deretter laser utslipp, og til slutt metallhalogen for visuell observasjon (se konfokalmikroskop produsentens instruksjoner).
- Åpne bildeprogram og i programvaren slå på argon (488 nm) laser og strøm opp til 30-50%. Merk kraften avhengeralder av laser. Innenfor eksperimenter er det avgjørende å opprettholde konstant innstillinger.
- Slå på rød-utslipp laser (f.eks 568 nm eller 594 nm).
- Sett bildeformatet til 12-bits dybde.
- Sett pinhole for argon laser linje 488 nm og for 568 nm eller 594 nm laser til en Airy disk enhet. Hvis GFP er veldig svak, kan du bruke en innstilling av 2 Airy disk enheter, men matche kanalene på riktig måte.
- Ved bruk av dichroic filter sett, velger du de aktuelle utslippsbølgelengder for GFP og fluorescerende fargestoff. Eller sett emisjonsbølgelengden (Em) ved 499-580 nm for GFP og Em 599-680 nm for den rød-emitting fluorescerende fargestoff.
- Kontroller at blø gjennom og crossover ikke forekomme. Slå av hver laser i tur og sjekke både utslippskanaler for hver. Når argonlaser er slått av, skal den grønne utslippet være null. Når den grønne emitterende laser er avslått, bør det røde emisjons kanalen være null.
MERK: Den sikreste metoden er å bilde hver i separate spor (sequential). - Inkluder en lysfelt kanal hvis ønskelig. Unngå differensial kontrast imaging (DIC), fordi det kan forskyve colocalization målinger.
- For levende avbildning, velg linje sekvensiell fremfor ramme sekvensiell.
- Velg celler for avbildning.
- Bruk en 1,4 numerisk apertur (NA) objektiv, for eksempel en 63X / 1.4 NA olje objektiv til bildet celler (eller 40X / 1.4 NA). Sentrer objektiv og tilsett en dråpe høy viskositet, lav autofluorescence nedsenking olje på målet.
- Overfør kammeret med transfekterte celler fra inkubatoren til scenen av mikroskopet. Vær nøye med å holde lysbildene flat og sikre at kammeret er godt plassert og behersket fra bevegelse.
- Flytt objektiv opp til dråpe olje bare berører bunnen av glide; den riktige fokusplanet er i nærheten av denne stilling. I automatiske mikroskoper, lagre denne posisjonen samt senket posisjon til å bruke for remainder på bilde eksperiment for å legge til rette for endring prøver.
- Velg dim celler. Celler som overuttrykker AT 1a R-GFP vil omdirigere reseptoren i cellen og forstyrre normal funksjon.
- Bekrefte at omrisset av cellen, definert av plasmamembranen, er synlig og fortrinnsvis ikke overlapper med andre celler.
- Fokus og sentrere celle i synsfeltet.
- Bytt til confocal modus.
- Velg en rask bildemodus. Med en hånd på fokuskontroll og den andre på scenen XY kontroll, fokus og sentrere cellen av interesse visualisert på skjermen.
- Bekreft at cellen av interesse er godt spredt og bunnen eller ventral side sidestilt tett med dekkglass ved å fokusere opp og ned gjennom cellen.
- Sett z-trinns parametre til bilde en celle i 3D.
- Velg På-knappen for Z-stack topp og bunn dialog (eller tilsvarende) og fokus til bunnen av cell trykk deretter "begynne". Deretter fokus til toppen av cellen og trykk "end". Kontroller at hele cellen inngår i z-stabelen.
- Sett størrelse Z-steg til 1,0 mikrometer.
- Sett bildeinnstillinger.
- Velg Zoom 2, avhengig av objektivet, slik at det endelige pikselstørrelse er omtrent 0,279 mikrometer x 0,279 mikrometer til 0,14 mikrometer x 0,14 mikrometer i XY dimensjon.
- For HEK celler i dette eksperimentet, sett skannehastighet på ca 1 ms per voxel og velg 2 midling eller 2 ansamlinger av linje, avhengig av lysstyrken i cellene.
- Juster laser intensitet og få for bildebehandling GFP og fluorescerende fargestoff. Generelt vil counterstains være mye lysere og derfor Photomultiplier detektor (PMT) og ikke Galliumarsenid phosphide (Gaasp) eller Hybrid detektorer (HYD) bør benyttes for andre fargekanal mens gispe og hyd detektorer er nødvendig for GFP kanalen. Hvis hyd eller Gaasp oppdageors brukes for fluorescerende fargestoff, utøve forsiktighet og starte med laseren på et ekstremt lavt strømforbruk.
- Angi varighet for skanning og hyppighet av skanning, for eksempel hver 30-60 s over 25 minutter eller lenger for å se målretting av AT 1a R-GFP til lysosomer.
- Sett autofokus for å opprettholde fokusplanet stabilitet over tid.
- Begynn bildebehandling eksperiment.
- Forberede seg på forhånd 100x Ang II lager på 5 mikrogram / mL (4,7793 mM) og tilsett 2,1 mL av denne til 998 mL medium (10 mm).
- Begynn ligand stimulering ved tilsetning av 3 ul av en 100 x stamløsning av ligand (Ang II) til brønnen inneholdende 300 mL umiddelbart forut for avbildning (sluttkonsentrasjon 100 nM).
- Klikk start og bilde i 3D til ønsket tid og frekvens.
- Før endt arbeid på mikroskopet, samler en z-stack for senere bruk i bakgrunnen subtraksjon under analysen. I fotontellemodus, er dette ikkenødvendig siden bakgrunnen er i det vesentlige 0. belysning slått på, og alle andre avbildningsforhold det samme, men med noen prøve ta et prøvebilde. Se Bakgrunn subtraksjon (under) under analyse.
Day Five
5. Bildeanalyse
- Eksportere bilder til TIFF-format.
- Høyreklikk på bildefilen navn for å se menyer og velg Export eller klikk på Fil | eksport | import.
- Eksport til tiff for senere analyser og sørg for å eksportere RAW, 12-bit data [ikke "Red Blå '(RGB) konvertering brukes til bilder publisering kvalitet]. Ikke eksporterer til jpeg-format.
- Legg merke til X, Y, Z voxel dimensjoner og z-trinnstørrelsen for senere bruk ved bildeanalyse. For eksempel bruker en 40X / 1.4. NA objektiv disse verdiene kan være 0,138 mikrometer x 0,138 mikrometer med en mikrometer z-trinnstørrelse (se data i representative resultater avsnitt).
- <strong> Opprett bildestakk for analyse.
- Åpne bilde Kvantitering programvare (figur 2)
- Bruk "Handling | Opprett Ny | Bilder fra Selected Sequence" for å generere en enkelt fil bilde fra importerte enkeltsekvenser (Figur 2, pil 1 #).
- Skriv inn antall kanaler, antall z-seksjoner, og antall tidspunkter.
- Avhengig av strukturen i * TIFF-filer, velger du, for eksempel, kanaler, z-planet, og tidspunkter som rekkefølgen på bilde flyene. Kontrollere at det endelige bildestakk representerer riktig fargekanalene, z-stack, og tidspunkter på originalbildet.
- Velg bildenavnet (figur 2, fremhevet filnavnet til venstre, pil # 2). Høyreklikk på bildet og / eller bildefeltet, og fra alternativene nederst på listen velg "Properties". I um pixel for (X) (Y) og (Z) størrelse, skriv inn de riktige bildeegenskaper nevnt ovenfor.
- Trekk bakgrunn før bildeanalyse. Bakgrunnskorreksjon kan utføres på en hvilken som helst bildeanalyse programvare. Trekk bakgrunnen ved hjelp av ett av to alternativer.
- Alternativ 1: Velg "Handling | Opprett Ny | Bakgrunn subtraksjon" (figur 2, pil # 1). Bruk ervervet bakgrunnsbildet oppnådd ved slutten av bildebehandling økten beskrevet ovenfor som "Dark Reference" Image under "Tools | Trekk Bakgrunn".
- Alternativ 2: Undersøk de mørkeste områdene i bildene der det ikke er prøve, finne middelverdien eller maksimal lysstyrke på piksler i dette området, ignorerer eventuelle uvanlig lyse piksler som kan være falsk fluorophore, en tilfeldig lys piksel, eller et annet fenomen. Velg "Handlinger | Opprett Ny | Bakgrunn subtraksjon". Bruk denne pixel lysstyrke (laget negativ) som utlignet.
- Se etter fargeregistrering og korriger om nødvendig.
- Generere en registrerings korreksjon ved å velge "Handlinger | Opprett Ny | Registrering korreksjon" (figur 2, pil # 1) og bruke dialogboksen for å gjøre justeringer. Ved ferdigstillelse en ny mappe elementet vil vises tittelen "Registrering korreksjon".
- Påfør påmelding til en eller flere av bildene av interesse ved å klikke på bildenavnet (figur 2, fremhevet filnavnet til venstre, pil # 2) og deretter velge "Verktøy | Riktig registrering" (Tool-knappen ved siden Handlinger).
- Velg et bilde (figur 2, fremhevet filnavnet til venstre, pil # 2) og tegne en region av interesse (ROI) rundt en enkelt celle med freestyle regionen verktøyet (figur 2, pil # 3). Bruk Extended Focus-modus (2D, rullegardinmenyen øverst til venstre) for å observere cellen som beskjæringsverktøyet fungerer bare i 2D visualisering.
- Høyreklikk på bildet og velg "Beskjær til markering" og et nytt bilde av varen blir generert.
- Velg beskjærte cellen ved å klikke på navnet og velg deretter "Measurement" fanen ovenfor (figur 2, pil # 4).
- For å definere og måle internalisert vesikler for GFP, dra "Finn Objects" under "Finne" (figur 2, pil 5 #) i sekvensen (Figur 2, pil 6 #).
- Sett "Finn Objects" Channel til GFP kanalen.
- Åpne innstillinger (hjulet ikonet i dialogboksen, pil # 6) og satt4; Threshold bruker: "til SD og" nedre grense "til 6. Set" Minimum objektstørrelse "til 0 mikrometer tre.
MERK: SD nedre grense vil avhenge av individuelle eksperimenter. Visuell bekreftelse på at de riktige objektene er terskel er laget ved å undersøke forskjellige tidspunkter (figur 2, pil # 7). Den "Måling | Tilbakemelding Alternativer" i dialogboksen brukes til å velge veien som er valgt terskel objekter er visualisert (figur 2, pil # 8). - Klikk "Mål" i "Finn objekter" i dialogboksen (figur 2 pilen # 6) og velge kanaler og type målinger. Vanligvis velger du "Alle kanaler" og "intensitet og volum målinger".
- Å definere terskel og filtre for identifisering av hele cellen og å måle total GFP intensitet, gjenta trinnene ovenfor (5.5.4 - 5.5.8) med følgende parametre: SD 0 og "Minimum Object size" til 2 μ; m 3 i den andre "Finn Objects" dialogboksen for å identifisere celler ved hjelp GFP (figur 2, pil 9 #)
- Dra "Filter Population" under "filtrering" til sekvensen boksen under befolkning to (den andre "Finn Objects" -boksen, figur 2, pil # 9). Velg "Volume (mikrometer 3> 100).
- Visuelt sikre at bare en gjenstand er identifisert. Hele cellen bør terskel og alle andre objekter ble filtrert bort. "Filter" parameter (e) kan trenge justering hvis cellen er liten, for eksempel.
- Når målingen er standardisert, lagre protokollen ved å høyreklikke på bildet og velg "Lagre Protocol" for å gjenbruke ( "Restore Protocol»). Protokollen kan også eksporteres til å gi en rekord i samme underkatalog som bildet.
- Fortsett til "Make Measurement" ved å velge "Målinger | Gjør Måling Item" (figur 2
- Skriv inn riktig målenavnet (kopiere lime fra bildet er praktisk) og analyse kode eller dato (et nyttig tillegg for journalføring) og velg "Alle tidspunkter". Et nytt regneark element vil bli opprettet under bildet. Hold filnavn konsis.
- Klikk på regnearket filnavnet og velg "Analyser" -fanen. Finn ut om mettet voxel er til stede ved først å velge "Begrens Analysis til:« velge Populasjon 2 (cellen).
- Høyreklikk feltet under "kategorien Analyser", og i dialogboksen under "Analyser disse dataene:" velg "Max ([GFP fargekanal])"; under "oppsummert av:" velg "Mean ([GFP fargekanal]", og under "Organiser dataene etter:" og "Row" velg "endepunktet" og click "OK".
MERK: Hvis data inneholder mettede piksler (f.eks 65 536 for 16-bit eller 4096 for 12-bit), vil analysen være unøyaktig (det vil undervurdere vesikkel innhold). Se bort fra at cellen for analyse. Hvis ikke mettet, går du videre til neste trinn. - Deretter under "Rå" -fanen og deretter under "Analyse" -fanen og høyreklikke dataene finne "Begrens Analysis til:" velg Befolkning en for vesikler eller Populasjon 2 for hele cellen.
- Under "analysere disse dataene:" velg "Sum" (GFP fargekanal); under "oppsummert av:" velg "Sum"; og, under "Organiser dataene etter:" og "Row" velg "endepunktet" eller "Relativ Time" og deretter "OK". Analyse valg kan lagres og gjenbrukes.
- Velg og kopier / lim inn direkte fra bilde kvantifisering programvare til et tomt regneark eller eksportere regnearkdata ved å høyreklikke på daten og velge Lagre som CSV-fil. Hele cellen intensitet målingen vil bli tatt med målinger av hver vesikkel i befolkningen så sørg for å identifisere og skille den fra blemmer.
MERK: Etter å plotte data, økningen i total GFP fluorescens finnes vesikler raskt stiger. Fotobleking, dersom den forekommer, blir detektert som tap av total celle GFP intensitet over tid.
- I Finn Objekter (befolkning en), sett "Finn Objects" Kanal til den røde kanalen og i hjulet ikonet innenfor denne dialogboksen pilens # 6 (figur 2) set "Threshold bruker:" til SD og "nedre grense" for å 6. sett "Minimum objektstørrelse" til 0,017 mikrometer tre.
MERK: SD nedre grense vil avhenge av individuelle eksperimenter. Visuell bekreftelse på at de riktige objektene blir terskel bør gjøres ved eksamenining ulike tidspunkter. Den "Måling | Tilbakemelding Alternativer" i dialogboksen brukes til å velge veien som er valgt terskel objekter er visualisert (figur 2, pil # 8). - Klikk "Mål" i "Finn" objekter "dialogen (figur 2 pilen # 6) og velge kanaler og typer målinger. Typisk" Alle kanaler "og" intensitet og volum målinger "er valgt.
- For Populasjon 2, bruk innstillinger identisk med den som brukes til å identifisere hele transfekterte celle uttrykker AT 1a R-GFP (5.5.9).
- Hvis flere celler (inkludert ikke-transfekterte celler med fluorescerende fargestoff-positive vesikler) er til stede, beskjæring cellen i den første fasen av analysen er kritisk. Alternativt bør bruk av "compartmentalize" brukes til å begrense identifikasjon av lysosomer i den transfekterte celle som uttrykker AT 1a R-GFP. Lysosomer må kun bli identifisert innen GFP cellen ogikke fra nærliggende, utransfekterte celler.
- Analyser og eksportere data som ovenfor.
NB: Et eksempel på terskel-celler og vesiklene er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette representative sett av eksperimenter, ble HEK-celler transfektert med angiotensin typen 1a-reseptor (AT 1a R-GFP) konstruere (E1,2,3-AT 1a R) klonet inn i pEGFP-N2 plasmid 13. Time-lapse bilder av HEK ble kjøpt opp og spilte som en film (Se Live-Cell Imaging 1 og Live Cell Imaging 2 filmer). Filmer og stillbilder viser at etter ligand stimulering, AT 1a R-EGFPs er lokalisert hovedsakelig i plasmamembranen, men med tillegg av Ang II disse reseptorene bli internalisert i løpet av 2,5 min for dannelse av lyse vesikler og på senere tidspunkt klynge i større vesikler i en perinukleær sone (figur 4B, 5 og 6A, live Cell Imaging 2).
Kvantifisering av total celle GFP intensitet og total vesikkel-GFP intensitet for cellen i figur 5 pROVIDE en illustrasjon av komplikasjoner iboende når Ang II induserer rusket og celle form endres umiddelbart etter stimulering (figur 5A, pilen 0 min post-Ang II, øvre rad, viser oransje terskel objekter). På senere tidspunkt, lokalisering av GFP-holdige vesikler i et perinukleær klynge også griper inn (figur 5A, rød pil på 29,5 min). Selv om alle objekter som skal inkluderes i den totale celle GFP intensitetsmåling bør folder utelukkes fra vesikkel målinger som de representerer plasmamembranen AT 1a R-GFP. I motsetning til dette, bør de grupperte perinukleære vesiklene ikke være utelukket fra vesikkel-måling (den sistnevnte er sett i et område av cellen innelukket i røde sirkler i figur 5A, pil ved 29,5 min post-Ang II, lavere rad). Forsøk på å oppnå dette ved størrelsen filtrering (mer eller mindre enn 7 mikrometer 3) var ikke nyttig som det ikke kunne diskriminere volanger og gruppert vesicles (5A og 5B, sammenligne Filter> 7, Filter <7, og ingen filter). Et mulig alternativ vil være å trekke et regioner av interesse (ROI) som omfatter det cytoplasmatiske del av cellen, men unntatt det rusket kant og omkretsen av cellen. Til syvende og sist vil denne cellen ikke bli inkludert i kvantitative resultatene fordi det var mettet piksler av GFP stede.
Et annet representativt eksempel er vist i Figur 6A illustrerer et tidsforløp hvor autofokus ikke ble brukt. Den internalisert GFP er vist som prosent totalt cellulært GFP (figur 6B). De tidspunkter før den røde pilen 3 min er misvisende da bare en del av cellen var i bilde volum, men tre minutter etter Ang II tillegg fokalplanet restabilized. Den totale GFP i cellen demonstrerer at denne celle ikke photobleach bart over tid (figur 6C ). Mellom 3 og ca 12 min, prosent GFP intensitet i vesikler øker deretter flater ut (Figur 6b). Deretter ble lysosomer identifisert ved fluorescerende fargestoff som brukes til å identifisere ROIs i en transfektert celle som deretter ble kvantifisert for summen av GFP intensitet (figur 6D). Etter tre minutter, betyr intensiteten av AT 1a R-GFP i rødt-identifiserte lysosomer ikke varierer over tid (figur 3D, n = 5, gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien). Således er det ingen påviselig økning i levering av AT 1a R-GFPs til lysosomene i opp til 24 minutter etter Ang II-administrering.
Figur 1: Mettet piksler Identifiserte i en oppslagstabell (LUT). Den røde pilen indikerer mettede piksler vist i blått.t = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt over bilde Kvantifisering Software. Viktige elementer er angitt med tall, og diskutert i teksten metoder. 1) Handling element, 2) Valgt bilde 3) frihånds ROI verktøy, 4) Målinger kategorien, 5) Finn objekter, 6) Befolkning en finne gjenstander dialogboksen 7) Arrow aktivering time lapse film, 8) Målinger element, 9) en annen finne gjenstander dialogboks som inneholder et filter Befolkning kommando. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Farge Registrering korreksjon. Bilder med ukorrigert ogkorrigert pixel registrering vises sammen med innfellinger av flere colocalizing vesikler som inneholder AT 1a R-GFP. De røde piksler er forskjøvet en piksel til venstre i XY-planet til ukorrigert bildet. Innfellinger vise eske områder ved høyere forstørrelse. Scale bar = 3,3 mikrometer, voxel dimensjoner = 0,138 x 0,138 x 1 mikrometer tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Illustrasjon av terskelverdier for å identifisere GFP- og Fluorescent Dye-holdige vesikler og GFP-hele celler. (A) Identifisering av hele celler ved hjelp av AT 1a R-GFP (GFP, øverste rad) og terskel GFP for hele cellen (ID Cell, nederste rad) er vist på 0 og 2,5 minutter etter Ang II tillegg. Hvite boksene indikerer insET områder vist i (B) og (C). (B) AT 1a R-GFPs sammenlignes på 0 og 2. 5 min etter Ang II tillegg i enkle fargebilder (øverste rad). Blemmer identifisert av terskelverdier er vist i den nederste raden (ID Ves, lilla). (C) To fargebilder (AT 1a R-GFP / fluorescerende fargestoff) er vist på 0 og 2,5 min post Ang II tillegg. Lysosomer identifisert av terskelverdier er vist med røde skisserer. Scale bar = 7,0 mikrometer, voxel dimensjoner = 0,114 x 0,114 x 1,4 mikrometer tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Illustrasjon av effekten av Ruffles og Gruppert Blemmer på Måling av internalisert GFP reseptorer. (A) En T 1a R-GFP i Ang II-behandlede celler ved 0 (øverste rad) og 2,5 min (nederste rad) er vist i tre filtrerings forsøk hvor i den første kolonne en filter ble anvendt for å velge bare objekter som er større enn 7 mikrometer 3, i andre kolonne for å velge objekter mindre 7 um 3, og i den tredje kolonne noe filter ble anvendt. Thresholding nivå var konstant i alle tre. Pilene viser store terskel objekter, sirkler indikerer et område av cytoplasma som inneholder perinukleære vesikler ved senere tidspunkter. Terskel-områder er oransje. (B) Kvantifisering av GFP total intensitet i vesiklene er vist for terskelområder med eller uten størrelse filtrering (ved kolonne i A) ved to tidspunkter (for rad i A). Voxel dimensjonene var 0,138 x 0,138 x 1 mikrometer tre. Scale bar = 5,6 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Sporing AT1 en R- GFP Intern og potensial Lokalisering i lysosomer. (A) Fem utvalgte tidspunkter av AT 1a R-GFP med LysoTracker Red er vist fra den medfølgende filmen (Live cell imaging en film) på 0, 3, 6, 9 og 12 min post Ang II. Gitteret representerer en enhet skala fra 6,56 um 3, voxel dimensjonene var 0,297 x 0,297 x 1,2 um 3, og z-trinn = 1,2 um. (B) Et diagram av prosent total GFP i vesikler over tid viser den raske internalisering av AT 1a R-GFP. (C) Et plott av den totale GFP i cellen over tid viser at forholdsvis lite fotobleking fant sted i løpet av 24 min avbildning. (D) lysosomene ble identifisert ved å identifisere LysoTracker Red-positive vesikler. Den totale GFP intensitet innenfor fluorescent fargestoff-positive vesikkel ROIs ble målt ved hvert tidspunkt (Normalisert til det første tidspunktet med ingen kompensasjon for fotobleking som ikke ble målt uavhengig av hverandre). (C - D) Før pilen, målingene er ikke gyldig fordi fokuset skiftet. N = 5 Midlere ± standardavvik av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: Live-Cell Imaging 1: (Høyreklikk for å laste ned) HEK celle transfektert med AT 1a R-GFP ble fotografert hver 1 min til 24 min (25 bilder) etter tilsetning av 100 nM Ang II. Filmen ble kjøpt ved hjelp av en laser scanning confocal mikroskop med en Plan-Apochrompå 63X / 1.4 NA olje objektiv, voxel dimensjoner på 0,279 x 0,279 x 1,2 mikrometer 3; og 5 stykker for totalt 4,794 mikrometer tykkelse avbildet på 3,20 ms / pixel. Filmen hastighet er 2 rammer / s. Unit = 6.56 pm.
Movie 2: Live-Cell Imaging 2: (Høyreklikk for å laste ned) HEK celle transfektert med AT 1a R-GFP ble fotografert hver 30 s for 25 min (51 frames) etter tilsetning av 100 nM Ang II. Filmen ble kjøpt ved hjelp av en laser scanning confocal mikroskop med en Plan-Apochromat 40X / 1.4 NA olje objektiv. Voxel dimensjoner var 0,11 x 0,11 x 1,4 mikrometer tre. 7 stykker for totalt 8,4 mikrometer tykkelse ble fotografert på 3,72 s / ramme. Filmen prisen er 3 bilder / s. Scale bar = 7 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Foreløpige eksperimenter er presentert her viser at i løpet av en ganske kort tid løpet av 24 min, ingen vesentlig endring i levering av AT 1a R-GFP til lysosomene inntraff. Generelt, kan levering av internalisert reseptorer til lysosomer forekomme allerede i 15-20 min. Dette eksperimentet er konsistent med hypotesen om at mesteparten av internalisert AT 1a R er rettet mot store, perinukleære endosomer. Bevis for at i det minste noen AT 1a R kommer i lysosomer ble demonstrert av Li et al. , Som sammenlignet celler på 5 min og 30 min etter Ang II behandling og fant betydelige colocalization av LAMP1 med AT 1a R på 30, men ikke 5 min 6.
Denne artikkelen gir en detaljert beskrivelse av cellepreparat, bildebehandling og analyse trinn og diskuterer mange iboende fallgruvene i denne avanserte avbildningsteknikk. Denne metoden avhenger av kritiske trinnene diskutert her.
Siden god helse av celler som er kritiske for en hvilken som helst levende celle avbildning eksperiment, er det viktig å unngå anvendelse av celler utenfor passasjen 11 på grunn av endringer i vekstrate og transfeksjonseffektivitet ved høyere passasjer. For å opprettholde sunne celler gjennom hele forsøket, bør inkubasjonstiden for transfeksjon blanding med celler ikke overstige 5 timer etter liposom løsning er toksisk for celler som gjenspeiles av øket membran blebbing. Temperatur, fuktighet og CO2 kontroll er viktig så vel før som under avbildning. Driver i temperatur under bildebehandling kan føre til relativt store z-delen dyner og tap av fokusplan stabilitet. Derfor ekstra forsiktighet anbefales under tilsetning av Ang II til cellene under bildebehandling for å sikre at fokusplanet blir nøyaktig opprettholdes.
Imaging
En fordel med levende celle bildebehandling i løpet farging ved hjelp av faste celler erat in vivo-betingelsene kan reguleres nøye og gjenstander er forbundet med fikserte celler kan unngås. Imidlertid kan levende celle bildebehandling være utfordrende å optimalisere for cellulære prosesser som er svært rask, like receptor intern. Instrument hastighet og behovet for å unngå fotobleking begrense valg av hendelser som kan studeres. Hver bildebehandling eksperiment kan kreve visse valg som skal gjøres i noen parametere og kompromisser i andre; eksempler er valg i pikselstørrelse, linje akkumulering, zoomfaktor, og skannehastighet for å få god kvalitet data for analyse og unngå oversampling samtidig. Kritiske avgjørelser i disse faktorene være avhengig av å balansere behovet for å oppnå tilstrekkelig bildepunktstørrelse for å skille de enkelte vesikler og behovet for å oppnå tilstrekkelig tidsoppløsning av de hendelser som inntreffer. Dermed noen avveininger må gjøres for å tilegne seg informasjon raskt nok som cellen begynner å internal GFP-merket reseptoren. I vårtilfelle, selv om moderne konfokal programvare kan foreslå den optimale pikselstørrelse, våre eksperimenter brukte en verdi som er mindre enn den optimale pikselstørrelsen i henhold til Nyquist ligning 14. Optimale valg av innstillinger for andre eksperimenter vil også avhenge av hvor lyst cellene er da større pikselstørrelse vil muliggjøre raskere oppbygging av fotoner slik at en trade off med lengre voxel holdetid å samle flere fotoner.
For analyse skal være vellykket, live-cell imaging også kritisk krever nøyaktig fokus stabilisering under time-lapse imaging. Focal skift samt svikt i bildet hele cellen kan ha stor innvirkning på kvantifisering av reseptoren intern samt total cellular GFP intensitet. Løsningen på dette problemet med fokusskift i løpet tidligste tidspunkt av bilde følgende tillegg av Ang II har blitt gitt av confocal produsenter i form av autofokus-løsninger der dekk interferomEtry med en IR laser kombinert med tilbakemeldinger til automatisert fokus kontroll brukes for å opprettholde relative avstanden fra målet til dekkflaten identifisert ved IR refleksjon (f.eks Definite Focus eller Adaptive Focus Control). Den gjenværende problem for Mikroskopist er da å identifisere den korrekte z-serien, slik at til tross for formforandringer, forblir hele cellen i bilde volum. Temperaturen er en annen viktig faktor for å opprettholde fokus / Z-posisjon under innledende tidspunkter etter tilsetning av Ang II. Temperaturen av mål, så vel som den levende celle avbildningskammeret bør opprettholdes ved 37 ° C gjennom hele forsøket.
En annen viktig del av bildediagnostikk, kjøper bilder kvantitativt. Hvis en hyd detektor brukes i Photon Counting Mode, må bildeparametre settes slik at foton pileup ikke oppstår. For PMTs og andre detektorer, må bildene ikke inneholde mettede piksler (voxel). I begge tilfeller vil en specialized oppslagstabell (LUT) kan brukes til å visualisere nærværet av mettede piksler, og selvfølgelig hvis de er tilstede, bør det Mikroskopist redusere laserintensitet og / eller gevinst.
Analyse
Selv om den metode som er beskrevet her er brukt til AT 1a R-reseptoren og dens colocalization med lysosomer, er det aktuelt å eksperimenter hvor den relative mengde av reseptoren i subcellulære kamrene er merket med ulike fluorescerende koder er på spørsmålet. Hvis målet er å måle hvorvidt reseptoren flyttes til organeller, deretter bruke en Pearsons colocalization koeffisient med en markør for organeller er problematisk. Hvert bildeelement der organeller er identifisert vil ha en høy mengde av markør slik at en av koeffisientene vil alltid være nær 100%. Dermed kunne colocalization målinger være misvisende. På den annen side, å måle prosent av reseptor på organeller versus totale mengden av receptor er mye mer informativt og klarere å tolke. Et tilfelle hvor proteinet colocalization kan best beskrives ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient ville være AT 1a-R-reseptoren og LAMP1 hvis interaksjonen har blitt dokumentert, om enn ved en mer sofistikert colocalization tilnærming, nemlig FLIM / FRET 6.
Bruken av 3D avbildning er mer nøyaktig enn å bruke representative skiver av celler med analyse i 2D grunn av cellulære bevegelser som er uunngåelig i den tiden kurset (Live Imaging 2 filmen). Det er klart fra de levende celle bildene som vises i figur 3, 4B og 5A at reseptoren er primært lokalisert på plasmamembranen, men i løpet av få minutter av eksponering til Ang II den deg til lyse flekker på membranen og små blemmer ved siden av membranen, sannsynligvis belagt groper og tidlige endosomer (figur 4B 4C). Med fortsatt progresjon av tid, vesiklene beveger seg gjennom celle akkumuleres i større vesikler ved siden av kjernen som er blitt beskrevet som multivesikulære endosomer (MVEs figurene 1, 5A) 3, 15. En enkelt stykke gjennom cellen over tid ville forvrenge internprosessen og uriktige opplysninger om de virkelige hendelsene spesielt hvis stykket ikke inkluderte celleoverflaten på tidlige tider, og de MVEs på senere tidspunkt.
I denne studien, kan to fremgangsmåter for bildeanalyse minimalisere virkningene av fotobleking av GFP, samt fluorescerende farvestoff på den kvantitative resultat. Som celler photobleach (riktignok i begrenset utstrekning), er den relative lysstyrke av internaliserte vesikler i forhold til hele cellen intensitet opprettholdes, forutsatt at fotobleking skjer jevnt. Fluorescerende fargestoff-positive vesikler er også lett identifiseres ved å velge standard deviation av den midlere fluorescensintensitet alternativ for terskel lyse internaliserte vesikler. Dette skiller dem fra bakgrunnen selv som hele nivået av fluorescens avtar. Således våre målinger var ikke er følsomme for virkningene av beskjeden fotobleking. Imidlertid kan sterk fotobleking, for eksempel 50% tap av celle intensitet over tid ha en større innvirkning på kvantitative resultater. Alternativt kan effekten av fotobleking kan måles uavhengig i kontrollforsøk fraværende Ang II i tilfelle av AT 1a R-GFP eller i tilgrensende ikke-transfekterte celler i tilfelle av fluorescerende fargestoffer. Effekten av fotobleking kan da bli tatt i løpet av analysen.
Andre Bekymringer
Nylig har cellebiologer utført kritisk vurdering og modifikasjon av fluorescerende proteiner for overvåking av membranen handel med celler for å unngå gjenstander som genereres av det fluorescerende protein i seg selv, uavhengig av proteinet being merket. Forskjellige fluorescerende proteiner er utsatt for vekselvirkninger med den lokale mikromiljøet som fører til proteinutfelling eller tverrbinding basert på deres pKa-tallet og nærvær av aminosyren cystein, henholdsvis 16. Et annet resultat av disse interaksjonene kan inkludere tap av fluorescens 16. Alle disse gjenstandene påvirke kvantitative målinger av menneskehandel. Constantini et al. har generert monomere fluorescerende proteiner for bildebehandling som mangler cystein for å eliminere eventuelle gjenstander 16. Således, avhengig av målet for bildebehandling eksperimenter, bytte fra EGFP (non-monomer) til et monomert, ville cystein-fri form være fordelaktig for studier av sure og / eller reduserende vesikulær microenvironments. Et annet eksempel kan være deres forbedret verktøy for FRAP eller FRET eksperimenter hvor multimerization og kryssbinding ville påvirke protein diffusjon og protein-protein interaksjoner.
En annen potensiell gjenstand for å vurdere når avbildning lysosomer bruker LysoTracker Red sammen med GFP fusjonsproteiner er at LysoTracker Red har vist seg å være i stand til photoconversion til grønn 17. Forfatterne anbefale at bruk av epifluorescens belysning bli minimalisert, diskuterer forekomster av denne gjenstand, og refererer til vellykkede tilfeller av colocalization å bruke dette reagens. I tillegg kan andre markører for lysosomene også bli anvendt for å verifisere colocalization resultater, for eksempel merket LAMP1 6.
I fremtiden kan følsomheten og spesifisiteten av denne analysen undersøkes for reseptoren målretting til lysosomer og andre subcellulære rom ved hjelp av inhibitorer av vesikkel transport og / eller sammensmelting, ved å inhibere lysosomet surgjøring ved hjelp av bafilomycin å blokkere nedbrytning, men ikke akkumuleringen 7, 18 , ved hjelp av klorokin å blokkere fusjon med lysosomer følgelig blokkerer ko-lokalisering av reseptoren med lysosomer 2, 5, 6, 7, 18, ved hjelp av positive kontroller som målretting av merket Ang II til lysosomer 2, og ved sammenligning med andre vel -described reseptor og ligand-systemer slik som transferrin eller epidermal vekstfaktor og deres beslektede reseptorer 3. En interessant positiv kontroll, enlbeit gjenstands, i våre eksperimenter var et resultat observert i tilstøtende, utransfekterte, AT 1a R-GFP negative celler. Disse cellene tilsynelatende tok opp GFP løslatt fra transfekterte celler og målrettet det til lysosomer hvor colocalization med fluorescerende fargestoff var ganske fremtredende (ikke vist). Dette colocalization, var imidlertid ikke følsom for Ang II som forventet.
Som konklusjon, er fremgangsmåter for transfeksjon, avbildning, og bildeanalyse som presenteres her tilveiebringe et middel som reseptoren internalisering til forskjellige subcellulære kamrene kvantitativt kan spores i levende celler over tid. Relative sammenlikning mellom ulike reseptorer eller selektivt muterte reseptorer er mulig med hensyn til kinetikk og subcellulær lokalisering til bestemte avdelinger. Mulige problemer og gjenstander knyttet til denne teknologien blir diskutert. Likevel kan raskt live bildebehandling i 3D kombinert med bildeanalyse kan brukes til å måle reseptor opptak og raskoverganger gjennom cytoplasma til molekylært definer avdelinger. Dette setter scenen for måling av forskjeller som følge av mutasjon av reseptor eller anvendelsen av agonister, antagonister og inhibitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskningsarbeidet presenteres i dette manuskriptet ble støttet av tilskuddet R01 HL121456-01A1 til Kathryn Sandberg. Dette arbeidet ble støttet i tillegg av tilgjengeligheten av en Leica SP8 AOBS i Mikroskopi og Imaging delt ressurs (MISR) ved Georgetown University Medical Center som er delvis finansiert av P30-CA051008 fra National Institutes of Health i USA. Vi erkjenner takknemlig Leica SP8 bildebehandling hjelp av Peter Johnson, og bruk av Zeiss LSM880 i laboratoriet av Thomas Coate, Institutt for biologi ved Georgetown University med bildebehandling bistand fra Alma Arnold fra Carl Zeiss Mikros LLC. Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
