Summary
Detaljer presenteres om hvordan QTL-kartlegging med et helt genom-sekvensbasert genetisk kart kan brukes til å identifisere et stoffresistensgen i Toxoplasma gondii og hvordan dette kan verifiseres med CRISPR / Cas9-systemet som effektivt redigerer et genomisk mål, i dette tilfellet Stoffresistensgen.
Abstract
Vitenskapelig kunnskap er iboende knyttet til tilgjengelige teknologier og metoder. Denne artikkelen vil presentere to metoder som tillates for identifisering og verifikasjon av et stoffresistensgen i Apicomplexan parasitt Toxoplasma gondii , metoden for kvantitativ karakteristikk (QTL) kartlegging ved hjelp av et generisk genetisk kart med hele genome (WGS) og metoden Av Clustered regelmessig interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9-basert gen redigering. Tilnærming av QTL kartlegging tillater en å teste om det er en sammenheng mellom en genomisk region (er) og en fenotype. To datasett kreves for å kjøre en QTL-skanning, et genetisk kart basert på avkom av et rekombinant kryss og en kvantifiserbar fenotype vurdert i hvert av avkom fra det krysset. Disse datasettene formateres deretter for å være kompatible med R / qtl-programvare som genererer en QTL-skanning for å identifisere signifikante loci korrelert med fenotypen. Selv om dette i stor grad kan begrense søket wIndkomst av mulige kandidater, QTLs span regioner som inneholder en rekke gener som kausale genet må identifiseres for. Å ha WGS av avkom var kritisk for å identifisere årsaksmessig resistensmutasjon på gennivå. Når identifisert, kan kandidatmutasjonen verifiseres ved genetisk manipulering av narkotikafølsomme parasitter. Den mest enkle og effektive metoden for å genetisk modifisere T. gondii er CRISPR / Cas9-systemet. Dette systemet består av bare 2 komponenter som begge er kodet på et enkelt plasmid, en enkelt guide RNA (gRNA) som inneholder en 20 bp sekvens komplementær til det genomiske mål og Cas9 endonukleasen som genererer en dobbeltstreng DNA-pause (DSB) ved målet, Reparasjon som tillater innføring eller sletting av sekvenser rundt pauseområdet. Denne artikkelen gir detaljerte protokoller for å bruke CRISPR / Cas9-baserte genomredigeringsverktøy for å verifisere genet som er ansvarlig for sinfunginresistens og å konstruere transgene parasitter.
Introduction
Vertsområde bestemmer omfanget av parasittenes prevalens. Noen parasitter har svært spesifikke vertsbehov som begrenser området de er funnet fra, andre er generalister. En slik generalist er Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Denne parasitten finnes over hele verden, da den kan smitte alle pattedyr og mange fugler. Mennesker er også utsatt, og det er anslått at omtrent 1/3 av den globale befolkningen har blitt smittet. Heldigvis styrer en robust immunrespons normalt parasittenes vekst, men i situasjoner der immunsystemet er kompromittert, kan parasitten vokse ukontrollert og forårsake sykdommer, ofte encefalisk. Også denne parasitten kan forårsake medfødte sykdommer hvis tidligere uinfiserte kvinner blir smittet under graviditet, da de mangler immunforsvar for raskt å begrense parasittets spredning. I tillegg er det en byrde av okulær toksoplasmose som kan resultere i synstap 1 . For disse reasoNs T. gondii har blitt et fokus for studiet, og på grunn av de mange molekylære metodene som er utviklet for studien, en modell for Apicomplexan-parasitter. To metoder som vil bli diskutert her, er kvantitativ karakteristikk (QTL) kartlegging og klynget regelmessig interspaced kort palindromisk gjentakelse (CRISPR) / Cas9 genredigering. QTL kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering er henholdsvis frem og tilbake genetiske tilnærminger som har blitt brukt i tidligere studier for å identifisere og / eller karakterisere T. gondii virulensgener. Her kombineres disse metodene for å identifisere og bekrefte funksjonen til et SNFr-gen, TgME49_290860, og dets orthologer (merket som SNR1 ) 2 .
Selv om T. gondii kan infisere et bredt spekter av mellomliggende verter, må det passere gjennom og infisere de tarmepitelceller av et felid for å fullføre livssyklusen. Katter er de endelige vertene av parasitten der sExual stadier blir produsert og genetisk rekombination via meiose forekommer. For å utføre en QTL-studie må man skape et genetisk kryss, og i tilfelle toxoplasma betyr dette at man passerer to forskjellige parasittstammer som avviger i en fenotypisk egenskap, foreldreflettene, gjennom en katt for å produsere rekombinant avkom 3 . Før de blir matet til katter, blir foreldreskjemaene resistente mot separate stoffer for å muliggjøre mer effektiv identifikasjon av rekombinanter ved dobbeltmedisinvalg av avkom 4 . Tre legemidler har blitt brukt i T. gondii for dette formålet; Fluorodeoxyribose (FUDR) for hvilken uracilfosforibosyltransferase ( UPRT ) er resistensgenet 5 , adenosin arabinosid (ARA) for hvilket Adenosin Kinase ( AK ) er resistensgenet 6 og sinusfungin (SNF) for hvilket resistensgenet var ukjent 7 . Flere genetiske kryss har værtOpprettet for T. gondii , men bare de 24 avkomene fra ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset ble genotypet ved bruk av fullgenomsekvensering (WGS) 8 . Dette åpnet muligheten for kartlegging og identifisering av SNF-resistensgenet ved bruk av dette krysset idet VAND-forelder ble gjort resistent ved kjemisk mutagenese av den medikamentfølsomme VAND (VAND-SNF s ) -stammen, og VAND-referansegenomet ble sekventert ved bruk av VAND- SNF s- stamme, slik at det muliggjør identifisering av alle polymorfismer mellom avkommet WGS og VAND-SNFs referansegenomet, inkludert den arvelige foreldre VAND-SNF r- mutasjonen som gjorde noe av avkommet resistent mot avkom.
For å identifisere den kausale enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP) i SNF r- avkomen, kan flere beregningsbaserte åpen kilde-ressurser brukes til å analysere dataene. Å opprette det genetiske kartet for ME49-FUDR r X VAND-SNF r krysse REDHORSE programvarepakke 9 ble utviklet som bruker WGS-tilpasninger av foreldrene og avkom til nøyaktig å detektere de genetiske posisjonene i genetiske kryssinger. Denne kartleggingsinformasjonen kan deretter kombineres med fenotypiske data (SNF r i avkommet) for å formatere et datasett som er kompatibelt med "qtl" -pakken 10 i R statistisk programmeringsprogramvare der en QTL-skanning kan kjøres for å avsløre signifikant lokalisering korrelert med fenotype. For å identifisere kausal SNP som befinner seg innenfor QTL-locuset, kan WGS-lesene av avkommet tilpasses individuelt til det senfungin-følsomme VAND-genomet ved hjelp av Bowtie 2-justeringsprogrammet 11 hvorfra SNP-er kan bli kalt ved hjelp av VarScan mpileup2snp-variantoppringerprogrammet 12 . Ved hjelp av disse SNPene kan QTL-locuset skannes for polymorfier som er tilstede i SNF r, men ikkeI SNFs avkom. Med det kausal SNP som er identifisert i det kodende område av et gen, kan genetisk modifisering av kandidat SNF r- genet utføres i en SNFs-stamme for å verifisere stoffresistensfunksjonen.
CRISPR / Cas9 genometredigeringssystemet ble nylig etablert i Toxoplasma 13 , som ga viktige verktøy for utforskning av den komplekse biologien til denne parasitten, spesielt for genetiske studier i ikke-laboratorie-tilpassede stammer. På grunn av den høyaktive ikke-homologe sluttforbindelsesaktiviteten (NHEJ) i WT Toxoplasma- celler, er målrettet genommodifikasjon vanskelig å oppnå, da eksogent innført DNA er tilfeldig integrert i genomet ved ekstremt høy frekvens 14 . For å øke suksessraten for lokusspesifikk modifikasjon, har forskjellige tilnærminger blitt anvendt for å øke effektiviteten av homolog rekombination og / eller redusere thE NHEJ aktivitet 15 , 16 . En av disse tilnærmingene er CRISPR / Cas9-systemet. Sammenlignet med andre metoder, er CRISPR / Cas9-systemet effektivt for å introdusere områdespesifikke modifikasjoner og er lett å designe 13 , 17 , 18 . I tillegg kan den brukes i hvilken som helst Toxoplasma- stamme uten ekstra modifikasjon til parasitten 13 , 19 .
CRISPR / Cas9-systemet stammer fra det adaptive immunsystemet til Streptococcus pyogenes , som bruker det til å forsvare invasjonen av mobile genetiske elementer som fagene 20 , 21 , 22 . Dette systemet benytter det RNA-guidede DNA-endonuklease-enzymet Cas9 for å introdusere dobbeltstrenget DNA-pause (DSB) inn i målet, som deretter repaEnten av den feilkrevne NHEJ for å inaktivere målgener gjennom korte indelmutasjoner, eller ved homologi-rettet rekombinasjon for å endre mållokalet nøyaktig som utformet 23 , 24 . Målspecifikiteten bestemmes av et lite RNA-molekyl som heter single guide RNA (gRNA), som inneholder en individuelt utformet 20 nt-sekvens som har 100% homologi til mål-DNA 22 . GRNA-molekylet inneholder også signaturer anerkjent av Cas9 som styrer nukleasen til målområdet, som inkluderer en spesiell Protospacer tilstøtende motiv (PAM, sekvens er 'NGG') 25 , 26 . Derfor arbeider gRNA-molekylet og PAM-sekvensen sammen for å bestemme Cas9-spaltningsstedet i genomet. Man kan enkelt endre gRNA-sekvensen for å målrette forskjellige steder for spaltning.
Når CRISPR / Cas9-systemet ble utviklet først i ToxopLasma, ble et enkelt plasmid som uttrykker Cas9-nukleasen og gRNA-molekylet brukt til å introdusere DSB på målingsstedet 13 , 17 . Det har blitt vist at CRISPR / Cas9-systemet drastisk øker effektiviteten av stedsspesifikke genommodifikasjon, ikke bare ved homolog rekombination, men også ikke-homolog integrering av eksogent DNA 13 . Det gjør dette i wildtype-stammer som inneholder NHEJ-aktivitet. Derfor kan dette systemet brukes i vesentlig hvilken som helst Toxoplasma- stamme for effektiv genomredigering. I et typisk eksperiment blir det mål-spesifikke CRISPR-plasmidet og DNA-fragmentet som brukes til å modifisere målet, transfektert inn i parasitter. Hvis DNA-fragmentet som brukes til å modifisere målet inneholder homologe sekvenser til mållokalet, kan homolog rekombination brukes til å reparere DSB introdusert av CRISPR / Cas9 for å tillate presis modifikasjon av målet. På den annen side, hvis intDNA-fragmentet ikke inneholder homolog sekvens, det kan fortsatt integreres i CRISPR / Cas9-målrettingsstedet. Sistnevnte brukes ofte til å forstyrre gener ved å sette inn selekterbare markører eller komplementere mutanter på steder som tillater negativt valg 13 . Her fungerer SNR1- locus som et eksempel for å vise hvordan CRISPR / Cas9 kan brukes til genforstyrrelser og generering av transgene parasitter.
Protocol
1. Vurder SNF r i avkom av ME49-FUDR r x VAND-SNF r Kors
MERK: T. gondii er en obligatorisk intracellulær parasitt og tachyzoittrinnet vokser lett i vevskultur.
- For å dyrke T. gondii parasitten, opprettholde dem i sammenflytende Human Foreskin Fibroblast (HFF) monolagkultur sådd til T25 flasker med Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) media tilsatt 10% føtalt bovint serum (D10 media) ved 37 ° C C og 5% CO 2 .
MERK: Se protokoll 1.1 Merknad i tilleggsfil 1 . - For å teste individuelle avkomskloner for sinusfunginresistens, vokser hver klone til høy parasittdensitet i en T25 HFF-kultivirkning i 2-3 d, til flertallet av parasittene begynner å lyse vertscellene.
- Skrap monolaget med en celleskraper og send parasittløsningen gjennom en 10 ml sprøyte / 22 G stump nål 2-3x tO lyser vertscellene som frigjør parasitter. Løsningen kan trekkes tilbake opp i sprøyten for flere nålepassasjer.
- Filtrer parasittoppløsningen i et nytt konisk rør gjennom en membran med porestørrelsen på 3 μm for å fjerne HFF-celler og cellulære rusk.
- Telle parasittene på et hemocytometer og bestem antall parasitter per ml.
- Bruk en pipettor til å passere 2,5 x 10 5 parasitter til en ny T25 HFF-kulturflaske som inneholder D10-medier med 0,3 μM arbeidskonsentrasjon av sinusfungin-legemidlet.
- Utvik parasittenene ved 37 ° C og 5% CO 2 i 7-10 d.
- Score avkom for vekstfenotypen i sinfunnet stoff. Observer monolaget under et invertert fasekontrastmikroskop og scorer 0 for ingen vekst (sinusfølsom), poengsum 1 for vekst og lysis av monolag (senfunginresistent).
MERK: Se protokoll 1.8 Merknad i tilleggsfil 1 .
2. RUn a QTL Scan av SNF r Phenotype i R / qtl
MERK: Se protokoll 2 Merknad i tilleggsfil 1 .
- Installer programvaresprogprogramvaren R på en lokal datamaskin. Se 27 .
- Kjør R og installer pakken 'qtl'. Enten gjør dette fra alternativet R GUI-grensesnitt 'Pakker-> Installer pakke (r)', eller kjør følgende kommando fra R-kommandolinjen (det første ">" -symbolet i hvert eksempel angir begynnelsen på en kommando, for ikke å være kopiert):
> install.packages ( "QTL")
MERK: Når R og pakken "qtl" er installert, er det to måter å kjøre R / qtl, fra R-kommandolinjen eller ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI) program som heter J / qtl 28 : se 29 for å laste ned J / QTL. Denne protokollen vil gi R / qtl-kommandolinjens syntaks med sporadisk referanse til ekvivalentfunksjonen i J / qtl. - Legg inn pakken 'qtl':
> Bibliotek (qtl)
MERK: Se protokoll 2.3 Merknad i tilleggsfil 1 for datasettformat og nedlastinger. - Last inn datasettfilen i R / qtl.
- For "csv" format (Se: Datafil 1):
> SNFR <- read.cross (format = "csv", fil = "$ PATH / Rqtl-SNFR.csv", genotyper = c ("0", "1"), na.strings = c ("-") , ConvertXdata = FALSE) - Eller for "gary" format (Se: Data File 2):
> SNFR <- read.cross (format = "gary", dir = "$ PATH", chridfile = "chrid.txt", mnamesfile = "mname.txt", mapfile = "markerpos.txt", genfile = "genotype. Txt ", phefile =" phenos.txt ", pnamesfile =" phenonames.txt ", convertXdata = FALSE)
Hvor $ PATH er katalogbanen til filen / filene som inneholder qtl datasettet. For eksempel: / Brukere / HotDiggityDog / QTLfiles
MERK: Filene kan også lastesRedigeres til J / qtl med de forrige kommandoene ved å bruke 'Sett kommentar eller kommando', eller last inn dataene med GUI 'File-> Load Cross Data'.
- For "csv" format (Se: Datafil 1):
- Beregn sannsynligheter for kartet:
> SNFR <- calc.genoprob (SNFR, trinn = 2.0, off.end = 0.0, error.prob = 1.0E-4, map.function = "haldane", stepwidth = "fixed") - Kjør en enkelt skanning ved hjelp av en binær fordeling av sinfunginresistensfenotypen på tvers av alle kromosomer:
> SNFR.scan <- scanone (kryss = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa", "VIIb "," VIII "," IX "," X "," XI "," XII "), feno.col = c (1), modell =" binær ", metode =" em ")
MERK: Hvis du kjører VIR-fenotypen, bruk 'modell =' normal '' distribusjonsalternativ. - Kjør 1000 permutasjoner for å beregne signifikansgrenser og deretter attrIbute permutasjonene til SNFR.scan variabelen:
> SNFR.scan.permutations <- scanone (kryss = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa" "VII", "VIII", "IX", "X", "XI", "XII"), feno.col = c (1), modell = "binær", metode = "em", n.perm = 1000, perm.Xsp = FALSE, verbose = FALSE)
> Attr (SNFR.scan, "pheno.col") <- c (1)
MERK: Trinn 2,5 til 2,7 kan kjøres i J / qtl med 'Analyse-> Hovedskanning-> Kjør ett QTL Genome Scan' -alternativ. - Plott skanningsresultatene:
> Plot (SNFR.scan, gap = 0, bandcol = "grå")
MERK: Plottet produsert i J / qtl er interaktivt.- Plott scanresultater for bare kromosom IX, kromosomet med høyeste topp:
> Plot (SNFR.scan, chr = c ("IX"), gap = 0, bandcol = "grå", show.marker.names = TRUE) - Vis alle markørposisjonene og LOD-scoreene fra enkeltskanningen:
> SNFR.scan - Vis terskelresultatene for permutasjonstesten:
> sammendrag (SNFR.scan.permutations) - Vis bare de markørene som er større enn alfa = .05 grenseverdi (tatt fra forrige utgang):
> SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> 2,68,] - Vis markørene med høyest LOD score på hvert kromosom:
> Sammendrag (SNFR.scan) - Vis de markørene som har den maksimale LOD-verdien (tatt fra forrige utgang):
> SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6,57,]
MERK: Se protokoll 2.13 Merknad i tilleggsfil 1 .
3. Identifiser årsakssammenhengen SNF r Mutasjon ved hjelp av WGS Leser fra avkom
MERK: Se protokoll 3 Merknad i tilleggsfil 1 .
- Juster WGS leser av enkelte avkom til den senfungin sensitive VAND(VAND-SNF s ) foreldregenomet.
MERK: Last ned VAND referansegenomet (SNF s ) fra NCBI Assembly AEYJ00000000.2 og WGS leser (.sra filer) for 24 avkom fra NCBI SRA PRJNA258152. Last ned også følgende programmer: Bowtie2 11 , NCBI SRA Toolkit, SAMtools 30 , VarScan 12 og MUMMER 31 .- Opprett en Bowtie 2-kompatibel indeks fra VAND-referansegruppen FASTA-fil ved hjelp av bowtie2-build-programmet, her navngi indeksen "VAND":
> Bowtie2-build GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna VAND - Konverter SRA-formaterte WGS-filer til FASTQ-filer ved hjelp av fastq-dump med alternativet --split-filer for parrede leser (SRR1555372.sra-filen for avkom P1_14VB vil bli brukt som eksempel):
> Fastq-dump --split-filer SRR1555372.sra
MERK: Kjør dette og alle følgende kommandoer i protokoll 3.1 for alle 24avkom. - Juster WGS leser til referansegenomet ved bruk av bowtie2 med utdata til en SAM (.sam) -fil og alternativet -end-til-ende:
> Bowtie2 -x VAND -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam - end-til-ende - Konverter .sam-filen til en BAM (.bam) -fil:
> Samtools view -bS SRR155372.sam> SRR155372.bam - Sorter .amb-filen:
> Samtools sort SRR155372.bam SRR155372.sort - Index den sorterte .bam filen:
> Samtools Index SRR155372.sort.bam
- Opprett en Bowtie 2-kompatibel indeks fra VAND-referansegruppen FASTA-fil ved hjelp av bowtie2-build-programmet, her navngi indeksen "VAND":
- Ring SNPs for avkom med VarScan
MERK: Se protokoll 3.2 Merknad i tilleggsfil 1 .- Konverter alle indekserte BAM-filer (.sort.bam) til en pileup formatert fil ved hjelp av Samtools mpileup med VAND-genomet-referansefilen, alle avkom .sort.bam-filer, og utdata til en fil med navnet AllProgeny-mpileup.txt:
> Samtools mpileup -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599.Sort.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200. Sort.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399. Sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt - Ring alle SNP-er ved hjelp av programmet VarScan mpileup2snp ved hjelp av filen AllProgeny-mpileup.txt, minimumslesedekning av 5, minste variantfrekvens på tvers av leser .8, en p-verdi på .01, og utdata til filnavne AllProgeny-SNPs. tekst:
> Java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt --min-dekning 5 --min-var-freq .8 --p-verdi .01> AllProgeny-SNPs.txt
MERK: AllProgeny-SNPs.txt-filen er en tabulatoravgrenset tekstfil som skal brukes i protokoll 3.4 for å finneKausal SNP.
- Konverter alle indekserte BAM-filer (.sort.bam) til en pileup formatert fil ved hjelp av Samtools mpileup med VAND-genomet-referansefilen, alle avkom .sort.bam-filer, og utdata til en fil med navnet AllProgeny-mpileup.txt:
- Finn VAND-genomkoordinater som samsvarer med koordinatene til ME49-basert QTL-lokus
MERK: Se protokoll 3.3 Merknad i tilleggsfil 1 .- Bruk MUMmer nucmer-programmet til å justere ME49-genomet (tilgjengelig for nedlasting fra ToxoDB.org 32 ) og VAND-referansegenomenfilen (utgang går til out.delta-filen):
> Nucmer ToxoDB-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna - Bruk MUMMER-show-koordineringsprogrammet til å oppnå koordinatene til de to genomejusteringer, utdata til en fil som heter ME49vsVAND-coords.txt:
> Visningskoordiner out.delta> ME49vsVAND-coords.txt
MERK: ME49vsVAND-coords.txt filen kan brukes til å finne VAND contigs og posisjoner som korresponderer med QTL locus; Markører MV359 til MV366 lokalisert på ME49 kromosom IX mellom 3,187,537 til 4,202,258 bp. Det er to VAND contigs som spenner over korrespondansenOnding QTL locus; KN044604.1: 657.441-1 bp og KN042501.1: 430.910-41.870 bp (begge contigs justeres bakover til ME49 kromosomet).
- Bruk MUMmer nucmer-programmet til å justere ME49-genomet (tilgjengelig for nedlasting fra ToxoDB.org 32 ) og VAND-referansegenomenfilen (utgang går til out.delta-filen):
- Vurder avkom SNPs som ligger innenfor QTL-locus for SNPs arvet bare i SNF r- avkom
MERK: Se protokoll 3.4 Merknad i tilleggsfil 1 .- Gjennomgå datafil 3 for å identifisere årsaksmutasjonen som ligger i QTL-lokalet. Skann dataene for et mønster der SNF r- avkomgen har en SNP og SNF s ikke (gjennomførbar fordi avkom SNPs ble oppnådd i forhold til VAND-SNFs referansegenomet). Dette bør bare resultere i en posisjon med dette mønsteret, posisjon 348130 på VAND contig KN042501.1.
- Se rad 6604 i datafil 3 ( figur 3 ).
MERK: Se protokoll 3.4.2 Merknad i tilleggsfil 1 .
4. Verifisering av identifiserte treff av CRISPR / Cas9-Mediert geninaktivering.
MERK: For å bekrefte kausal SNP identifisert ved QTL kartlegging og WGS SNP analyse, må de tilsvarende genetiske endringene gjøres i en WT SNF s bakgrunn og den resulterende fenotypen undersøkt. I tilfelle av sinfunginresistens resulterer den ansvarlige mutasjonen i inaktivering av SNR1- genet ved tidlig avslutning 2 . Derfor kan forstyrrelser av SNR1 brukes til bekreftelse. Her er det gitt en detaljert protokoll for bruk av CRISPR / Cas9-induserte indelmutasjoner for å forstyrre SNR1 , for å demonstrere sitt engasjement i sinfunginresistens ( Figur 4 ).
- SNR1- spesifikk CRISPR-plasmidkonstruksjon
MERK: Se protokoll 4.1 Merknad i tilleggsfil 1 for å få plasmider og kart.- Oppnå den genomiske sekvensen for målgenet ( SNR1 , TGME49_290860) fra ToxoDB 32 .
- Bruk elektroniske verktøy som E-CRISP 33 til å designe målrettede gRNAer. Ikke inkluder PAM-sekvensen (NGG) i gRNA.
MERK: Se protokoll 4.1.2 Merknad i tilleggsfil 1 . - Syntetiser primere for å konstruere det målsspesifikke CRISPR-plasmidet.
- I henhold til utformingen fra trinn 4.1.2, syntetiserer to primere for å endre UPRT- målretting gRNA i det opprinnelige CRISPR-plasmidet til den valgte gRNA-sekvensen ved hjelp av stedrettet mutagenese.
MERK: Sekvensene av disse to primrene er som følger: gRNA-Fw: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC (N20 er den målsspesifikke gRNA-sekvensen) og gRNA-Rv: AACTTGACATCCCCATTTAC 2 .
- I henhold til utformingen fra trinn 4.1.2, syntetiserer to primere for å endre UPRT- målretting gRNA i det opprinnelige CRISPR-plasmidet til den valgte gRNA-sekvensen ved hjelp av stedrettet mutagenese.
- Utfør de site-directed mutagenesis reaksjonene.
- Ved bruk av UPRT- målretting CRISPR-plasmidet (pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT) som mal og de to primere som er oppført ovenfor, utfører stedrettet mutagenesereaksjonerI henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Bruk følgende syklusbetingelser for PCR: 98 ° C i 1 min, etterfulgt av 25 sykluser på 98 ° C i 10 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 5 min, etterfulgt av en endelig forlengelse i 2 min Ved 72 ° C.
- Ved bruk av UPRT- målretting CRISPR-plasmidet (pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT) som mal og de to primere som er oppført ovenfor, utfører stedrettet mutagenesereaksjonerI henhold til produsentens instruksjoner.
- Transform mutageneseproduktene som inneholder de GOI-spesifikke CRISPR-plasmidene til E. coli kompetente celler ved kjemisk transformasjon i henhold til leverandørens protokoll (se Tabeller of Materials ). Voks transformantene på lysogenboks (LB) -plater som inneholder ampicillin (100 μg / mL) ved 37 ° C. Deretter velger du 2-4 kloner og vokser dem individuelt i 5 ml LB medium tilsatt 100 μg / ml ampicillin i 12-16 timer.
- Ekstraher plasmider fra kulturer ved bruk av et DNA-isolasjonskit og analyser dem ved DNA-gelelektroforese for å kontrollere størrelsen på plasmidene (forventet plasmidstørrelse er 9674 bp, bruk det opprinnelige CRISPR-plasmidet som c-regulering). Bruk M13-Rev-primeren (5'-CAGGAAACAGCTATGACC) for å sekvensere plasmidene for å bekrefte den målspesifikke gRNA-sekvensen.
- Når positive kloner er identifisert, lagre begge plasmid-DNA ved -20 ° C og tilsvarende bakteriekultur ved -80 ° C for fremtidig bruk.
MERK: CRISPR-plasmidet som skal brukes til transfeksjon, skal oppløses i avionisert vann og konsentrasjonen bestemmes ved spektrofotometri eller en alternativ metode.
- Når positive kloner er identifisert, lagre begge plasmid-DNA ved -20 ° C og tilsvarende bakteriekultur ved -80 ° C for fremtidig bruk.
- Ekstraher plasmider fra kulturer ved bruk av et DNA-isolasjonskit og analyser dem ved DNA-gelelektroforese for å kontrollere størrelsen på plasmidene (forventet plasmidstørrelse er 9674 bp, bruk det opprinnelige CRISPR-plasmidet som c-regulering). Bruk M13-Rev-primeren (5'-CAGGAAACAGCTATGACC) for å sekvensere plasmidene for å bekrefte den målspesifikke gRNA-sekvensen.
- Parasittransfeksjon.
MERK: Generelle metoder for dyrking av T. gondii i HFF-celler i D10-medium har blitt beskrevet tidligere 34 .- To til tre dager før transfeksjon, legg til nok parasitter til en T25-kolbe som inneholder et sammenflytende HFF-cellemonolag (0,5-1 x 106 for type 1-stammer, 1-2 x 10 6 for andre stammer) for å oppnå 70 - 80% HFF-celle Lysis innen 2-3 d.
- ExamiNe kulturen under et invertert fasekontrastmikroskop, når HFF-monolaget er 70-80% lysert av parasittene. Fjern forsiktig mediet med en pipette og vaske cellene av flaskeflaten med 5 ml cytomixbuffer (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K2HP04 / KH2P04 pH = 7,6, 25 mM HEPES, 2 MM EDTA, 5 mM MgCl2, pH = 7,6). Deretter overfører parasittoppløsningen til et 15 ml konisk rør.
MERK: Se protokoll 4.2.2 Merknad i tilleggsfil 1 . - Pass parasittløsningen gjennom en 10 ml sprøyte / 22 G stump nål 2-3x.
- Filtrer parasittoppløsningen i et nytt konisk rør gjennom en membran med porestørrelsen på 3 μm for å fjerne HFF-celler og cellulære rusk.
- Pell de filtrerte parasittene ved sentrifugering ved 400 xg i 10 minutter.
- Hell supernatanten og resuspender de pelleterte parasittene med 10 ml cytomixbuffer, ta en 10 μl alikvot til detØdelegge parasittkonsentrasjonen med et hemocytometer og pellet resten ved sentrifugering ved 400 x g i 10 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i cytomixbufferen for å oppnå en tetthet på 4 x 107 parasitter / ml.
- I en 4 mm gapskuvette blandes 250-300 μL parasittoppløsning (1-1,3 x 10 7 parasitter) med 7,5 μg CRISPR-plasmid, 6 μL ATP (100 mM) og 6 μL glutation (GSH) (250 mM).
- Elektroporere parasittene 35 . Inkluder en separat elektroporasjon som en negativ kontroll der et CRISPR-plasmid er målrettet andre steder, slik som UPRT- målrettet CRIPSR-plasmid.
MERK: Elektroporasjonsinnstillingene avhenger av enheten. For elektroporatoren som er oppført i Materialene, bruk 4 mm gapkuvetter. Følgende protokoll anbefales: 1,700 V, 176 μs pulslengde, 2 pulser med 100 ms intervall.
- Bestem frekvensen for sin opprinnelige resistaEtter CRISPR-målretting.
- Frø HFF-celler til dekselplater plassert i 24-brønnplater 3-4 d før elektroporasjon, slik at de er sammenflytende til tiden for å utføre transfeksjon i 4.2.
- Trypsiniser HFF-cellene fra en sammenflettet T25-kolbe og tilsett deretter 12 ml D10-medium og bland godt.
- Legg en deksel på hver brønn i en brønn med 24 brønner og alikvot 500 μL HFF-celleoppløsning til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 3 4 d for å la cellene vokse til sammenløp.
MERK: Celler fra en T25-kolbe er nok til å frø en 24-brønn plate. - Tilsett 50 μL elektroporert parasittoppløsning fra trinn 4.2.9 i en brønn med brønn med 24 brønner som inneholder en dekselplast med frø med sammenflytende HFF-celler. Overfør resten av elektroporert parasittoppløsning til en T25-kolbe sådd med sammenflytende HFF-celler.
- Vurder effektiviteten av transfeksjon.
- Voks cellene i 24-brønnsplaten i 24 timerOg deretter fikse cellene (vertsceller og parasitter) med 500 ul 4% formaldehyd for å kontrollere uttrykket av Cas9-GFP ved immunfluorescensanalyse (IFA).
- Probe cellene med et anti-GFP antistoff og et Toxoplasma spesifikt antistoff (som anti-TgALD) for å merke totale parasitter. Se antistoff-produktarket for anbefalt fortynning (vanligvis 1: 1000 er tilstrekkelig for IFAer). Hvis antistoffene er ukonjugerte, bruk to forskjellige sekundære antistoffer som er konjugert med fluorescerende fargestoffer til å merke de primære antistoffene.
- Følg de merkede cellene på et fluorescerende mikroskop med filtre som passer for sekundære fluorescerende fargestoffer. Oppnå transfeksjonseffektivitet ved å dividere antall GFP positive parasitter med antall totale parasitter.
MERK: De to antistoffene som brukes for IFA, skal komme fra to forskjellige vertsarter, for eksempel ved bruk av kombinasjonen av anti-GFP og kanin anti-TgALD.
- Bestem fKrav på sinusfunginresistens i transfekterte parasitter.
- For de transfekterte parasittene som dyrkes i T25-kolber, vokser de i 2-3 d til naturlig utgang. Deretter samles parasittene, stumpe nållyscelleceller for å frigjøre intracellulære parasitter og rense dem ved filtrering gjennom membraner med porestørrelse på 3 μm. Telle parasittene med et hemocytometer for å estimere tettheten.
- Legg til rensede parasitter i 6-brønnsplater frøet med sammenflytende HFF-celler: For første rad (3 brønner), tilsatt 200 parasitter / brønn og dyrk dem i vanlig D10 medium (2 ml / brønn); For andre rad, legg til 5000 parasitter / brønn og dyrk dem i D10 medium inneholdende 0,3 μM sinefungin.
- Plasser platene i en 5% CO 2- inkubator og dyrk parasittene ved 37 ° C 8-10 d uten forstyrrelser for å la plakkene dannes. Fest prøvene med 70% etanol (2 ml / brønn) og flekk monolaget med 0,1% krystallviolett (2 ml / brønn). Vask brønnene med vann for å visualiserePlakkene (klare soner) dannet av parasittvekst.
MERK: Den negative kontrollen skal behandles på samme måte side ved side.
- Beregn frekvensen av CRISPR indusert sinusfunginresistens.
- Skaff gjennomsnittlig tall (X) av plakk fra brønner som ikke inneholder stoff og beregne parasittets levedyktighet som X / 200. Oppnå gjennomsnittlig tall (Y) av plaques fra brønner som inneholder sinfungin for å beregne frekvensen av CRISPR-indusert senfunginresistens som følger:
Sats på CRISPR-indusert motstand = 200 × Y / (5000 x X × transfeksjonseffektivitet)
MERK: Transfeksjonseffektivitet er oppnådd fra 4.3.2.
- Skaff gjennomsnittlig tall (X) av plakk fra brønner som ikke inneholder stoff og beregne parasittets levedyktighet som X / 200. Oppnå gjennomsnittlig tall (Y) av plaques fra brønner som inneholder sinfungin for å beregne frekvensen av CRISPR-indusert senfunginresistens som følger:
- Frø HFF-celler til dekselplater plassert i 24-brønnplater 3-4 d før elektroporasjon, slik at de er sammenflytende til tiden for å utføre transfeksjon i 4.2.
- Undersøk indelmutasjonene indusert av CRISPR / Cas9
- Grow de elektroporerte parasittene fra punkt 4.2.9 i en T25-kolbe sådd med HFF-celler i 2 d ved 37 ° C. Deretter erstattes mediet med 5 ml D10 medium inneholdende 0,3 μM sinefungin (seleksjonsmedium).
- Oppbevar parasittene i utvalgsmedium i minst 3 passasjer til det resistente bassenget blir stabilt (indikeres ved fravær av parasittvekst i den negative kontrollgruppen, men robust parasittvekst i forsøksgruppen).
- Subklone den slemfinnelige motstandsdyktige bassenget for å oppnå klonestammer.
- Samle nyutrettede parasitter, rense ved 3 μm membranfiltrering og subklon i 96-brønnsplater frøet med sammenflytende HFF-celler i 150 μl D10-medium. Dyrk subkloningskulturer i en CO 2- inkubator ved 37 ° C i 7 - 10 d uten å forstyrre platene.
MERK: Se protokoll 4.4.2.1 Merknad i S tilleggsfil 1 .
- Samle nyutrettede parasitter, rense ved 3 μm membranfiltrering og subklon i 96-brønnsplater frøet med sammenflytende HFF-celler i 150 μl D10-medium. Dyrk subkloningskulturer i en CO 2- inkubator ved 37 ° C i 7 - 10 d uten å forstyrre platene.
- Kontroller 96-brønnplatene under et invertert fasekontrastmikroskop for å lete etter brønner som bare inneholder en plaque. Merk slike brønner og overfør deretter cellene fra hver brønn til 24 brønnplater frøet med HFF-celler ved hjelp av en pipette. <Li> Når 80-90% av HFF-cellene i en brønn lyseres, høst parasitten (ca. 500 μl) og passer 50 μL parasittoppløsning til en ny brønn for å opprettholde belastningen. Bruk resten (≈ 450 μL) til å ekstrahere genomisk DNA for PCR amplifisering.
- For genomisk DNA-isolasjon fra SNF- r- klonen, pelletiserer parasittene (små mengder HFF-cellekontaminering tolererbar) ved 1000 xg i 10 minutter. Vask de pelleterte parasittene med fosfatbuffert saltvann (PBS) en gang og pellet dem igjen. Isoler genomisk DNA fra pelleterte celler ved bruk av et kommersielt sett eller ved koking. Resuspender parasitter i 50-100 μL PBS.
MERK: Utfør PCR for å oppnå et fragment av SNR1- genet for sekvensering. Bruk følgende primere til å amplifisere SNR1-locus 2 : SNR1-Amp-Fw: 5 'CCGACCACAA CAATTTTC og SNR1-Amp-Rv: 5'GACGTGATTCACTTTTTTACAGACAGAC. Bruk høyfidelitets DNA-polymeraser. Forsterk WT-lokalet for kontrollformål.
- Grow de elektroporerte parasittene fra punkt 4.2.9 i en T25-kolbe sådd med HFF-celler i 2 d ved 37 ° C. Deretter erstattes mediet med 5 ml D10 medium inneholdende 0,3 μM sinefungin (seleksjonsmedium).
- Utfør tHan PCR med 20 μl reaksjonsvolum og kjøre det med følgende program: 98 ° C i 1 min, etterfulgt av 30 sykluser på 98 ° C i 10 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 2,5 min, etterfulgt av Siste forlengelse i 2 minutter ved 72 ° C.
MERK: Se etter PCR-produktene ved hjelp av følgende primere: SNR1-Seq1: 5 'GCC ACA TGC TTT AGC GTG, SNR1-Seq2: 5' TCC TCT CCA TCA CGG GTT GG, SNR1-Seq3: 5 'GCA AGA GCC GCG TGA CG , SNR1-Seq4: 5 'CTC TCC CGC GGT CGA G, SNR1-Seq5: 5' GCA CCG TCC GCA AGC og SNR1-Seq6: 5 'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC. - Sammenlign sekvensene av SNR1- genet fra senfunginresistente mutanter til det for WT-stammen ved hjelp av et sekvensjusteringsverktøy.
MERK: Se tilleggsfil 2- protokoll 5 for detaljer om bruk av negativt utvalg på SNR1- stedet for genetisk komplementering eller transgen belastning.
- Plott scanresultater for bare kromosom IX, kromosomet med høyeste topp:
Representative Results
Denne artikkelen skisserer i detalj flere metoder som kan brukes i rekkefølge for å identifisere et gen som er ansvarlig for stoffresistens ( figur 1 ). De 24 avkomene fra ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset ble vurdert for resistens mot stoffet sinusfungin som beskrevet i protokoll 1. Ved bruk av det genetiske kartet og SNF r- fenotypen av avkom ble en QTL-skanning kjørt i R / Qtl - protokoll 2 ( figur 2 ). Dette resulterte i en signifikant topp på kromosom IX som spenner over 1 Mbp. Det er i denne regionen at årsaksmutasjonen er lokalisert.
For å identifisere årsakssammenstillingen, leses WGS fra avkomma som ble justert til VAND-SNFs referansegenomet ved bruk av Bowtie2 - Protocol 3.1, ble SNPs kalt ved å bruke VarScan mpileup2snp - Protocol 3.2, og QTL-locuset i VAND-genomet ble identifisert ved bruk av MUMmer - ProtocOl 3.3. Avkom SNPs i QTL-lokalet ble ekstrahert og skannet for et mønster der SNF r- avkom har en SNP og SNF s ikke, noe som er mulig fordi avkom SNPs ble oppnådd ved sammenligning med VAND-SNFs referansegenomet ( figur 3 ) . Bare en SNP matchet dette mønsteret som resulterer i en tidlig stoppkodon i et antatt aminosyre-transportgener som heter SNR1 .
Bekreftelse at SNR1 er SNF r- resistensgenet ble utført ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Et nytt CRISPR / Cas9-plasmid konstruert for T. gondii -genredigering ble fremstilt som inneholdt et gRNA rettet mot SNR1- genet nær SNFr -mutasjonen identifisert i avkommet - protokoll 4 ( figur 4A ). Den SNR1- målrettede CRISPR / Cas9 plasmidet ble elektroporert inn i en SNF s WT parasitt stamme og resistente mutanter ble oppnådd når kultUred i 0.3 μM sinefungin. Ingen SNF r parasitter ble oppnådd når elektroporert med UPRT målrettet CRISPR / Cas9 plasmid. Flere SNF r CRISPR-mutanter ble klonet og regionen rundt SNR1- gRNA-målet ble sekventert. Hver mutant hadde en indel som forstyrret den kodende sekvens av SNR1 genet ( Figur 4B ). Denne metoden kan også brukes til å sette inn en målkonstruksjon i SNR1- locuset via NHEJ ( Figur 5), eller ved HR ( Figur 6 ) - Supplerende fil 2 .
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt for eksperimenter skissert i protokollene. Hovedtrinnene for å identifisere og bekrefte SNF r- genet ved hjelp av ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset er vist med henvisning til de relevante protokollene som er skissert i tHans artikkel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: R / qtl Kommandoer for å kjøre QTL Scan på SNF r Phenotype. Kommandoene som beskrevet i protokoll 2 ble kjørt i R ved hjelp av qtl-pakken. Representative kommandoer og plott vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av Causal SNP. Avkom WGS leser ble justert til VAND-SNFs referansegenomet med Bowtie 2, SNPs ble kalt med VarScan, og de korresponderende Ing VAND QTL locus identifisert med MUMmer. SNPs som befinner seg innenfor QTL-locus, ble importert til et regneark, og årsaks-SNP ble identifisert. SNF r avkom (gul), SNF s avkom (grønn), SNF r SNP (rød) (se datafil 3 ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bekreft SNR1 som SNF-gen ved bruk av CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 indusert indelmutasjoner (grønn) i SNR1- lokalet. ( B ) Representative indeler i SNR1 forårsaket av to forskjellige SNR1- spesifikke CRISPR-plasmider (henholdsvis C5 og C6). RH er WT-stammen og C5 og C6 er SNF r- mutanter. (B er hentet fra referanseS = "xref"> 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Innsettende mutagenese ved bruk av CRISPR / Cas9. ( A ) Innsetting av komplementerende eller transgene gener i SNR1- lokalet ved CRISPR / Cas9-mediert stedsspesifikk integrasjon. To mulige orienteringer av det innførte DHFR * mini-genet og de primere som brukes for identifikasjon, F1 / 2 og R1 / 2 representerer primingstedene for oligos anvendt i diagnostiske PCR. ( B ) Diagnostiske PCR av en snr1 :: DHFR * klon, RH brukes som en WT-kontroll. PCR av GRA1p er inkludert som en kontroll som kontrollerer kvaliteten på genomisk DNA som maler. Stjerner indikerer baner med uspesifikke bånd (Figur 5B er hentet fra referansenCe 2 ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Gene Knockout ved hjelp av CRISPR / Cas9. En klassisk design for CRISPR / Cas9-mediert homologt genutskifting i T. gondii . Orienteringen av innsatt transgen er løst i dette tilfellet. F1 / R1, F2 / R2 og F3 / R3 representerer primingstedene for oligos anvendt i diagnostiske PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Datafil 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Korsfil fEller bruk i R / qtl, "csv" Format. En .csv-fil som kan lastes inn i R / qtl med formatet = "csv". Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Datafil 2: (chord txt, genotype txt, markørpos.txt, mname.txt, phenonames.txt og phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Korsfiler for bruk i R / qtl, "gary" Format. Seks .txt-filer som kan lastes inn i R / qtl med formatet = "gary" -alternativet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Datafil 3. Regneark med avkom SNP over SNF r
Supplerende fil 1: Ytterligere protokolldetaljer. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil 2: Protokoll 5 - Utnyttelse av negativ utvelgelse på SNR1-stedet for genetisk komplementering eller transgenisk stamme-konstruksjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Disse protokollene presenterer flere metoder som, når de kombineres, tillater identifisering av et medikamentresistensgen i T. gondii . To spesielt var integrert i prosjektet, den relativt erfarne metoden for QTL-kartlegging og den nylig utviklede metoden for CRISPR / Cas9-genredigering. Lander og Botstein publiserte sitt innflytelsesrike papir i 1989 og demonstrerte QTL-kartlegging som korrelerer genetiske loci med fenotyper 36 . Mer nylig i 2012 beskrev Dounda og Charpentier CRISPR / Cas9-redigeringssystemet i Streptococcus pyogenes 22 som raskt ble tilpasset som et genetisk verktøy i mange forskjellige modeller, inkludert T. gondii 13 , 17 . Begge metodene var nyttige her, hvor QTL-kartlegging definerte lokusen som inneholdt stoffresistansmutasjonen som i siste instans ble identifisert ved hjelp av WGS-basert SNP-deteksjon, og CRISPR / Cas9-redigering ga meg Ans for å bekrefte SNR1 er det senfungin narkotika resistensgenet.
ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset 8 ble opprinnelig utviklet for å forhøre en virulensfenotype 19 , men foreldrenes stammer skjedde også å ha en ytterligere fenotypisk forskjell som ikke var kjent for årsakssystemet, sinusfeltresistens i VAND-foreldrene. Dette fremhever en fordel med kryss ved at de kan bli repurposed når flere fenotypiske forskjeller i foreldrene blir observert. Dette var tilfellet for et annet toxoplasma- kryss, type 2 x type 3, hvor flere gener involvert i virulens ble funnet ved å kartlegge flere fenotyper 37 , 38 , 39 , 40 . Hittil har fire forskjellige T. gondii kryss blitt beskrevet og brukt til å kartlegge gener som er ansvarlige for fenotyperSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , som alle har potensial til å bli gjenbrukt for å kartlegge nye fenotyper som det genetiske grunnlaget er ukjent for. Langs disse linjene er genomene for 62 T. gondii- stammer som representerer det kjente globale genetiske mangfoldet blitt sekvensert 43 . Nye kryss kan gjøres fra dette bassenget for stammer som avviger i interessante fenotyper. Etter å ha forvirret fordelene ved QTL-kartlegging, må det sies at generering av et kryss er ikke et mindre foretak. Det finnes andre metoder som kan brukes til å identifisere årsaksgener. En kraftig teknikk bruker kjemisk mutagenese til å skape mutanter som kan screenes for fenotyper. For å finne årsaksgenet kan mutanter enten komplementeres med kosmidbiblioteker 44 eller genomsekventeringsmetoder kan brukes til å finne årsaksmutasjonen 45 . For moSe på to JoVE-artikler av Coleman et al. Og Walwyn et al. Som skisserer disse tilnærmingene 46 , 47 .
Mange av trinnene som fører til identifisering av årsakssammenheng SNF r mutasjon (Protokoll 2 og 3) stammer fra beregningsmetoder utført med programvare som er fritt tilgjengelig for akademisk bruk. Detaljert kommandoer for hvert trinn er gitt, og når du kjører med de riktige filene, kan brukeren gjenskape datasettene som er nødvendige for å finne årsakssammenheng SNF r SNP. Husk at noen av syntaksene i kommandoene refererer til filnavn eller katalogstruktur ($ PATH) som kan endres til brukerens preferanse. Selv om kommandoene som er gitt her, absolutt ikke utmater måtene man kan analysere et kryss med QTL-analyse og WGS-basert SNP-identifikasjon, er de omfattende nok til å gjenta eksperimentet beskrevet i denne artikkelen, og skal tillate brukeren å bli m Malm kjent med hvordan disse tilnærmingene benyttes i en trinnvis måte.
Selv om QTL-kartlegging og WGS-sekvensbasert SNP-deteksjon var tilstrekkelig til å identifisere et kandidat SNF- r- gen, er det nødvendig med ytterligere eksperimenter for å bekrefte sin rolle i stoffresistens. Dette kan overbevisende vises ved genforstyrrelser eller knockout-teknikker, som begge kan oppnås ved hjelp av CRISPR / Cas9-genredigering. Detaljert metoder for bruk av CRISPR / Cas9 for å enten generere indelmutasjoner eller sette inn transgene konstruksjoner i et målgen i T. gondii er gitt. Den målrettede spesifisiteten som CRISPR / Cas9 gir, øker effektiviteten av genredigering over tradisjonelle metoder. Også denne økningen har effektivt gjort det mulig å bruke ikke-laboratorie-tilpassede stammer for genetiske studier som tidligere var vanskelige å modifisere 13 . Selv om CRISPR / Cas9 i sin barndom allerede har blitt brukt til å gjøre genforstyrrelserLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , merk gener 17 , og lag genuttrykk 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 i T. gondii , lovende å være et nyttig verktøy For mange andre studier i fremtiden.
Oppdagelsen av at SNR1- inaktivering fører til sinusfungende motstand, gjør SNR1- locuset et lovende sted for transgeninnføring eller genetisk komplementering. For å maksimere suksessen med å bruke CRISPR / Cas9-mediert genmålretting for å lede integrasjonen av transgen til SNR1- lokalet, bør følgende aspekter være viktigeRødt under eksperimentell design. Først anbefales en markeringsmarkør å bli inkludert i den transgene konstruksjonen for å øke effektiviteten av belastningskonstruksjon. Hvis en markeringsmarkør er inkludert, kan både positivt og negativt utvalg brukes, noe som resulterer i at nesten 100% av de dobbeltvalgte parasittene er transgene med GOI integrert på SNR1- locus. I motsetning dersom effekten av vellykket transgenese i stor grad avhenger av effektiviteten av cotransfeksjonen av CRISPR-plasmidet og den transgene konstruksjon, hvis den transgene konstruksjon ikke inneholder flere selekterbare egenskaper og avhenger av negativt utvalg på SNR1- locuset.
For det andre, selv om CRISPR / Cas9-mediert stedsspesifikk integrasjon av et ikke-homologt DNA-fragment ofte brukes for komplementering og transgenese, bør det bemerkes at orienteringen av innsetting ikke kan garanteres i slike tilfeller som begge retninger er mulige. Dette kan utgjøre problemerMs til noen applikasjoner. For eksempel, for å komplementere en mutant med forskjellige gen alleler, er det vanskelig å sikre at alle alleler er satt inn i samme orientering, og uoverensstemmelser i orientering kan forårsake uttrykksforskjeller. For denne typen søknad anbefales DNA-konstruksjoner med sekvenser som er homologe til SNR1- locuset, som vil drive riktig integrasjonsorientering ( figur 6 ).
For det tredje, under transfeksjonen, er forholdet mellom CRISPR-plasmidet og det transgene DNA-molekylet kritisk for vellykket transgenisk belastningskonstruksjon. Dette forholdet må justeres i henhold til utvalgsstrategiene. Følgende retningslinjer anbefales: 1) Hvis den transgene konstruksjonen inneholder en medikamentresistent markør og det tilsvarende legemidlet, er det eneste valget som brukes til å generere transgene parasitter, det vil si at senfungin ikke brukes, det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjonen og CRISPR-plasmaetID er 1: 5. Ved å bruke mer CRISPR-plasmid i dette tilfellet øker sannsynligheten for at parasitter som mottar den transgene konstruksjonen også mottar CRISPR-plasmidet, derfor er det mer sannsynlig at stoffresistente parasitter har markøren satt inn på CRISPR-målingsstedet. Hvis forholdet er reversert, vil de fleste parasitter som mottar den transgene konstruksjonen ikke få CRISPR-plasmidet. Som et resultat oppnår det store flertallet av stoffresistente parasitter den transgene konstruksjonen gjennom tilfeldig integrasjon som ikke er forbundet med CRISPR / CAS9-mediert stedsspesifikk innføring. 2) Dersom den transgene konstruksjon inneholder en medikamentresistent markør og det tilsvarende legemiddel brukes sammen med sinfungin for å velge transgene parasitter, er det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjon og CRISPR-plasmidet 1: 1. Denne strategien gir den høyeste effektiviteten av transgen belastning konstruksjon. 3) Hvis den transgene konstruksjonen ikke inneholder en valgbar produsent, stole på negativt valgVed sinfungin alene for å oppnå transgene parasitter, er det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjon og CRISPR-plasmidet 5: 1. Begrunnelsen for denne utformingen er den samme som i den første retningslinjene ovenfor. Siden både pyrimethamin og sinfungin ble brukt til seleksjon i protokoll 5 ble forholdet mellom DHFR * mini-genet og SNR1- målretting-CRISPR-plasmidet satt til 1: 1.
Samlet sett har metodene som er skissert her detaljnivå som ikke var mulig å formidle i den opprinnelige publikasjonen som identifiserte SNR1 2 . Disse protokollene; Spesielt bør kommandolinjens syntaks, sekventiell utforming av programmene som brukes, og bruken av CRISPR / Cas9 hjelpe fremtidige bestrebelser for å identifisere nye gener som er ansvarlige for fenotyper.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke L. David Sibley og Asis Khan for deres bidrag til den opprinnelige publikasjonen som disse protokollene bygger på. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health grant AI108721.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 flasks | Corning | 430639 | |
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) | ATCC | SCRC-1041 | |
| T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
| T. gondiiVAND strain | ATCC | PRA-344 | |
| DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
| Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
| Syringe 10 mL | BD | 309604 | |
| Blunt needles 22 G x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
| Nuclepore Filter 3.0 µm, 25 mm | GE Healthcare | 110612 | |
| Swin-Lok Filter Holder 25 mm | GE Healthcare | 420200 | |
| Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
| R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
| Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
| NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
| SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
| VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
| MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
| pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
| pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
| pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
| L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
| Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
| Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
| 6-well TC plate | Corning | 353046 | |
| 24-well TC plate | Corning | 353935 | |
| Cover glass 12 mm round | VWR International | 89015-724 | |
| 96-well TC plate | Corning | 353075 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol |
References
- Dubey, J. P. The history of Toxoplasma gondii--the first 100 years. J Eukaryot Microbiol. 55 (6), 467-475 (2008).
- Behnke, M. S., Khan, A., Sibley, L. D. Genetic Mapping Reveals that Sinefungin Resistance in Toxoplasma gondii Is Controlled by a Putative Amino Acid Transporter Locus That Can Be Used as a Negative Selectable Marker. Eukaryot Cell. 14 (2), 140-148 (2015).
- Dubey, J. P. History of the discovery of the life cycle of Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. 39 (8), 877-882 (2009).
- Pfefferkorn, L. C., Pfefferkorn, E. R. Toxoplasma gondii: genetic recombination between drug resistant mutants. Exp Parasitol. 50 (3), 305-316 (1980).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Insertional mutagenesis and marker rescue in a protozoan parasite: cloning of the uracil phosphoribosyltransferase locus from Toxoplasma gondii. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5749-5753 (1995).
- Sullivan, W. J. Jr Insertional tagging of at least two loci associated with resistance to adenine arabinoside in Toxoplasma gondii, and cloning of the adenosine kinase locus. Mol Biochem Parasitol. 103 (1), 1-14 (1999).
- Khan, A. Composite genome map and recombination parameters derived from three archetypal lineages of Toxoplasma gondii. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2980-2992 (2005).
- Khan, A. NextGen sequencing reveals short double crossovers contribute disproportionately to genetic diversity in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15 (1), 1168 (2014).
- Shaik, J. S., Khan, A., Beverley, S. M., Sibley, L. REDHORSE-REcombination and Double crossover detection in Haploid Organisms using next-geneRation SEquencing data. BMC Genomics. 16 (1), 133 (2015).
- Arends, D., Prins, P., Jansen, R. C., Broman, K. W. R/qtl: high-throughput multiple QTL mapping. Bioinformatics. 26 (23), 2990-2992 (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Koboldt, D. C. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9. MBio. 5 (3), e01114 (2014).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryot Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryot Cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Wang, J. L. The Past, Present, and Future of Genetic Manipulation in Toxoplasma gondii. Trends Parasitol. , (2016).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient genome engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. PLoS One. 9 (6), e100450 (2014).
- Sugi, T., Kato, K., Weiss, L. M. An improved method for introducing site-directed point mutation into the Toxoplasma gondii genome using CRISPR/Cas9. Parasitol Int. , (2016).
- Behnke, M. S. Rhoptry Proteins ROP5 and ROP18 Are Major Murine Virulence Factors in Genetically Divergent South American Strains of Toxoplasma gondii. PLoS Genet. 11 (8), e1005434 (2015).
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S., Doudna, J. A. STRUCTURAL BIOLOGY. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science. 348 (6242), 1477-1481 (2015).
- Nishimasu, H. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org (2016).
- Smith, R., Sheppard, K., DiPetrillo, K., Churchill, G. Quantitative trait locus analysis using J/qtl. Methods Mol Biol. 573, 175-188 (2009).
- The Churchill Group. , J/qtl. http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml (2013).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kurtz, S. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome Biol. 5 (2), (2004).
- Gajria, B. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36 (Database issue), D553-D556 (2008).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
- Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol. 219, 247-259 (1996).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Lander, E. S., Botstein, D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics. 121 (1), 185-199 (1989).
- Saeij, J. P. Polymorphic secreted kinases are key virulence factors in toxoplasmosis. Science. 314 (5806), 1780-1783 (2006).
- Saeij, J. P. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
- Rosowski, E. E. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
- Reese, M. L., Zeiner, G. M., Saeij, J. P., Boothroyd, J. C., Boyle, J. P. Polymorphic family of injected pseudokinases is paramount in Toxoplasma virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9625-9630 (2011).
- Taylor, S. A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogen Toxoplasma gondii. Science. 314 (5806), 1776-1780 (2006).
- Behnke, M. S. Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9631-9636 (2011).
- Lorenzi, H. Local admixture of amplified and diversified secreted pathogenesis determinants shapes mosaic Toxoplasma gondii genomes. Nat Commun. 7, 10147 (2016).
- Gubbels, M. J. Forward genetic analysis of the apicomplexan cell division cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36 (2008).
- Farrell, A. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
- Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), (2012).
- Walwyn, O. Forward genetics screens using macrophages to identify Toxoplasma gondii genes important for resistance to IFN-gamma-dependent cell autonomous immunity. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rugarabamu, G., Marq, J. B., Guerin, A., Lebrun, M., Soldati-Favre, D. Distinct contribution of Toxoplasma gondii rhomboid proteases 4 and 5 to micronemal protein protease 1 activity during invasion. Mol Microbiol. 97 (2), 244-262 (2015).
- Varberg, J. M., Padgett, L. R., Arrizabalaga, G., Sullivan, W. J. Jr TgATAT-Mediated alpha-Tubulin Acetylation Is Required for Division of the Protozoan Parasite Toxoplasma gondii. mSphere. 1 (1), (2016).
- Zheng, J., Jia, H., Zheng, Y. Knockout of leucine aminopeptidase in Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. Int J Parasitol. 45 (2-3), 141-148 (2015).
- Long, S., Wang, Q., Sibley, L. D. Analysis of Noncanonical Calcium-Dependent Protein Kinases in Toxoplasma gondii by Targeted Gene Deletion Using CRISPR/Cas9. Infect Immun. 84 (5), 1262-1273 (2016).
- Wang, K. Identification of Novel O-Linked Glycosylated Toxoplasma Proteins by Vicia villosa Lectin Chromatography. PLoS One. 11 (3), e0150561 (2016).
- Yang, M., Zheng, J., Jia, H., Song, M. Functional characterization of X-prolyl aminopeptidase from Toxoplasma gondii. Parasitology. , 1-7 (2016).
- Zhang, W. Analysis of the virulence determination mechanisms in a local Toxoplasma strain (T.gHB1) isolated from central China. Parasitol Res. , (2016).
