Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Mohamed I. Hassan; Fern R. McSorley; Kinya Hotta; Christopher N. Boddy

doi:10.3791/55187

JoVE Journal > Genetics

Genetics

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Published: June 27, 2017

doi:

10.3791/55187

Mohamed I. Hassan*¹, Fern R. McSorley*¹, Kinya Hotta, Christopher N. Boddy

¹Department of Chemistry and Biomolecular Sciences,University of Ottawa, ²School of Biosciences,The University of Nottingham Malaysia Campus

Summary

Denne undersøgelse beskriver metoder til T7-medieret co-ekspression af multiple gener fra et enkelt plasmid i Escherichia coli ved anvendelse af pMGX-plasmidsystemet.

Abstract

Co-ekspression af multiple proteiner er i stigende grad afgørende for syntetisk biologi, undersøgelse af protein-proteinkomplekser og karakterisering og udnyttelse af biosyntetiske veje. I dette manuskript beskrives anvendelsen af et yderst effektivt system til konstruktion af multigen-syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-RNA-polymerase. Dette system tillader mange gener at udtrykkes samtidigt fra et plasmid. Her er et sæt af fire beslægtede vektorer, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K og pMGX-hisK, med enten ampicillin eller kanamycinresistens selekterbar markør (A og K) og enten besidder eller mangler en N-terminale hexahistidin Tag (hans) er beskrevet. Detaljerede protokoller til konstruktionen af syntetiske operoner under anvendelse af dette vektorsystem tilvejebringes sammen med de tilsvarende data, hvilket viser, at et pMGX-baseret system indeholdende fem gener let kan konstrueres og anvendes til fremstilling af alle fem kodede proteiner i Escherichia coli . Denne systEm og protokol gør det muligt for forskere rutinemæssigt at udtrykke komplekse multikomponentmoduler og veje i E. coli .

Introduction

Samekspression af flere proteiner bliver stadig vigtigere, især i syntetiske biologiske applikationer, hvor flere funktionelle moduler skal udtrykkes ¹ ; Ved undersøgelse af protein-proteinkomplekser, hvor udtryk og funktion ofte kræver coexpression ² ^, ³ ; Og ved at karakterisere og udnytte biosyntetiske veje, hvor hvert gen i vejen skal udtrykkes ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . Et antal systemer er blevet udviklet til co-ekspression, især i værtsorganismen Escherichia coli , arbejdshesten til rekombinant proteinekspression ⁹ . For eksempel kan multiple plasmider med forskellige selekterbare markører anvendes til at udtrykke individuelle proteiner ved anvendelse af et væld af forskellige ex Pressionsvektorer ¹⁰ ^, ¹¹ . Enkelte plasmidsystemer til multipel proteinekspression har anvendt enten multiple promotorer til at styre ekspressionen af hvert gen ¹⁰ ^, ¹² ; Syntetiske operoner, hvor flere gener kodes på et enkelt transkript ² ^, ¹³ ; Eller i nogle tilfælde et enkelt gen kodende for et polypeptid, der i sidste ende behandles proteolytisk, hvilket giver de ønskede proteiner af interesse ¹⁴ .

Figur 1: pMGX-arbejdsgang viser konstruktionen af en polykistronisk vektor. PMGX-systemet giver en fleksibel, nem at bruge strategi til konstruktion af syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

I dette manuskript beskrives brugen af et yderst effektivt system til konstruktion af multigen-syntetiske operoner under kontrol af en inducerbar T7-RNA-polymerase ( figur 1 ). Dette system tillader mange gener at udtrykkes samtidigt fra et plasmid. Det er baseret på et plasmidsystem, oprindeligt kaldet pKH22, der er blevet anvendt succesfuldt til en række forskellige applikationer ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . Her ekspanderes dette plasmidsæt for at indbefatte fire beslægtede vektorer: pMGX-A, en ekspressionsvektor, der mangler nogen C- eller N-terminale mærker og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-hisA, en ekspressionsvektor, som koder for et N-terminalt hexahistidintag og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-K, en ekspressionsvektor lAkkingerer nogen C- eller N-terminale mærker og med kanamycinresistensmarkøren; Og pMGX-hisK, en ekspressionsvektor, som koder for et N-terminalt hexahistidintag og med kanamycinresistensmarkøren. I dette studie demonstreres fremgangsmåden til generering af en polykistronisk vektor indeholdende fem gener ved anvendelse af pMGX-systemet, specifikt pMGX-A, sammen med den succesrige produktion af hvert enkelt protein i Escherichia coli .

Protocol

1. Opnåelse af interesser Design syntetiske gener. Optimer en gensekvens for E. coli ekspression. Fjern eventuelle problematiske restriktionssteder fra sekvensen (AvrII, NdeI, EcoRI og XbaI). Indarbejde restriktionssteder for kloning; Et 5'-NdeI site og et 3'-EcoRI site anbefales. Andre steder kan bruges, hvis det er nødvendigt; Henviser til multikloningsområdet for det valgte plasmid ( figur S1- S4</strong…

Representative Results

I dette forsøg var målet at co-udtrykke fem proteiner fra et enkelt plasmid. De fem-kodonoptimerede syntetiske genfragmenter, der koder for enten N- eller C-terminale hexahistidinmærker, blev købt kommercielt. De syntetiske gener blev amplificeret ved PCR og individuelt klonet i en PCR-stump vektor og sekventeret. For at generere det polykistroniske plasmid klonedes de fem interesserede gener først i et egnet pMGX plasmid, pMGX-A. Figur 2 viser PCRBlunt…

Discussion

Co-ekspression af flere gener er i stigende grad afgørende, især ved karakterisering og rekonstituering af komplekse, multigen metabolske veje ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . PMGX-systemet gør multigen co-ekspression i E. coli rutine ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ og tilgængelig for forskellige forskere. I denne undersøgelse viste fem proteiner af interesse, at …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Canadas naturvidenskabelige og tekniske forskningsråd.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	New England Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent Technologies	600677
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	456-8095
50 x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
Agar	Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampicilin	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells			Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent	Fisher Thermo Scientific	PI78243
dNTP mix	Agilent Technologies		Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse	GenScript	A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Methanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Pasteurized instant skim milk powder	Local grocery store		No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit	Omega	D6943-02	E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers	Intergrated DNA Technologies		Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene	Life Technologies		Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703932
Tris base	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells			Comeptent cell prepared in house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Gel box – PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubator-oven	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D	Isotemp
Incubator-shaker	Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Personna Razors	Fisher Thermo Scientific	S04615
Power Pack	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transilluminator	VWR International	M-10E,6W
Thermocylcer	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Waterbath	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell

References

Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).