Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX
Summary
Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.
Abstract
Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds meer essentieel voor synthetische biologie, het bestuderen van proteïne-eiwit complexen en het karakteriseren en toepassen van biosynthetische pathways. In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigene synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7-RNA-polymerase beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Hierin is een reeks van vier gerelateerde vectoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K en pMGX-hisK, met ofwel de ampicilline of kanamycine resistentie selecteerbare merker (A en K) en ofwel een N-terminale hexahistidine Tag (zijn) worden bekendgemaakt. Gedetailleerde protocollen voor de constructie van synthetische operonen die dit vectorsysteem gebruiken, worden samen met de bijbehorende gegevens verschaft, waaruit blijkt dat een pMGX-gebaseerd systeem dat vijf genen bevat, gemakkelijk kan worden geconstrueerd en gebruikt om alle vijf gecodeerde eiwitten in Escherichia coli te produceren. Deze systEm en protocol kunnen onderzoekers routinematig complexe multifunctionele modules en pathways uitdrukken in E. coli .
Introduction
Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds belangrijker, met name bij toepassingen in synthetische biologie, waar meerdere functionele modules uitgedrukt moeten worden 1 ; Bij het bestuderen van eiwit-eiwit complexen, waarbij expressie en functie vaak co-expressie 2 , 3 vereisen; En bij het karakteriseren en gebruik maken van biosynthetische trajecten, waarbij elk gen in het traject 4 , 5 , 6 , 7 , 8 moet worden uitgedrukt. Er zijn een aantal systemen ontwikkeld voor co-expressie, in het bijzonder in het gastheerorganisme Escherichia coli , het werkpaard voor recombinant eiwituitdrukking 9 van het laboratorium. Bijvoorbeeld, meerdere plasmiden met verschillende selecteerbare markers kunnen worden gebruikt om individuele eiwitten uit te drukken met behulp van een rijkdom van verschillende ex Drukvectoren 10 , 11 . Enkele plasmidesystemen voor meerdere eiwituitdrukking hebben ofwel meerdere promotors gebruikt om de expressie van elk gen 10 , 12 te regelen; Synthetische operonen, waarbij meerdere genen gecodeerd zijn op een enkel transcript 2 , 13 ; Of in sommige gevallen een enkel gen dat codeert voor een polypeptide dat uiteindelijk proteolytisch wordt verwerkt, waardoor de gewenste eiwitten van belang 14 worden verkregen .
Figuur 1: pMGX workflow met de constructie van een polycistrische vector. Het pMGX systeem biedt een flexibele, makkelijk te gebruiken strategie voor de constructie van synthetische operonen onder controle van een induceerbare T7 promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigeen synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7 RNA polymerase ( Figuur 1 ) beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Het is gebaseerd op een plasmide systeem, oorspronkelijk genaamd pKH22, die succesvol is gebruikt voor een aantal verschillende toepassingen 6 , 7 , 8 . Hier wordt deze plasmide set uitgebreid om vier gerelateerde vectoren te omvatten: pMGX-A, een expressievector die geen C- of N-terminale labels en met de ampicilline resistentie merker ontbreekt; PMGX-hisA, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de ampicilline resistentie marker; PMGX-K, een expressievector lC-of N-terminale tags en met de kanamycine resistentie marker; En pMGX-hisK, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de kanamycine resistentie marker. In deze studie wordt de werkwijze voor het genereren van een polycistrische vector die vijf genen bevat die het pMGX-systeem gebruiken, in het bijzonder pMGX-A, aangetoond, samen met de succesvolle productie van elk afzonderlijk eiwit in Escherichia coli .
Protocol
Representative Results
Discussion
Co-expressie van meerdere genen is steeds belangrijker, met name bij het karakteriseren en reconstituteren van complexe, multigene metabolische pathways 3 , 4 , 5 . Het pMGX-systeem maakt multigene co-expressie in E. coli routine 6 , 7 , 8 en toegankelijk voor diverse onderzoekers. In deze studie bleek dat vijf eiwitten van be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en Engineering van Canada.
Materials
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50 x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box – PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
