Summary
I hjertet, molekylære hendelser som koordinerer den elektriske og kontraktile funksjon av organet. Et sett av lokale felt fluorescens-mikroskopi teknikker som presenteres her muliggjør opptak av cellulære variabler i intakte hjertet. Identifisere mekanismer som definerer hjertefunksjonen er avgjørende for å forstå hvordan hjertet fungerer under patologiske situasjoner.
Abstract
I hjertet, er molekylsignaleringsstudier vanligvis utført i isolerte myocytter. Men mange patologiske tilstander slik som iskemi og arytmier kan bare bli fullt ut forstått på hele organet nivå. Her presenterer vi den spektroskopiske teknikk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) som tillater måling av cellulære signaler i intakt hjerte. Teknikken er basert på en kombinasjon av et Langendorff perfusert hjerte og optiske fibre for å ta opp fluorescente signalene. LFFM har ulike bruksområder innen kardiovaskulær fysiologi til å studere hjertet under normale og patologiske tilstander. Flere hjertevariabler kan overvåkes ved hjelp av ulike fluorescerende indikatorer. Disse inkluderer cytosolic [Ca 2+], intra-sarkoplasmatisk retikulum [Ca 2+] og membranpotensialer. De eksogene fluorescerende prober er spent og utsendt fluorescens påvises med tre forskjellige arrangementer av LFFM epifluorescence teknikks presentert i denne artikkelen. De sentrale forskjellene mellom disse teknikkene er av type lyskilde som brukes for eksitasjon og på vei eksitasjon lys moduleres. Den pulserende LFFM (PLFFM) bruker laser lyspulser mens kontinuerlig bølge LFFM (CLFFM) bruker kontinuerlig laserlys for eksitasjon. Endelig Lysdioder (LED) ble brukt som en tredje lyskilde. Denne ikke-koherent ordningen kalles pulset LED fluorescens mikroskopi (PLEDFM).
Introduction
Hjertet er det sentrale organet i det kardiovaskulære systemet. Hjertets sammentrekning blir initiert ved en økning i intracellulær [Ca2 +]. Forholdet mellom elektrisk oppstemthet og endringer i intracellulær Ca 2+ utgivelsen har vært historisk studert i enzymatisk dissosierte celler 1, 2. Imidlertid, hjerteceller er elektrisk, metabolisk og mekanisk forbundet tre, fire. Når isolert, myocytes er ikke bare fysisk frakoplet, men myocytter fra forskjellige lag blandes i løpet av 5 dissosiasjon. Videre, til tross for de enorme fordelene som har dukket opp fra studiet av isolerte celler under spenning klemme forhold, 6, 7, 8 den iboende natur av hjertet som en elektrisk syncytium Always stiller spørsmålet om hvordan funksjonelt forskjellige dissosiert celler fra de som er tilstede i vevet tre.
I dette manuskriptet, beskriver vi fremskritt oppnådd i kunnskapen om hjertefysiologi ved bruk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) teknikker i intakt hjerte. LFFM bruker fluorescerende indikatorer for å måle flere fysiologiske variabler som cytosolic Ca 2+, intra sarcoplasmic retikulum (ER) Ca 2+ og membranpotensialet. Disse målingene kan fås samtidig og i forbindelse med ventrikkel press 9, 10, elektro 9, elektriske aksjonspotensialer (APS), ioniske dagens opptak og flash fotolyse av bur forbindelser 4, 11. I tillegg kan disse målingene oppnås ved pacing det intakte hjertet ved høyere frekvenser nærr til fysiologiske priser. Selv om flere artikler 9, 11, 12, 13, 14 har blitt publisert av vår gruppe ved hjelp LFFM teknikker, har den antagelse av tekniske kompleksiteten knyttet til denne teknikken hindret sin massive bruk i å studere ex vivo fysiologiske fenomener i hjertet og andre organer.
Den LFFM teknikk (figur 1) er basert på epifluorescens målinger oppnådd ved bruk av et multimodus optisk fiber er i kontakt med vevet. Som enhver kontakt fluorescens avbildningsteknikk avhenger den optiske oppløsning av diameteren og den numeriske apertur (NA) av fiberen. En høyere NA og mindre diameter av fiberen vil øke den romlige oppløsningen av målingene. NAS og fiberdiametere kan ligge i området 0,22 til 0,66 og fra 50 um til 1 mm, henholdsvis. Iskarpe bretter på NA vil forbedre signal-til-støy-forholdet (S / N) ved å ta imot fotoner som kommer fra en større romvinkel. For å virke som en epifluorescens-enhet, blir lysstrålen fokuseres til den optiske fiberen med en asfærisk linse eller et epifluorescens objektiv der NA av linsen og fiber match. Dette passer maksimerer energioverføringen for eksitasjon og for oppsamling tilbake fotonene som utsendes av fluoroforen.
For å opphisse eksogene fluorescerende indikatorer som er lagt i vevet, kan forskjellige lyskilder og belysningsmoduser utnyttes. Våre banebrytende studier med puls lokale feltet fluorescens mikros 3, 12 (PLFFM) ansatt en lav-kost picosecond laser (Figur 1a, PLFFM). Denne type lyskilde har den store fordelen av spennende en stor del av fluoroformolekyler under belysning område uten vesentlig bleking fargestoff grunnav den korte pulsvarigheter 12. I tillegg er bruken av Ultra pulser tillot evaluering av fluorescens levetid av fargestoffet 12. Fluorescens levetid er en egenskap som kan brukes til å kvantifisere brøkdel av fargestoffmolekyler bundet til Ca 2+. Dessverre har den temporale jittering av pulsene og variasjoner i amplitude fra puls-til-puls begrense anvendelsen av denne eksperimentelle strategien til tilfeller hvor endringen i fluorescens som produseres av ligand binding til fargestoffet er stor.
Kontinuerlig bølge (CW) lasere er vanligvis brukt som den viktigste belysning kilde i LFFM (Figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerlig belyse vev eller kan ferroelectrically modulert. Den ferroelektriske modulering av strålen tillater generering av mikrosekunders pulser av lys. Denne modulasjon kan styres av ytre maskinvare. Denne prosedyren reduserer ikke bare dramatisk than temp jittering av lyspulser men tillater også blande bjelker av forskjellige bølgelengder. Blandingen av bjelkene gjøres ved multipleksing av stråler fra forskjellige lasere. Som en konsekvens, kan flere fargestoffer som har forskjellige spektrale egenskaper eksiteres for å utføre målinger av en rekke fysiologiske variable, for eksempel, Rhod-2 for cytosolisk Ca2 +, MagFluo4 for intra-SR Ca 2+ og di-8-ANEPPS for membranpotensialet.
Selv lasere presentere ulike fordeler som lyskilde i LFFM, kan andre typer lyskilder brukes blant annet lysdioder (LED). I dette tilfellet er det eksitasjonslyskilde besto av en InGaN LED (figur 1c, PLEDFM). I lysdioder, er fotoner spontant avgis når elektroner fra ledningsbåndet rekombinerer med hull i valensbåndet. Forskjellen med halvlederlasere er at utslipp ikke er stimulert av andre fotoner. Dette resulterer i en ikke-sammenhengende stråle oget bredere spektral utslipp for lysdioder.
Ulike typer kraftige LED kan brukes. For AP opptak med Di-8-ANEPPS og for Ca 2 + transienter innspilt med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, vi brukte en LED som har en typisk topp emisjon ved 485 nm (blå) og en halv bredde på 20 nm (Figur 1d). For Ca 2+ transienter tatt opp med Rhod-2, lampen hadde en typisk maksimal emisjon ved 540 nm (grønn) og en halv bredde på 35 nm (figur 1d). LED avgir i et band bølgelengde og krever derfor filtrene til å begrense sin spektral utslipp. I tillegg kan pulset lys bli generert ved en hastighet på 1,6 kHz med en varighet på 20 us. Lysdiodene ble pulset med en rask strøm MOSFET felteffekttransistor. Samtidige innspillinger med ulike indikatorer kan utføres av tids multipleksing lysdiodene. Dessverre, er lyset som emitteres ved hjelp av LED mer vanskelig å fokusere på en fiberoptisk sammenlignet med en laserstråle. Dermed største ulempen med ossing LED er at utslippsprofiler har vinkelbevegelser (± 15 °) fra hovedaksen, og en ekstra optisk må brukes for å rette det opp.
I alle de optiske utforminger som tidligere er beskrevet, er eksitasjonslys som reflekteres ved hjelp av et dikroisk speil. Bjelken blir deretter fokuseres ved hjelp av en asfærisk linse og et mikroskopobjektiv til en flermodusfiberoptisk som er plassert på vevet. Som i enhver epifluorescens arrangement, det dikroiske speil tjener også til å skille magnetiseringen fra det utsendte lys. Det emitterte lys-spekteret reiser tilbake gjennom en barriere filter for å fjerne eventuelle gjenspeiles eksitasjon. Til slutt blir den utsendte lys fokusert med et objektiv på en fotodetektor (figur 1).
Transduksjon fra lys til elektrisk strøm er utført av silisium skredfotodioder. Disse diodene har en rask respons og høy følsomhet slik at lite lys gjenkjenning. Defotostrøm som produseres av skredfotodioder kan forsterkes på to måter: en transimpedansforsterker som har et motstandselement tilbakemelding (figur 1E), eller ved hjelp av en integrator for å omdanne strømmen til en spenning (figur 1f). Ved hjelp av den første fremgangsmåten, er utgangsspenningen proporsjonal med photo og tilbakekoplingsmotstanden. Et typisk eksempel på det resistive påvisning av picosecond laserpulser er vist i figurene 2a, 2b og 2c. Panel 2a illustrerer utgangen fra transimpedansforsterker og panel 2b viser en tid utvidelse av intervallet merket med en stjerne (*). En topp sporingsalgoritme ble gjennomført for å detektere topp (rød) og basen (grønn) for de fluorescerende responser 12. Målingen av basen fluorescensen gir informasjon om både den mørkestrøm av skredfotodiode og interferenser innført ved omgivelses light og elektromagnetisk kobling. En representasjon av topper og baser er vist i figur 2c. Denne figuren illustrerer fluorescensen avgitt av det fargestoff (Rhod-2) bundet til Ca 2+ i løpet av hjertesyklusen av et bankende hjerte undulat.
I den andre fremgangsmåten, er utgangsspenningen fra integratoren en funksjon av strømmen og kapasitive tilbake (figurene 2d, 2e og 2f). Figur 2f viser to påfølgende integrasjons sykluser: den første uten ekstern belysning og andre med anvendt lyspulser fra en pulserende LED. En detaljert beskrivelse er gitt i figurene 2g og 2h. Denne fremgangsmåten, selv om mer arbeidskrevende og gir en større S / N på grunn av fravær av termisk støy i tilbakekoblings kondensator. Instrumentet har en timing scene som genererer all kontroll og multipleksing av eksitasjon lys og kommanderer heads integrering og resET perioder. Dette blir vanligvis utført med en digital signalbehandlingskrets som også utfører en digital differensiering av den integrerte utgangssignal ved å beregne en on-line regresjon av dataene. I tilfelle av anvendelse av en resistiv tilbake, kan en hvilken som helst A / D-anskaffelse brett anvendes.
Endelig er vår LFFM teknikk svært allsidig og kan tilpasses til å ta opp fra mer enn én region. Tilsetning av en stråledeler i lysbanen gjør det mulig for oss å splitte lyset i to optiske fibre. Hver optisk fiber kan deretter plasseres på forskjellige regioner i et vev til, uavhengig av hverandre, eksitere og ta opp emisjon fra eksogene fluorescerende prober. Denne endringen tillater oss å vurdere hvordan anatomiske regionale forskjeller påvirke fysiologiske variabler. Figur 3 viser en strålesplitter som anvendes for å splitte CW eksitasjonslyset slik at to optiske fibre anvendes for å måle transmural elektrisk eller intracellulær [Ca2 +] nivåer vetth moll-invasivitet. Transmuralt signaler kan tas opp ved å plassere en fiber på endocardium og den andre på epikardet laget av ventrikkel veggen. Derfor har LFFM teknikk evnen til å måle tidsforløpet av cellulære signaler i forskjellige regioner, og kan brukes for å teste om regionale endringer skje under patologiske situasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen og alle mus håndtering ble godkjent av UC Merced Institutional Animal Care og bruk Committee (No. 2008-201). Eksperimenter med parakitter ble gjennomført i 1999 i henhold til generelle retningslinjer for bruk av dyr etablert av den vitenskapelige provisjon av den venezuelanske Institute for Scientific Research (Ivic).
1. Langendorff Set Up Forberedelse
- Fremstille Tyrode-oppløsning inneholdende følgende oppløste konsentrasjoner i mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na2 HPO 4, 10 glukose, 10 HEPES. Juster pH-verdien i Tyrode-oppløsning til 7,4 med NaOH og filtrer løsningen gjennom et 0,22 um filter.
- Installering av Tyrode-løsningen i 60 ml sprøyter og alle slangene i horisontale Langendorff set-up 11, 12 illustrert i figur 4. Sørg for å fjerne alle luftbobler.
- Koble plastrør til en O 2 tank.
- Legg til en plastisk Tee adapter for å senke en 5 "rør inn i Tyrode-oppløsning i 60 ml sprøyte.
- Feste en plastikk luft stein til enden av den 5 "røret slik O 2 vil boble ut i Tyrode-oppløsning.
- Plasser en ikke-absorberbar kirurgisk sutur rundt en nål brukes som en kanyle. Nålen er koplet til manifolden (se figur 4) som gjør det mulig retro-perfusjon med ulike løsninger. Til slutt vil hjertets aorta bli kannulert inn i nålen.
2. Animal Forberedelse og Hjerte Dissection
- Vei og injisere mus med heparin (ex. Mouse vekt 20 g, injisere med 20 enheter eller 200 mL) 15 min før euthanizing ved halshugging. Anesthetize parakitter henhold to bruke dyr bøkene til IACUC protokollen og deretter fortsette med halshugging.
MERK: Bruk 8 uker gamle mus eller 20 g parakitter. - Ta hjertet fra brysthulen etter euthanization. Pakk parakeet hjerter på nøyaktig samme måte som beskrevet for mus.
- Rengjør muse brystet med etanol.
- Ved hjelp av disseksjon saks, lage et snitt i nedre del av magen og deretter skjære opp sidene mot halsen.
- Trekk tilbake kuttet vev og pin det ned.
- Skjær membranen. Vær forsiktig når du skjærer membranen for å unngå skade på hjertet.
- Fjern lungene og omkringliggende vev.
- Bruk pinsett til å øse hjertet uten å klemme den. Skjær aorta så lenge som mulig.
- Transporter hjertet på en liten veie båt med ca 1 ml Tyrode løsning.
- Ved hjelp av en ikke-absorberbare kirurgiske sutur, knytte aorta på den horisontale Langendorff apparat via ennål. Bind hjertet aorta ved hjelp av to fine pinsett. Begynne retro-perfusjon ved å åpne ventilen ligger i serie med 60 ml sprøyter inneholdende Tyrode-oppløsning.
- Tillat hjertet til å stabilisere seg i 10 minutter. Bruk denne tiden til å rense blodet og fettvev rundt hjertet før du legger i fargebad. Trekk fettvev nær bunnen av hjertet med pinsett og kuttet ved hjelp av små disseksjon saks. Sørg for å gjøre dette under visningen av en dissekere mikroskop.
3. cytosoliske Ca 2+ Mål: Forberede Dye Rhod-2 AM
- Tilsett 20 mL av 20% Pluronic (et ikke-ionisk overflateaktivt middel) i DMSO til en spesiell pakket plastampulle levert av produsenten fargestoff inneholdende 50 ug av fargestoffet.
- Bland ved å pipettere opp og ned, unngå bobler.
- Overfør den blandede DMSO med ikke-ionisk overflateaktivt middel og fargestoffet fra den spesielle pakket plastampulle inn i et klart hetteglass. Tilsett 1 ml Tyrode Solusjon til den klart hetteglass.
- Sonicate for 15-20 minutter i et bad ultralyd.
- Perfuse fargestoffet ved hjelp av peristaltiske pumper i 30 minutter ved romtemperatur.
- Plasser fargestoff i fargebad kammeret.
- Bruk av en mekanisk klemme for å komprimere alle de andre rør linjene som er koblet til manifolden. Klemmen er plassert over manifolden. Dette vil hindre enhver tilbakestrømning inn i produksjonsrøret som er koblet til 60 ml sprøyter.
- Slå på perfusjon peristaltiske pumpen til å begynne å sirkulere fargestoff. Umiddelbart lukker tre-veisventilen under 60 ml sprøyte.
- Plasser en liten slange som er koblet til suge peristaltiske pumpe ved siden av hjertet for å resirkulere det fargestoff som er perfusert inn i hjertet.
4. Intra-SR Ca 2 + Mål: Forberede Dye Mag-Fluo4AM
- Forbered Mag-Fluo4AM på samme måte som Rhod-2 AM. Se kapittel 3 for trinnvise instruksjoner.
- after lasting fargestoff, åpne ventilen plassert i serie med 60 ml sprøytene inneholder Tyrode løsning for å starte retro-perfusjon. Sørg for å fjerne klemmen over manifolden.
- Legg Tyrode-løsning til horisontalkammeret og varm opp til 37 ° C.
- Retro-perfuse med Tyrode løsning i 45 min for å fjerne cytosolic fargestoff.
5. membranpotensialet Mål: Forberede Dye Di-8-ANEPPS
- Tilsett 5 ml av 99% etanol for å fargestoffet ampulle som inneholder 5 mg av fargestoffet.
- Delmengde 10 mL til 500 enkelt 1 ml plasthetteglass med en repeater pipette.
- Desiccate i en hastighet vakuum og oppbevares ved -20 ° C.
- Tilsett 20 mL av 20% Pluronic i DMSO til en plastampulle med 10 ug av de uttørkede fargestoff.
- Bland ved å pipettere opp og ned, unngå bobler.
- Overfør blandingen inneholdende DMSO med Pluronic og fargestoff fra plasthetteglasset til en målesylinder (10 ml). Legg Tyrode-oppløsning til en endelig volume på 5 ml.
- Sonicate for 20-25 min i et bad ultralyd.
- Perfuse inn i hjertet i 30 minutter ved hjelp av peristaltiske pumper. Se i trinnvise instruksjoner i punkt 3.5.
6. Opptak epikardiell Signaler
- Etter lasting fargestoff, retro-perfuse hjertet med Tyrode løsning ved å fjerne klemmen over manifolden. Åpne ventilen ligger i serie med 60 ml sprøyte inneholdende Tyrode-oppløsning. Retro-perfuse Tyrode-oppløsning i 10 minutter for å stabilisere hjerte.
- Fylle den horisontale kammer med Tyrode-oppløsning og slå på Peltier-enhet for å bringe badtemperaturen til 37 ° C.
- Plasser den fiberoptiske på overflaten av hjertet.
- Plasser den fiberoptiske inne i en 2 ml pipette og deretter legge pipetten til en micromanipulator.
- Bruk mikromanipluatoren til svakt trykk på den fiberoptiske mot overflaten av LV.
- Eksternt tempoet heart med en stimulator styrt av en bølgegenerator.
- Programmere bølgegeneratoren for å tilveiebringe en firkantpuls med en bredde på 1 millisekund.
- Sett stimulator å bli eksternt synkronisert og koble den eksterne inngangen til bølgegenerator.
- Til hver utgang av stimulator, koble en ledning med en akupunkturnål loddet på slutten.
- Plasser begge akupunkturnåler i toppen av hjertet ca 3 mm fra hverandre.
- Først etter at nålene er plassert i vevet, slå på utgangen av stimulator for å unngå elektrisk sjokk.
- I oppkjøpet programvare, justere oppkjøpet frekvens til 10 kHz.
7. Opptak endokardial Signaler
- Se trinn 6.1 og 6.2 for å stabilisere hjertet etter lasting fargestoff.
- Ved hjelp av en skarp 23Ga punkt omtrent på størrelse med den fiberoptiske, lage et lite hull i overflaten av hjertet i LV nær skilleveggen. <li> Plasser en intravitreal kirurgi sclerotomy adapter for å hjelpe til å posisjonere den første fiberoptiske inn endocardium ved hjelp av en micromanipulator.
- Eksternt tempoet hjertet. Se trinn 6.4.
- I oppkjøpet programvare, justere oppkjøpet frekvens til 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AP og Ca 2+ transienter i endocardium og epikardet
For å sammenligne signaler over den ventrikulære veggen, er en fiberoptisk plassert i endocardium og den andre i epikardet. Sammenligning morfologien til en AP registreres fra endocardium med en fra epikardet er den beste måte å vurdere transmuralt funksjon. Ventrikkel veggen er svært heterogen og dermed morfologi av APs er svært forskjellige i disse to regionene. Det er velkjent at endocardium har mindre jeg enn epikardet 17, 18, 19. Jo mindre jeg gjør repolarisering av fase en tregere i endocardium 18, 20. Figur 5b sh¬ ger en typisk optisk opptak av AP fra endokardet og epikardet. For å utføre disse opptak, ble muse hjerter lastet med potensiometrisk fargestoff di-8-ANEPPs og fluorescens ble målt ved bruk av CLFFM teknikk. Morfologi av optisk registrert AP, særlig i fase 1, viser en tregere tid kurs for endocardium (aksjonspotensialer (APD) 30 er 8.01 ms ± 2,5) i forhold til epikardet (3,4 ms ± 0,59) (figur 5b). Generelt kan APD beskrives som den tiden det tar AP til repolarize en viss prosentandel, inkludert 30, 70 eller 90 (figur 5a). Disse sporene er normalisert og skiftet for å ha overlappende fase 0. Ved sammenligning av APDs (figur 5c), ser vi at endocardium og epikardet er vesentlig forskjellig i fase 1. Selv om disse aksesspunkter er fluorescens-signalene, de kan kalibreres til en spesifikk membranpotensialet ved samtidig å måle AP med enskarp microelectrode fylt med 3 M KCl 13.
I tillegg til membranpotensialet, kan eksogene fluorescerende indikatorer brukes til å overvåke intracellulær [Ca2 +]. Vanligvis bruker vi Rhod-2AM å måle intracellulære Ca 2 + transienter på grunn av sin høye dynamisk område og dens evne til å holde seg i cytosol selv ved fysiologiske temperaturer. Figur 6b viser et typisk opptak av de intracellulære Ca 2 + transienter i endocardium og epikardet lag. Disse resultatene er delvis publisert 15. For å sammenligne regionale forskjeller i den intracellulære [Ca 2+] nivå, kinetikk av Ca 2 + transienter ble vurdert (figur 6a). Totalt sett er analysen av Ca 2 + forbigående kinetikk (Figur 6c) viser at Ca 2+ transienter fra endocardium hadde signifidelig lavere kinetikk enn de som er registrert fra epikardet.
Ca 2 + dynamikk i SR lumen
I hjertet, vekst og fall av intracellulær [Ca 2+] nivåer er avgjørende i å definere mange fysiologiske variabler inkludert trykk, kontraktilitet, og aksjonspotensial varighet (APD). Den forrige avsnitt beskrev vår evne til å måle de cytosoliske Ca 2 + transienter. Ca 2+ frigjøres fra SR er i stor grad ansvarlig for økningen i intracellulære cytosoliske Ca 2+. Således, for hver økning i den intracellulære Ca2 + er det en Ca2 + laget i SR. Men cytosoliske Ca 2 + transienter er ikke bare på grunn av SR Ca 2+ utgivelse, men inkluderer også Ca 2+ kommer inn i cellen gjennom plasmamembranen. vår lab16 har vært i stand til å evaluere SR Ca 2+ innhold ved bruk av en fluorescerende fargestoff, Mag-Fluo-4 AM. Selv om dette fargestoff er de-forestres i myoplasm og SR, kan myocytter ekstrudere ut den cytosoliske fraksjon. Dette fargestoff ekstrudering kan fremmes ved å øke temperaturen til 37 ° C. Ved denne temperaturen blir det cytosoliske fargestoff fjernet ved en ATP-bindende kassett som membranprotein. Heldigvis er dette protein ikke er tilstede i SR membranen. Derfor, etter økning av temperaturen til 37 ° C, fluorescens registreres ved hjelp av PLFFM teknikken er hovedsakelig et resultat av Ca 2+ binding til fargestoffet i SR. For å teste spesifisiteten av organeller måling, ble en koffein puls tilført stimulere Ca2 + frigivelse gjennom RyR. Det er mulig å observere at signalet er faktisk et resultat av SR uttømming (figur 7). Den koffein indusert SR Ca 2+ frigjøring (Figur 7a) Produsere både en reduksjon i diastolisk nivå av Mag-Fluo-4-fluorescens (92 ± 0,05% (n = 4, p = 0,012)) og en reduksjon i amplituden av Ca 2 + transienter (51 ± 0,21% (N = 4, P = 0,003)) 16. Intra SR traser registrert før og etter koffein stimulus er representert nedad i figur 7b-7d. Etter hvert som tiden skrider frem fra det koffein stimulus, amplituden av SR uttømming er mindre. Figur 7e viser at SR uttømming ikke bare induserer en reduksjon i amplituden av det Ca2 + signal, men også bremser ned SR Ca 2+ frigjøringsprosessen. Fluorescensen spor i figur 7a har tidligere blitt publisert 15.
Pulserende LED: Action potensialer
I figur 5 viste vi at Di-8-ANEPPS kan rapportere endringeri membranpotensialet når det er spent på 532 nm. Under denne magnetisering stand, er det en minskning av emittert fluorescens ved bølgelengder høyere enn 590 nm. Interessant, da dette potensiometrisk fargestoff er spent nær sin maksimale eksitasjonsbølgelengde (~ 476 nm), fluorescensemisjonen av fargestoff skift til lavere bølgelengder når membran depolariserer. Følgelig tillater denne spektral forskyvning oss å ta opp den emitterte fluorescens ved to forskjellige bølgelengder. Dette spektral egenskap av Di-8-ANEPPS tillater rasjonerings av den emitterte fluorescens registrert ved to forskjellige bølgelengder, en funksjon som vanligvis er av stor verdi fordi den endelige beregnede opptak vil være uavhengig av fargestoff konsentrasjonen i membranen. For å dra full nytte av Di-8-ANEPPS spektral skift, brukte vi pulserende LED som lyskilde. Vi brukte puls blått lys for å opphisse fluorophore. Eksitasjon ble utført ved 485 nm, nær toppen absorpsjonsbølgelengde på Di-8-ANEPPS (~ 476 nm). Oppkjøp i to forskjellige utslipps spektroskopiske band gjør forholdet formasjon og evnen til å øke S / N og avvise felles modus støy som miljø lys og bevegelsesartefakter i entreprenør hjerter hvor den mekaniske uncoupler Blebbistatin ikke har vært brukt. Denne situasjon er meget viktig for eksperimentelle betingelser der både den mekaniske aktiviteten i hjertet og kinetikken av Ca 2 + transienter må måles samtidig.
Tidsdiagrammet på den PLEDFM er illustrert i figur 8a. Diagrammet omfatter styrelogikken for integrering og tilbakestilling av fotopåvisnings heads, on-off tidspunktet for LED og analog-til-digital konvertering. I løpet av tidsforløpet av en AP, fluorescens detektert i det grønne bølgelengdebånd viser en økning i intensitet, mens fluorescensen detekteres i det røde båndet avtar. Figur 8b viserat endringen av den fluorescens-signalet frembringes av membranen depolarisering beveger seg i forskjellige retninger. Imidlertid er den bevegelsesartefakter frembringes av hjertet kontraksjon alltid orientert i samme retning, uavhengig av emisjonsbølgelengden. Som forklart tidligere, må data fra begge kanaler (grønn og rød) er programvarekondisjonerte før beregning av forholdet. Den conditioning inkluderer offset og få korreksjoner. Valg av utjevnings- og forsterkningsnivå korreksjoner er ikke automatisk. Brukeren av programvare har å velge variabler til tilstanden spor før forholdet. Den resulterende forholdet i panelet 8b (figur 8) viser at gjenstanden introdusert av hjerteinfarkt bevegelsen har kansellert.
Den relative forandring av di-8-ANEPPS fluorescens i løpet av en AP er vanligvis meget små (~ 8% per 100 mV). Dette di-8-ANEPPS fluorescens forandring er mye mindre enn den som frembringes av Ca 2+ binding til Rhod-2 (<200%). Således, for å øke signal til støyforhold av di-8-ANEPPS, flere opptak kan bli midlet.
Pulserende LED: Samtidige opptak av Ca 2+ og membranpotensialet
Det siste målet ved hjelp av denne eksperimentelle tilnærmingen består i å utføre samtidige opptak av Ca 2 + transienter og aksesspunkter. Samtidige opptak av flere fysiologiske signaler krever løse tekniske problemer relatert til forskjellige aspekter av systemet inkludert: kopling av lyskilden med den optiske fiber, som samsvarer med absorpsjonsspekteret av fargestoffet med utslipp av LED-enhetene, å utforme de analoge og digitale elektroniske krets for å generere timing og anskaffelse, så vel som utvikling av hurtig programvare for å analysere data på-linje.
i our studien, valg av fargestoffer avhengig av deres spektrale egenskaper. Flourophores brukes til å måle diverse signaler som skal absorbere i forskjellige spektralbånd. Denne tilstanden er viktig å skille mellom signalkildene. Hver gang en LED som har en forskjellig bølgelengde som blir brukt til å eksitere vev, fluorescens detektert tilsvarer det signal relatert med den farge som absorberer i den bølgelengde. På denne måten fluorescensemisjon som kommer fra forskjellige fargestoffer, men i det samme bølgelengdebånd, kan skilles ved det tidspunkt ved hvilket hver av dem er spent.
Ikke desto mindre, det krysstale mellom farve spektre kan ikke fullt ut unngått. Dette er fordi de spektrale absorpsjons-egenskapene til de fargestoffer som gjør dem absorbere lys med bølgelengder langt fra sin topp absorpsjon. I våre forsøk, ble crosstalk produsert i begge måter: (1) Rhod-2 blir opphisset av det blå LED, og legger en Ca 2+ signal til rød channel AP spor, og (2) Di-8-ANEPPS blir opphisset av den grønne LED, som vises på Ca 2+ transient signal (figur 9f). Denne krysstale kan rettes opp på linje, som vist på figur 9. Fremgangsmåten fungerer fordi den inntrengende signalet er en liten andel av det signal som skal måles. Til slutt, ved å bruke denne type algebraisk behandling av fluorecence fra de fargestoffer som mulig for oss å separere AP (figur 9d) dannelse av Ca 2 + transienter (figur 9h). En detaljert skisse av denne behandling er beskrevet i figuren forklaringen. Det er viktig å legge merke til at alle Pulsed LED-forsøk ble utført et 28 ° C.
Figur 1: Lokal Feltet Fluorescensmikroskopi (LFFM). Den LFFM består av en epifluorescence arrangementved hjelp av en multimodus optisk fiber som er i kontakt med vevet til å registrere fluorescens emittert fra eksogene fargestoffer perfuserte til hjertet. Den LFFM set-up kan bruke tre forskjellige lyskilder inkludert (a) PLFFM, hvor eksitasjon lys er levert av en pulset pico Nd-YAG laser; (B) CLFFM, hvor kontinuerlig bølge laser brukes og lyspulser blir generert av en ferroelektrisk modulator slik at multipleksingen av lasere med forskjellige bølgelengder; og (c) PLEDFM, hvor LED har bredere utslipps spektrum med topp utslipp av (d) 485 nm og 540 nm for blå og grønne lysdioder, henholdsvis elektronisk pulset. Ved bruk av laserkilder, blir strålen defokusert ved en stråleutvider. Til slutt, dikroiske speil og objektivlinser fokusere strålen på den fiberoptiske distale ende som er litt presset mot vevet. Det utsendte lyset reiser tilbake gjennom den samme fiberoptiske, dichroic speil, emission filtre, og er fokusert på en lavine-fotodiode hvor fotoner blir omformet til en elektrisk strøm. Strømmen kan forsterkes ved to metoder (e) transimpedansforsterker, hvor den resulterende utgangsspenning er proporsjonal med den fotostrøm og tilbakekoplingsmotstanden; (F) integrator, hvor utgangsspenningen er en funksjon av strømmen og kapasitive tilbakemelding. Til slutt blir det signal som resultat av en A / D-omformeren og de vises på en datamaskin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Resistive og kapasitiv Conversion. (A) Et typisk eksempel på den resistive påvisning av picosecond laserpulser er vist. Stjernen (b)viser et tidsintervall ekspandert, hvor en topp sporingsalgoritme ble gjennomført for å detektere topp (rød) og basen (grønn). (C) En representasjon av spor beregnet fra topper og baser opptakene er vist for Rhod-2 fluorescerende responser i et bankende undulat hjerte eksternt tempoet på 7 Hz og badetemperatur satt til 37 ° C. d til h) photo konvertert ved en integrator bruke en kapasitiv tilbakemeldinger. Typiske opptak av intakt mus hjerte Ca 2 + transienter er vist i to forskjellige tidsskalaer (d og e). (F) integrering av to på hverandre følgende sykluser med og uten LED belysning er vist. Integralet av signal øker lineært når photo lader kondensatoren tilbakemelding. Helningen av den tidsavhengige integral (tan (Ɵ)) er proporsjonal med antall fotoner som påvirker skred knutepunkt i tillegg til den elektron-hull rekombinasjon indusert av phononic aktivitet når skredet diode ikke oppdager noen fotoner. De digitale signalene kontrollere heads integrering og tilbakestille perioder er vist i panel g. Signaler som detekteres i løpet av den ikke-opplysende (DC) og LED belyse periode (F) er vist i panel timer. Subtraksjon av F og like gir den faktiske måling av fluorescens påvises Ca 2 + transienter fra muse hjerter eksternt pacing ved 9 Hz ved 37 ° C (h). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: LFFM for epikardet og endocardium Målinger. Den CLFFM oppsett ble anvendt for å måle fluorescensen avgitt fra eksogene fluorescerende fargestoffer som er tilstede i en epikardetd endocardium lag. Tilsetningen av en stråledeler til rette for opptak av ulike fysiologiske variable i epikard og endokardet. To fiberoptikk ble brukt med sine individuelle headstages å oppdage fra epikardet og endokardet. En liten rund snitt ble gjort i ventrikkelen og en fiberoptisk ble tredd gjennom å ta opp fra endokardet. Dette oppsettet benyttes en strøm-til-spenning-omformer med en resistiv tilbake. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Horisontal Chamber med temperaturkontroll. Et diagram som viser den Langendorff set-up hvor intakte hjerter opprettholdes funksjonelt i flere timer. Hjertet er knyttet til en nål gjennom hvilken alle løsninger og fargestofferer retro-perfusert inn i hjertet via coronaries forgrening av aorta. Kammeret er plassert over et Peltier-enhet for å opprettholde temperaturen av badet, som blir lest av en temperaturføler som er koblet til et voltmeter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: transmuralt aksjonspotensial Målinger i Intakte Hearts. (A) aksjonspotensialer (APD) er vurdert som den tiden det tar å fullføre 30%, 70%, eller 90% av AP repolarisering. (B) Di-8-ANEPPS fluorescens fra epikardet (sort) og endokard (grå) viser AP morfologiske forskjeller i repolarisering mellom de to lag av den ventrikulære veggen. (C) Etter å ha vurdert than APD 30, 70 og 90 i endocardium og epikardet, viste resultatene bare signifikante forskjeller ved APD 30 (8 ± 2,5 ms endocardium vs 3 ± 0,6 ms epikardet). Hjerter var tempoet på 6 Hz og temperaturen satt til 37 ° C. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 5 hjerter. * P <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: transmuralt Ca 2+ Forbigående Målinger i Intakte Hearts. (A) Parametere av Ca 2 + forbigående kinetikk målt er: hvor lang tid det tar å nå maksimum, tid til topp (TP); den tid det tar å gå fra 10% til 90% av veksten, stigetid (RT); den tid det tar å gå fra 10% til 90% av forråtnelse, desintegrasjonstids (DT); ogtiden det tar å fullføre 50% av den forbigående, halv varighet (HD). (B) Fluorescens slippes ut av Rhod 2 etter eksitasjon med en grønn CW lasershow epikardet (svart) og endocardium (grå) Ca 2 + transienter med forskjeller i avslapping. c) Ca 2 + transienter fra endocardium hadde signifikant lavere kinetikk i RT, TP, HD, og DT enn de som er registrert fra epikardet. Hjerter var tempoet på 6 Hz og temperaturen satt til 37 ° C. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 5 hjerter. * P <0,05. Modifisert fra Mattiazzi et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Intra SR Ca 2+ Målinger i Intakte Hearts.(A) Den emitterte fluorescens fra Mag-Fluo-4 fargestoff synker over tid, noe som reflekterer en reduksjon i den intra SR Ca 2+ konsentrasjon. (B) Den utvidede visningen av nedgangen i Mag-Fluo 4 fluorescens indikerer Ca 2+ tømming indusert av Ca 2+ utgivelse fra SR. (C) En utvidet visning av nedgangen i transient amplitude fra Mag-Fluo 4 fluorescens som representerer Ca 2+ utgivelsen endret av perfusert hjerter med 20 mM koffein. (D) Etter en lang anvendelse av koffein, en reduksjon i både det diastoliske nivået av Mag-Fluo-4 fluorescens og i amplituden av Ca 2 + transienter [ned til 92 ± 0,05% (n = 4, p = 0,012) og 51 ± 0,21% (N = 4, p = 0,003) av startverdier, henholdsvis], er observert. Ettersom mer tid utvikler seg fra det koffein, jo mindre er amplituden av SR uttømming. (E) Normalis spor i bd viser at SR uttømming ikke bare induseres avtar av Ca 2+ signal, men også bremser ned SR Ca 2+ fylling. Hjerter var tempoet på 4 Hz og temperaturen satt til 37 ° C. Fluorescens spor er fra Kornyeyev et al. 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Proporsjonal Målinger av APs i intakte hjerter med Pulserende LED. (A) Tidsdiagrammet inkludert integrasjon og tilbakestilling av heads, on-off tider av LED og en selve innspillingen er illustrert. (B) spor fra de to kanalene har ulike hvile verdier og forskyvningen er korrigert ved å bevege spakene til hver AP kommer etter en hvileverdi. Gevinst på hver kanal er også adjusted. Merk at en veldig stor bevegelsesartefakter vises på begge kanaler mellom de to depolarisering. Når programvaren behandler signalene ratiometrisk, er resultatet en AP uten merkbare gjenstander (blå). Hjerter var tempoet på 3 Hz og temperaturen satt til 28 ° C. Alle postene som vises er et gjennomsnitt på 10 spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Samtidige Ca 2 + transienter og AP Målinger i Intakte Hjerter med Pulserende LED. Den krysstale forurensning av signaler ved opptak både Ca 2+ og AP kan rettes opp på nett. Den Potensiometriske fargestoff, di-8-ANEPPS, er spent med 20 ms blå LED pulser (a). Signaler er split, filtrert med båndpass røde og grønne filtre. Disse signalene blir detektert ved to forskjellige skredfotodioder som er angitt i den røde (b) og grønne kanalen (c). Det er mulig å observere at begge signalene, rød og grønn, presentere en merkbar bevegelse gjenstand som vises som en nedbøyning. Begge signaler, rød og grønn, blir offseted og deretter forsterket. De behandlede signaler blir brukt til å beregne forholdet mellom dem, og resultatet er vist i d. Det er mulig å observere at i forholdet mellom begge signaler (d) de bevegelige gjenstander er kansellert. Panel e illustrerer den sekvens av logiske pulser som styrer en grønn emitterende LED anvendes for å eksitere Ca 2+ indikatoren Rhod-2. Fluorescerende signaler som oppnås ved hjelp av denne fremgangsmåten er vist i f. Selv om spor i f, for det meste viser en økning i fluorescens-signalet på grunn av Ca 2+ binding til Rhod-2, er det også mulig å observere en negativ avbøyning i sporet på grunn av en fluorescent detektert signal fra Di-8-ANEPPS når dette fargestoff er spent med grønt lys. Dette problemet kan løses ved å trekke potensiometrisk signal vist i g. Resultatet av den subtraksjon er vist i panel h hvor en Ca 2+ signalisere fri for en AP forurensning oppnås. Hjerter var tempoet på 3 Hz og temperaturen satt til 28 ° C. Alle postene som vises er et gjennomsnitt på 10 spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret er sentrert i beskriver lokale felt fluorescens teknikker for å evaluere funksjonen av hjertemuskelceller ex vivo. Studiet av disse cellene i en koplet miljø er ikke bare mer fysiologiske, men er også svært egnet for vurdering av organ-nivå patologier. De cellulære hendelser som ligger til grunn eksitasjons-kontraksjon kobling (ECC) kan evalueres ved hele organet nivå med bruk av molekylære prober som overvåker intracellulære Ca2 + dynamikk (Rhod 2 cytosolisk Ca2 +, Mag-Fluo4 SR Ca 2 +) og elektrisk aktivitet (di-8-ANEPPs). Her har vi presentert tre LFFM epifluorescence teknikker som både begeistre og samle utslippet fra fluorescerende indikatorer ved hjelp av optiske fibre. De variere basert på lyskilden brukes og type lys modulasjon. Den PLFFM bruker en laser som pulser lys, bruker CLFFM kontinuerlig laserlys, mens LEDFM bruker lysdioder som også kan pulsert i PLEDFM. Alle disseer presentert i figur 1 som et sett, men kan konstrueres med kun en av de tre epifluorescens ordninger. I tillegg kan det detekterte lyset bli behandlet på forskjellige måter. For eksempel, figur 2 viser to forskjellige situasjoner hvor det fotostrøm kan være enten integrert eller direkte omdannes til en spenning ved hjelp av en strøm-til-spenning omformer. Generelt kan det LFFM tilnærming brukes til å samtidig måle multiple anatomiske områder, som vist på figur 3.
Fremgangsmåten presentert her for å vurdere hjerte egenskaper ved det intakte organ nivå er mer tilfredsstillende å studere problemer i hvilken koplingen mellom cellene er avgjørende i å definere oppførselen til vev. Den iboende heterogenitet i hjertet kan produsere forskjellig AP bølgeformer 13, 21, 22 basert på det spesifikke vev fra hvilken cells stammer. Derfor er hele organ studier gir mulighet til å vurdere den lokale fysiologiske funksjon av cellen i forskjellige anatomiske strukturer. Videre har vi sett at intracellulære hendelser som gnister og bølger har ulike kinetikk i dissosierte celler enn i intakt organ 15.
Langendorff set-up (figur 4) er kritisk for å opprettholde hjertet i en situasjon som er nærmere in vivo. I tillegg gir den retroperfusion av flere legemidler og forskjellige fluorescerende molekylære prober som tillater måling av flere fysiologiske variable. Endring av eksogene fluorescerende prober blir brukt, øker størrelsen på den fiberoptiske, eller velge en annen lyskilde kan dramatisk endre anvendelse av teknikken. I tillegg kan Peltier enhet under den horisontale kammeret lette studiet av Ca 2+ dynamikk ved forskjellige temperaturer. Legge tilbehørtil LFFM slik som en stråledeler kan øke antallet av fiberoptikk som benyttes til å ta opp fra forskjellige regioner i det intakte hjertet. Dette er en svært nyttig tilpasning å teste om regionale forskjeller oppstår i patologiske scenarier. Figur 3 viser endocardium og epikardet blir vurdert samtidig. Videre perfusert hjertet med forskjellige agonister tillater oss å forstå hvordan de ulike regioner over hele ventrikkel veggen er regulert. Den elektriske signal (figur 5) og Ca 2 + kinetisk (figur 6) heterogeniteter kan sammenlignes ved epikard og endokardet. I tillegg kan flere fargestoffer med forskjellige eksitasjonsbølgelengdene og emisjonsfiltre benyttes. For eksempel, ved hjelp av Mag-Fluo-4, 2 + Ca nivåer i lumen av SR kan bli registrert (Figur 7). Ved å variere størrelsen av den fiberoptiske kan også utvide kapasiteten av denne fremgangsmåte ved at det fluorescerende innspilling fra en larger regionen.
Dette dokumentet viser også at bortsett fra kostbare lasere, kan lysdioder brukes som en eksitasjonslyskilde i vår teknikk. Figur 8 viser at dette billig type lyskilde kan brukes til å ratiometrisk måle aksesspunkter. Den ratiometrisk måling er vist i figur 8 er fordelaktig i fremstilling av et endelig opptak uten eksperimentelle gjenstander inkludert de som er forårsaket av bevegelse. Endelig kan til og med Ca 2+ forbigående og AP bli optisk registrert, samtidig, ved multipleksing av forskjellige bølgelengder og ved å bruke fargestoffer med den samme emisjonsspektra. Behandlingen av signaler som skissert i figur 9 er kritisk for fjerning av indre forurensning produsert av overlappingen i emisjonsspektra av de fargestoffer. Opptak Ca 2 + transienter og aksesspunkter, samtidig, men som to uavhengige utgangssignaler er gunstig i å studere ECC og Ca 2+ -indusert Ca 2+
LFFM er en teknikk med flere programmer i mobilnettet fysiologi intakt vev. Imidlertid er en vesentlig begrensning at den innspilte fluorescens er et gjennomsnitt av utslippet fra den underliggende fluorescente indikatorene i det lokale område hvor den optiske fiberen er i kontakt med vevet. Selv ved bruk av to optiske fibre, ikke LFFM ikke tilveiebringe en subcellulære romlig fordeling av de målte signalene. Optisk kartlegging er en bedre teknikk for å overvåke fysiologiske variabler som endres i tid og rom som utbredelsen av AP, Ca 2 + transienter, og alternans 23, 24, 25. LFFM er også i stand til å gi avbildning av strukturer, som konfokal mikroskopi og andre optiske kartlegging teknikker. Likevel er bruken av fiberoptikk som gjør det praktisk i recording lokale fluorescens-signaler fra endocardium eller andre områder som er vanskelig eller umulig å få tilgang i et intakt hjerte med et konfokalt mikroskop.
Sammenligningen mellom fysiologiske variabler hentet fra intakte hjerter og fra isolerte myocyte eksperimenter er utfordrende. Den største fordelen med å bruke isolerte hjertemuskelceller er en unik mulighet til å evaluere biofysiske egenskapene til cellene under patch clamp forhold. I motsetning til dette tillater LFFM studiet av fysiologiske og patologiske fenomen i en mer naturlig miljø. For eksempel, i intakte hjerter kan vi vurdere transmurale forskjeller 15, hjertefrekvens avhengighet av AP og Ca 2+ på fysiologiske spenner 13 som er uoppnåelig i isolerte celler. I tillegg kan man studere virkningene av en ischemisk skade på funksjonen av det intakte hjertet 9, 10. Hele hjertet experiments også tillate oss å vurdere samspillet mellom andre celletyper og muskelceller 11.
LFFM tillater visualisering av cellulære signaler ved det intakte hjertet nivå hvor cellene har fysiologisk kopling. LFFM tillater studiet av intracellulære aktivitet mens cellene fremdeles er i det intakte organ. I kombinasjon med fluorescerende fargestoffer og epiluminescence kan LFFM overvåke to viktige hjerte egenskaper: Ca 2+ dynamikk og elektriske aktivitet.
Endelig kan fremgangsmåten som presenteres her har flere anvendelser i studiet av ECC. Det er et verktøy som avslører hvordan supra signaler påvirkes i patologiske situasjoner som arytmier 16 og iskemi 9, 15. Denne teknikken er et must å studere disse patologi siden de bare kan forstås på intakt organ nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Alicia Mattiazzi for kritisk diskusjon av de presenterte arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (R01 HL-084487) til ALE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2 μm nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20x13 | |
| 60 mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567 nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6" x 6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4' x 6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J.
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R.
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
