Summary
Этот протокол является экономически эффективной альтернативой для экспрессии голой плазмидной ДНК в коже мыши. Общая цель протокола заключается в предоставлении иммунных связанных генов в ткань кожи, чтобы очертить функциональную роль специфического гена в кожных воспалениях.
Abstract
Дисрегуляция иммунного ответа в коже связано с многочисленными нарушениями кожи человека. Прямая передача связанных с иммунитетом генов в ткань кожи является захватывающим подходом для исследования иммунной модуляции кожного воспаления в мышиных моделях заболеваний человека. Здесь мы представляем собой экономически эффективный протокол, который поставляется голую ДНК в коже мышей и приводит к трансгенной экспрессии. Метод придуман «acufection», обозначающий ACU прокол-опосредованной ДНК транс fection. Чтобы выполнить acufection, кожи мыши была впервые переплетаются с ДНК в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), а затем слегка кололи с пачкой акупунктурных игл, чтобы облегчить поглощение ДНК и трансфекции в клетки. Плазмидная ДНК предположительно рассмотрена кератиноцитами и дендритные клетки (ДК) в коже и выражается в белка. Механический укол с иглой самих по себе не вызывает повреждение кожи или вызвать активацию кератиноцитов. Выражениетрансфицированных генов был обнаружен в коже на обоих транскрипции и трансляции уровней ниже acufection в течение 2 дней и сохраняется до 7 дней. Основная целью разработки этого метода acufection была исследовать ранее неопределенные изоформы IL-15. С помощью этого метода, альтернативно сплайсинга IL-15 изоформ с частично удаленной экзон 7 (IL-15ΔE7) было выражено в коже и затем обрабатывали с Toll-подобный рецептор 7 (TLR7) агониста, Имиквимод (IMQ), чтобы вызвать воспаление. Acufection доставляемых ИЛ-15ΔE7 в коже подавляется кератиноцитов пролиферацию, толщину эпидермиса и набора нейтрофилов в IMQ-индуцированного кожного воспаления. С ростом интереса к идентификации регуляторных механизмов кожного воспаления, протокол , описанный здесь , обеспечивает экономически эффективную и универсальную альтернативу артсистемой гена или microseeding для доставки ДНК в естественных условиях. Это потенциально может позволить открытие функции романагена в коже или для исследования нового лечения кожных заболеваний.
Introduction
Кожа является первой линией защиты организма. Кератиноциты (КИС) являются основным типом клеток в коже человека и мышей. В ответ на раздражители окружающей среды (например , солнечного света, кислорода, химических веществ и патогенные вторжения), KCS активируются и производить широкий спектр провоспалительных цитокинов и хемокинов , таких как IL-8, IL-6, IL-1 & alpha ; , IL-1, TNF- α и GM-CSF , 1. Вместе они вызывают набор иммунных клеток к коже. Усугубляется кожное воспаление часто связано с многочисленными человеческими заболеваний , включая острый внематочной контактный дерматит и хронический Т клеточного воспаления (например , аллергический контактный дерматит и псориаз) 2. Плавное провоспалительные реакции в коже путем ингибирования активации KC является правдоподобным подход для лечения кожного воспаления. Этот протокол описывает новый подход к транзиторна экспрессии гена цитокина в эпидермисе с целью изучения иммунного РезаПонс косвенного такой обработки в коже.
Эпидермис сочиняет наиболее поверхностный слой кожи. Он служит в качестве физического барьера, сохраняя внешние вещества, такие как нуклеиновые кислоты и патогенов от входа в более глубокие слои кожи. Несколько безыгольных методы были созданы для передачи эпидермального ДНК 3, 4. ДНК в растворе или связанный с катионными липосомами или аденовирусными векторами были непосредственно применены к эпидермису, модифицированный методы, таким как удаление рогового слоя или обработка эпиляции реагента. Удаление рогового эпителия способствует ДНК пересечения эпидермальный барьер и взаимодействие с кератиноциты и клетки Лангерганса , чтобы вызвать иммунный ответ 5. В то время как большая площадь поверхности для переноса ДНК, и этот подход не включает в себя иглу, есть недостатки, включая требованиедля больших количеств ДНК (10 - 100 мкг), грубого обращения на кожу путем отгонки, и противоречивые результаты в индукции иммунного ответа у иммунизированных животных без доставки ДНК усилител 6. Микрочастицы опосредованных внутриклеточная доставка голой ДНК к коже была показана, высокой эффективность и воспроизводимость для индукции иммунного ответа 7, 8. Ручная генная пушка была использована для бомбардировки целевого участка кожи с плазмидной ДНК , покрытые частицами золота 2 мкм диаметра по размеру с помощью гелия под давлением воздуха потока 9. Плазмидная ДНК предположительно поглощается KCsand дендритных клеток (ДК) в коже и белки локально выраженная или транспортируются в дренирующие лимфатических узлы с помощью ДК 10. Хотя система генной пушки проста и требует ограниченного технического опыта, расходы на подготовку и доставку "ДНК булпусть "(т.е. золотых порошков, газообразный гелий) и для генной пушки сами ограничивают его общее применение. Кроме того, потребность в систему доставки газообразного гелия ограничивает легкость генной пушки транспорта , когда эксперименты проводятся в разных местах. Microseeding было показано , что достичь более высокой эффективности переноса генов , чем одной инъекции и бомбардировок частиц 11. Microseeding использует татуировку пистолет для доставки ДНК на кожу без использования шариков частиц 11. Качающийся микроигло на коже , используя этот подход, скорее всего, непосредственно скрести клеточную мембрану и, таким образом, перенос ДНК в нескольких ячеек одновременно. тем не менее, боль, связанная с большим количеством инъекций с иглами мм диаметра 0.254 является недостатком.
Здесь мы предлагаем альтернативный подход к доставке ДНК в естественных условиях. «Acufection» 12. В то время как acufection оказывается простым и менее Демаметод nding для доставки ДНК в естественных условиях, оптимальное количество ДНК для различных генов и времени , чтобы проколоть кожу должно быть тщательно оптимизировано , чтобы получить воспроизводимые результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Самок мышей на 8 - 12 недель возраста были использованы для этого исследования. C57 / НД6 дикого типа (WT) и IL-15 дефицитных (IL15 - / -) мышей были приобретены в Национальной лаборатории Центра животных (NLAC), Тайвань и Taconic Farm, соответственно. ИЛ-15-дефицитных (IL15 - / -) и ИЛ-15-доминантной (IL15 +/- и IL15 + / +) показал соотношение 1: 3 во втором поколении от скрещивания IL15 +/- гетерозигот. Генотип IL15 - / - мышей была подтверждена анализом ПЦР. Мыши выдерживались в специфический патоген (SPF) объекта в лаборатории Центра животных (ЛАК), Национальный университет Тайваня (NTU) Колледж медицины. Все процедуры на животных, включая анестезирующие материалы и методы были выполнены в соответствии с протоколом животных утвержденного Национального тайваньского университета Медицинского колледжем и колледжем здравоохранения институциональной помощи общественных и использование животных комитета (IACUC) (АФФИДЕВИТ одобрения Протокола животных 20130225).
<р класс = "jove_title"> 1. Получение акупунктурных иглПримечание: акупунктурные иглы медицинские приборы , состоящие из рукоятки и конец иглы (фиг.1А). Диаметры акупунктурной иглы варьировались от 0,2 мм (36 G) до 0,35 мм (28 G). Мы выбираем лучшие точки иглы, чтобы избежать возможного чрезмерного повреждения клеток во время прокалывания кожи. Есть 4 различных длин 0,2-мм иглу в том числе 13 мм (0,5 дюйма), 25 мм (1,0 дюйма), 40 мм (1,5 дюйма) до 50 мм (2,0 дюйма) в длину. Пучок из 10 игл с длиной 13 мм при условии, что лучше удобный захват во осциллирующих иглу на C57BL / 6 мыши кожи. Параметры могут быть изменены, если метод применяется к коже крупных животных или выполнены исследователями с большими руками.
- Удалить акупунктурные иглы из стерильного апирогенно пакета. Поместите иглы на стерильной драпировки.
- Используйте клейкую ленту маркировки, чтобы связать 10 иглы вместе Какна расслоение (Фигура 1В).
Примечание: 10 игл геометрически расположены, чтобы сформировать форму цилиндра. Для удобства использования куска парафиновой пленки, чтобы стабилизировать устройство перед нанесением клейкой ленты. Убедитесь, что все точки иглы находятся на одной и той же плоскости. Используя связку вместо одной иглы облегчает максимальную инфузию ДНК путем увеличения площади контакта между иглами и кожей.
2. Получение большого количества эндотоксина и свободный плазмидная ДНК
- Преобразование химически компетентных бактериальных клеток с плазмидной ДНК.
- Выбор и инокуляции одну бактериальную колонию в 3 мл LB - среды , содержащей антибиотики и инкубировать при 37 ° С в шейкере в течение ночи.
- Интенсификация культуры путем разбавления бактериальной культуры в соотношении 1: 100 в 250 мл LB среды с антибиотиками и встряхивания в течение ночи при 37 ° С
- Подготовьте большое количество ДНК с помощью высокой QUALITу, эндотоксинов плазмида подготовка комплекта в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Протокол Acufection требует высокой чистоты и большое количество плазмидной ДНК. Использование высокого качества, эндотоксинов и столбец-очищенной ДНК плазмиды рекомендуется. - Элюции ДНК в стерильной воде. ДНК Хранить в небольших аликвот при -20 ° С до готовности к acufection.
Примечание: Во избежание повторного замерзания и оттаивания ДНК, чтобы обеспечить последовательное выражение плазмидной ДНК. - Развести ДНК плазмиды до 1 мг / мл в стерильном PBS для acufection.
3. Порядок Acufection
Примечание: Оптимальное количество ДНК и площадь поверхности кожи мишени может изменяться для различных генов и должно быть дополнительно оптимизировано. Сила, покалывание и количество раз, чтобы ослабить роговой слой кожи может также варьироваться в зависимости от толщины кожи. Эти условия должны быть тщательно определены после оценки уровня экспрессии гена acufected transcriPTS с помощью QRT-PCR.
- Взвесьте мышей и управлять tribromoethanol (400 мкг на г веса тела) путем перитонеального инъекции.
Примечание: 2,2,2-tribromoethanol является инъекционным анестетиком, который обычно используется в мышах. Растворы изготовлены путем растворения нефармацевтического класса 2,2,2-tribromoethanol (2,5 г) в дистиллированной воде (200 мл), содержащая 2,5% 2-метил-2-бутанол. - Используйте ветеринар офтальмологической мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
Примечание: обезболивающий эффект будет индуцируется в 1 - 2 мин. Проверьте схождение щепотку рефлекс, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии до начала работы. - Бритье спинной фланговой кожи и нанесите крем депиляции растворять кератин белок в стержне волоса.
Примечание: Использование депиляции крема для удаления волос будет способствовать вливанию ДНК в кожу. - Используйте воду пропитанной ватные тампоны, чтобы вытереть депиляции крем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крем для депиляции растворим в воде. Полное удаление крема Вильл предотвратить жирную поверхность и обеспечить лучший результат покалывания. - Используйте стерильный ватный тампон, смоченный в 70% этаноле для дезинфекции поверхности кожи.
- Отметить целевую область (1 см х 1 см) на депилированной коже с предварительно измеренным трафаретом. Примечание: Маркировка целевого сайта поможет применить пакет иглы вверх-вниз в пределах определенной области. Это важно, чтобы гарантировать доставку одного и того же количества ДНК к удельной площади поверхности, чтобы свести к минимуму эксперимент-к-эксперимента вариации.
- Поместите каплю 10 мкл плазмидной ДНК (10 мкг) на отмеченной коже.
Примечание: Количество ДНК для acufection варьируется в зависимости от различных генов и типа вектора экспрессии. Количество ДНК, используемой должно быть тщательно титрует до проведения эксперимента интереса. 10 мкл небольшой капля жидкости и хорошо сидит на бритую и депилированную коже без скатывания в то время как покалывание. Включите контрольную группу мышей, обработанных 10 мкл пустого вектора ДНК для сравнения с мышамcufected с геном исследования. - Удерживая акупунктуру иглу пучка (Фигура 1В) и колоть отмеченную поверхность с движением вверх-вниз по 100 раз или до влаги из ДНК в PBS на коже исчезает. Примечание: Некоторые покраснение поверхности кожи может произойти. Избегайте глубокие сокращения, которые кровоточат. Количество вверх и вниз колющие движения на поверхности кожи функционально определяется, когда влага из ДНК в PBS (10 мкл) исчезает на коже. Мы решили 100 раз в 30 секунд, потому что он дал наиболее достоверные результаты acufection доставляемых генов. Если это применимо, иглы могут быть повторно использованы до 6 уколов мишени кожи (1 см х 1 см) каждый. Промыть иглы в 70% этаноле и PBS между acufection. Замените их на новые иглы, когда они тупые или для различной плазмидной ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Поместите acufected мышей на грелку, чтобы поддерживать температуру тела до бодрствования.
- Возвращение мышей в клетку, когда у них естьвосстановила достаточное сознание. Примечание: Следует acufected мышей в отдельной клетке (менее 5 животных в клетке) из клетки не-acufected мышей.
- Поместите бутылку с водой на месте и вернуть клетку к IVC (индивидуально вентилируемые клетки) стойки.
4. Послеоперационный уход
- В течение первых 48 часов после процедуры, внимательно следить за мышами для любого дискомфорта, включая поведенческие изменения (беспокойство, возбуждение или расстройства пищевого поведения) или ненормальную внешность (грубый волос пальто или сгорбившись позу).
5. Имиквимод (IMQ) Лечение IL-15ΔE7-acufected кожи
Примечание: Выражение Транскрипционного и белка производство acufected гена может быть обнаружено на 3 день мышея acufected плазмиду интереса можно лечить с помощью различных видов стимуляторов 3 дня после трансфекции. Проиллюстрируем здесь путем обработки IL-15ΔE7-acufected кожу мыши с IMQ кремом. IMQ является imidazoquinolin амина одобрен Fили лечения внешних половых органов и перинатальные кондиломы 13. Местное лечение IMQ показано , чтобы вызвать псориаз подобные заболевания кожи человека у мышей с проявлением слоеного кожи, эпидермального и дермального пролиферации нейтрофильной инфильтрации 12, 14, 15.
Примечание: плазмидный вектор содержал всю длину мыши IL-15 кДНК, при регулировании фактора элонгации 1-альфа (ПЭФ), по бокам с пептидом IL-2 сигнала и FLAG тегом на С-конце (ПЭФ-ИЛЫ 15, 5859 пар оснований), который был построен , как описано Bamford и соавт. 16. Плазмиду используют в качестве матрицы IL-15, чтобы удалить первые 16 аминокислот в остатках 33 - 48 в экзоне 7 гена IL-15 для IL-15ΔE7 (ПЭФ-IL-15ΔE7, 5,811 пар оснований) с помощью SOE (синтез расширение перекрытия) ПЦР - метод 17. Бактериальные колонии, которые успешно былитрансформировал с IL-15ΔE7 были проверены с помощью расщепления ферментов рестрикции и ДНК с последующим секвенирование 12, 18. Большое количество эндотоксинов плазмидной ДНК получали, как описано на стадии 2 протокола.
- Обезболить acufected мышей путем внутрибрюшинной инъекции tribromoethanol (400 мкг на г массы тела) и применять ветеринара офтальмологическую мазь на глаз, чтобы предотвратить сухость под анестезией. Проверьте схождение щепотку рефлекс, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии перед началом оперативных процедур. Примечание: Так как 2 см х 2 см кожа будет лечиться IMQ, 2 дозы PIL-15ΔE7 плазмидной ДНК (10 мкг в 10 мкл PBS на дозу) является acufected на 2 целевых сайтах (1 см х 1 см каждый).
- Марк обрамляет кожи (2 см х 2 см), покрывающий acufected области.
- Используйте Q-наконечник аппликатора для местно применять IMQ крем на область отмеченной поверхности. Примечание: шаг 5.1 выполняется только для первой дозы (60 мг / дозы).Следующие последовательные дозы применяются к не анестезированному мышею.
- Документирование изменения IMQ обработанной кожи спины ежедневно с видеокамерой высокой четкости. Примечание: Один человек держит мышь в то время как другой находится в режиме записи. Фотоснимки снято и смонтировано в более позднее время.
- Эвтаназии мышей путем введения передозировки tribromoethanol (800 мкг на г веса тела) с последующим смещением шейных позвонков на 4-й день или 7-й день после обработки IMQ. Кожа вырезают и обрабатывают (шаги 4.1 - 4.5).
6. гомогенат кожи мыши
- Используйте пару хирургических ножниц, чтобы сделать горизонтальный разрез от основания хвоста. Продолжить на двусторонней основе, к основанию задних конечностей и продолжают резать по вертикали вдоль боковой к основанию передней конечности.
- Тщательно очистить кожу от основной ткани от задней к передней. Используйте ножницы, чтобы отрезать спинной кожи. Поместите кожу на стерильную чашку Петри.
- Используйте скальпель, чтобы иссечь целикожа и заморозить его в жидком азоте немедленно. Примечание: Тот же самый размер acufected кожи без (1 см х 1 см) или с лечением IMQ (2 см х 2 см), установленной для каждой мыши, чтобы свести к минимуму эксперимент-в-эксперименте вариации.
- Поместите замороженные ткани кожи в центре предварительно охлажденной 2-отсечной ступки с ручками и пестиком. Использование свинцового молотка на ступку, чтобы распылить ткань.
- Быстро поместить пылевидного ткани в новую пробирку, содержащую 500 мкл реагента для лизиса клеток для экстракции РНК или в пробирку, содержащую 50 мкл PBS и 1x ингибитор протеазы коктейль для получения белка лизата.
7. Н & Е и иммуногистохимическое окрашивание кожи Раздел
- Поместите ткань кожи в кассете и погрузить его в 4% параформальдегид в течение ночи.
- Вставить и срез ткани, которая в нашем случае была выполнена в лаборатории патологии в LAC, NTU. Примечание: В разделе разрезают при толщине 5 мкм. Место secti тканидополнениях на положительно заряженные горки.
- Нагреть слайды при температуре 65 ° С в течение 15 мин.
- Поместите слайды в окрашивании стойке. Погрузите стойки в соответствующие резервуар, содержащий ксилол замену в течение 5 мин с последующим дважды путем последовательного погружения в 100%, 95%, 80%, 75%, 60% и 50% этанола (5 мин каждый) для регидратации. Погрузите слайды в водопроводной воде в течение 3 мин перед окрашиванием.
- Выполните гематоксилин и эозин окрашивание. Примечание: H & E окрашивание проводили по запросу на лаборатории патологии в LAC, NTU.
- Для иммуногистохимического окрашивания, блокировать секцию с блоком раствором при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы уменьшить неспецифическое фоновое окрашивание. Примечание: Блок раствор коммерчески разработан с методами иммуноокрашивания. Ни одно животное в сыворотке крови не содержится в этом продукте.
- Погрузите слайд в PBS, чтобы промыть блок раствор.
- Развести блок раствора в PBS в 1:10 и добавить 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (разбавитель раствора).
- Пятно один последовательный участок в том же периоде с тем же раствором, опуская первичное антитело для контроля за неспецифическое связывание вторичного антитела.
8. Фотография и анализ раздела тканей Витраж
- Визуализируйте срезы ткани H & Е и окрашивали IHC под ярким поле микроскопа. Захват изображение с использованием прибора с зарядовой связью (CCD) камеры, прикрепленной к микроскопу. Для дuantitative анализ, программное обеспечение визуализации может быть использована
- Сканирование целых окрашенных срезов с помощью ScanScope с целью 20X.
- Измерить толщину эпидермиса в пределах 1 мм сегмента эпидермиса и в подсчете количества Ki67-иммунореактивных клетки внутри сегмента.
Примечание: Количественный анализ выполняется с помощью автоматизации микроскопии & программного обеспечения для анализа изображений. Толщина эпидермального определяется расстоянием между базальным слоем и наружным слоем эпидермиса. - Подсчитайте число Ly6G-иммунореактивные клетки в зоне дермы (230 х 270 мкм 2 прямоугольника) непосредственно ниже местного IMQ обработанной кожи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В то время как некоторые покраснение было очевидно в течение первого часа после того, как прокалывание с акупунктурных игл, кожа очищается от 2 -й день , и не наблюдалось никакой негативной реакции кожи до 7 -й день после того, как прокалывание (фиг.2А). Игла колющая индуцированное очень низкий уровень эпидермального orthokeratosis и минимальной дермального проникновения H & E анализа по сравнению с необработанной кожи (Фигура 2В). Толщины эпидермиса (фиг.2С) , а число Ki67 + клеток (фигура 2D) были сравнимы между иглой-кололи и необработанной кожи, демонстрируя , что иглоукалывание иглы кололи кожа не вызывает заметного разрушения ткани или клеточной пролиферации в эпидермисе. По сравнению с иглой шприца (1.067 мм в диаметре) 12, колющие с акупунктурных игл , индуцированные сниженные уровни выражений хемокинов CXCL-1 и провоспалительный цитокин IL-6 , на 2 -й день , которые продолжали снижаться на 5 -й день (фиг.3А). Для подтверждения экспрессии трансгена в acufected кожи мыши, плазмиду, экспрессирующую IL-15 кДНК acufected в коже ИЛ-15-дефицитных мышей C57BL / 6 (IL-15 KO) мышей. Несмотря на низкий уровень транскрипции от acufected плазмидной ДНК наблюдали в депилированной кожи, колебание с акупунктуры иглами повысить уровень транскрипции гена (фигура 3В). ИЛ-15 , производство было обнаружено на 2 -й день и оставался стабильным до 7 -й день (рис 3C). Эти результаты показывают, что acufection эффективно вливается плазмидной ДНК и позволяет экспрессию кодируемого белка в коже, не вызывая чрезмерную активацию кератиноцитов.
WT мышей были acufected с плазмидой, кодирующей IL-15ΔE7. Мыши выражали IL-15ΔE7 мРНК и белка до 3дней после трансфекции (фиг.4А). Затем мышей обрабатывали местно IMQ крема на день 3. В то время как обработка IMQ индуцированные серебристые чешуйки у контрольных мышей дикого типа , IMQ-индуцированные серебристые чешуйки были уменьшены в IL-15ΔE7 acufected мышей WT (рис 4В). Интересно, что экспрессия acufected IL-15ΔE7 значительно ингибирует Ly6G + нейтрофильной инфильтрации в IMQ обработанной кожи по сравнению с unacufected WT кожи (4C) Рисунок 12. По acufection, мы продемонстрировали новую функцию IL-15ΔE7 в коже. IL-15ΔE7 модулирует IMQ индуцирующего нейтрофильной инфильтрации.
Рисунок 1. Иллюстрация акупунктурных игл. (A) акупунктуры иглы (36 G х 0,5" ) состоит изручка и конец иглы. (B) Десять акупунктурные иглы связаны в пучок с помощью клейкой ленты. Длина пучка составляет примерно 4 см, как измерено с помощью линейки (нижняя панель). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Покалывание на акупунктурные иглы , не вызывает заметных повреждений кожи или кератиноцитов активации. (A) тройные участки отмечены в серые квадраты на бритой и депилированной фланговой кожи мыши кололи 100 раз каждый по акупунктурные иглы. Фотографии были сделаны в первый час и до 7 дней после того, как покалывание контролировать повреждение кожи. Бритые и кожа без лишили волос иглы покалывания использовали в качестве контроля. <сильный> (В) Н & Й Анализ фиксированного формалин, парафин срезов кожи от неочищенной или игл кололи кожи мыши. Шкала бар: 100 мкм. (С) Один миллиметрового сегмент Н & Е окрашенные срезы из неочищенных или иглы кололи кожу мыши была выбрана для измерения толщины эпидермиса (расстояние от базальной к внешнему слою). Каждый столбик представляет собой среднюю величину эпидермальной толщины, измеренной от 3-х секциев кожи. бар Ошибка представляет собой стандартную ошибку среднего (SEM). Значимость различий между группами была проверена по тестам непарному Стьюденту. (D) Серийные срезы тех же образцов окрашивали анти-Ki67 для иммуногистохимического анализа. Каждый столбик представляет собой среднюю величину Ki67 клеток + , локализованных в каждом 150 мкм в длину эпидермиса на мм сегмента 1. бар Ошибка представляет собой стандартную ошибку среднего (SEM). Значимость различий между группами была протестирована с помощью двусторонней ANOVA Фоллязадолжали после специальной тест Бонферрони. (нс: не значащие). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Acufection Эффективно выражает интерес белок , не вызывая Заметные кератиноциты активации. (А) бреют и боковая поверхность кожи лишили волос была оставлена необработанной (NTC), истирания с 1.067 мм диаметра (19 г) иглы шприца (Сыр.) Или покалывание в 100 раз с помощью акупунктурных игл (ACU.). Транскрипционной уровни CXCL-1 и IL-6 на 2-й день и 5-й день были измерены QRT-ПЦР (п = 3). (В) бреют и лишили волос кожи IL-15-дефицитных мышей наносили местно с каплей плазмидной ДНК , экспрессирующих IL-15 withouт (депиляция) или с помощью акупунктуры иглы покалывания (депиляции + укола). Транскрипция IL-15 в каждой группе на 2-й день измеряли с помощью TaqMan QRT-PCR. Транскрипция IL-15 не был обнаружен в контроле PBS (NTC) ИЛ-15-дефицитных мышей. (С) ИЛ-15 производства от ИЛ-15-дефицитной кожи мышей , которые были неочищенных или IL-15-acufected для различных дней (один ткани на каждый день) измеряли с помощью IL-15 ELISA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Демонстрация Ил-15ΔE7 Ослабляет IMQ-индуцированный серебристые шелушение кожи и Тормозит нейтрофильной инфильтрации. (A) уровень транскрипции и белка производство IL-15ΔE7-acufected (WT / PIL-15 [6; Е7) или пустой вектор-контроль (WT / pEmpty) кожи измеряли с помощью QRT-PCR и ELISA (п = 2, каждый раз, когда точка), соответственно. (Б) Пустой вектор- или ИЛ-15ΔE7-acufected боковая поверхность кожи в 3 -й день местно обрабатывали IMQ кремом (60 мг). Фотографии WT / pEmpty и WT / PIL-15ΔE7 мыши фланг на 6-й день после обработки IMQ. (С) участки кожи от WT / pEmpty или мышей WT / PIL-15ΔE7 после лечения IMQ в дни 3 и 6 окрашивали анти-антителом и Ly6G перечислены. Каждый столбик представляет собой среднюю величину Ly6G + клеток из 4 мышей , обработанных IMQ. бар Ошибка представляет собой стандартную ошибку среднего (SEM). Значимость различий между группами была проверена двухсторонним ANOVA с последующим постфактум тестом Бонферрони. Панели А и С модифицируются с разрешения Журнала Следственного дерматологии, номер лицензии 3901890227597. Пожалуйста , нажмитездесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важный шаг, чтобы обеспечить экспрессию acufected плазмидной ДНК, чтобы равномерно осциллировать и ослабить роговой слой кожи. Прижимая иглу осторожно, не разрезая кожу, сила должна быть достаточно трудно нажимать на поверхность. Для того, чтобы облегчить поглощение ДНК в 10 мкл раствора на 1 см х площадь поверхности 1 см, иглы должны колебаться вверх и вниз в течение приблизительно 100 раз в 30 с. Можно определить силу, которую необходимо проколоть кожу и отмечая количество раз, которые необходимы для получения наилучшего уровня экспрессии гена acufected.
Модификация для количества плазмидной ДНК применяется для достижения удовлетворительного уровня экспрессии после acufection может быть необходим, потому что она может изменяться для различных генов. Эксперименты титрования должны быть выполнены, чтобы определить оптимальное количество плазмидной ДНК, которые должны применяться до начала эксперимента, а также. Результаты количественного анализа RT-PCR помогут определить Optimal количество плазмидной ДНК и наилучшие условия для получения воспроизводимых результатов.
Точный механизм процесса acufection еще предстоит уточнить. В то время как транскрибирования местно поставляемая плазмидная ДНК произошли в бритой и депилированной коже на низком уровне, покалывание с помощью акупунктурных игл повышенной эффективности трансфекции (фигура 3В). По аналогии с протоколом microseeding , в котором множество перфораций с татуировкой 11, acufection доставляемого плазмидной ДНК, вероятно , облегчила через соскоб из клеточной мембраны кератиноцитов и волосяных фолликулов 19, 20. Раздражения эпидермиса путем удаления волос, для удаления волос реагента и иглы колебаний могут вызывать активацию кератиноцитов до некоторой степени и дальнейшее повышение поглощения ДНК с помощью Лангергансы и РСОМ 6. Ограничение этого протокола является то, что количество плазмидной ДНК обрабатываетклетки, не может быть точно контролироваться. Мы не рекомендуем использовать этот метод для лечения большого участка кожи. Чтобы свести к минимуму колебания уровней экспрессии доставленного гена среди экспериментов, объем раствора ДНК и размер поверхности кожи мишени должны быть закреплены на одной и ту же серию экспериментов. Для создания воспроизводимых результатов, желательно, чтобы повторности экспериментов должны быть выполнены одним и тем же человеком.
Что касается пистолета устройства гена и microseeding, использование пучка акупунктурных игл поставить голую ДНК недорого. Процедуры также просты. Это требует очень мало технического опыта, чтобы следовать протоколу acufection. Acufection вызывает минимальную травму животных и без потери веса не будет найдена после операции. Уровень боли низок, о чем судили по отсутствию существенных изменений в поведении после операции acufection.
Таким образом, с помощью акупунктуры иглы ослабитьроговой слой кожи для поглощения ДНК клеток-хозяевами обеспечивает экономичный альтернативный способ для экспрессии белка в коже мыши. Широкий спектр иммунных связанных генов до сих пор не быть функционально характеризуется в коже 21, и это указывает на необходимость быстрого изучения нового гена на коже. Используя этот метод, можно легко определить, имеет ли продукт гена, представляющего интерес любую новую функцию. Этот протокол acufection обеспечивает удобный и осуществимый инструмент для новых открытий в модуляции иммунного ответа для лечения кожных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких финансовых интересов раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и технологии (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Мы благодарим доктора. Бетти Ву-Се и Chien-Куо Ли в NTU, Ли Зербони Стэнфордского университета и доктором Питер Гофман в Гавайском университете для чтения рукописи, Юн Чин в НТУ для технической помощи, а также д-р Вэнь-Чи Вэй в сельскохозяйственной биотехнологии Научно-исследовательский центр в Академии Синике для технических консультаций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
