Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل "Acufection" وتطبيقه لبحوث الجلد

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

هذا البروتوكول هو بديلا فعالا من حيث التكلفة للتعبير عارية DNA البلازميد في الجلد الماوس. ويتمثل الهدف العام من البروتوكول هو تقديم الجينات المرتبطة بالمناعة في أنسجة الجلد لتحديد الدور الوظيفي للجين معين في التهاب الجلدي.

Abstract

ويرتبط التقلبات من الاستجابة المناعية في الجلد مع العديد من اضطرابات الجلد البشري. النقل المباشر للجينات المرتبطة بالمناعة في أنسجة الجلد هو نهج رائعة للتحقيق في تعديل المناعي للالتهاب الجلدي في نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان. هنا نقدم بروتوكول فعالة من حيث التكلفة التي سلمت DNA عارية في الجلد الماوس ويؤدي إلى التعبير التحوير. وصاغ طريقة "acufection"، تدل على ACU بوساطة ثقب DNA fection غير المشبعة. لأداء acufection، وقد أكسب الجلد الماوس أولا مع الحمض النووي في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم وخز باستخفاف مع مجموعة من الإبر الوخز بالإبر لتسهيل امتصاص الحمض النووي وترنسفكأيشن إلى الخلايا. يتم أخذ DNA البلازميد يفترض من قبل الخلايا الكيراتينية والخلايا الجذعية (DCS) في الجلد وأعرب في البروتين. لم وخز الميكانيكية مع الإبر في حد ذاته لا يسبب تلف الجلد أو تتسبب في تنشيط الخلايا الكيراتينية. التعبيرمن الجينات transfected تم الكشف في الجلد على المستويين النسخي ومتعدية التالية acufection لمدة 2 يوما، والحفاظ على ما يصل إلى 7 أيام. وكان الهدف الأساسي لتطوير هذه الطريقة acufection للتحقيق في شكل الإسوي غير معروف سابقا من IL-15. باستخدام هذه الطريقة، وهي تقسم بدلا من ذلك IL-15 الإسوي مع حذف جزئيا اكسون 7 (IL-15ΔE7) وأعرب في الجلد وعلاجه في وقت لاحق مع تول مثل مستقبلات 7 (TLR7) ناهض، إميكويمود (IMQ)، للحث على التهاب. Acufection-تسليمها IL-15ΔE7 في الجلد قمع انتشار الخلايا الكيراتينية، سمك البشرة والتوظيف العدلات في التهاب الجلدي الناجم عن IMQ. مع تزايد الاهتمام في تحديد الآليات التنظيمية للالتهاب الجلدي، وصفت بروتوكول هنا يوفر التكلفة بديل فعال وتنوعا للنظام مدفع الجينات أو microseeding للتسليم DNA في الجسم الحي. ومن المحتمل أن تكون قد تسمح باكتشاف وظيفة روايةجين في الجلد أو عن التحقيق في علاج جديد لأمراض الجلدية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الجلد هو خط الدفاع الأول المضيف. الكيراتينية (KCS) هي نوع من الخلايا الرئيسية في الجلد من البشر والفئران. في استجابة للمؤثرات البيئية (مثل ضوء الشمس والأكسجين والمواد الكيميائية والغزو المسببة للأمراض)، يتم تنشيط KCS وتنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات مثل IL-8، IL-6، IL-1α، IL-1β، TNF- α و GM-CSF 1. معا يؤدي تجنيد الخلايا المناعية للجلد. وكثيرا ما يرتبط تفاقم الالتهاب الجلدي مع العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك التهاب الجلد التماسي خارج الرحم الحاد والمزمن T التهاب بوساطة الخلايا (مثل التهاب الجلد التماسي التحسسي والصدفية) 2. تحوير الردود الموالية للالتهابات في الجلد عن طريق تثبيط تفعيل KC هو نهج معقول لعلاج الالتهاب الجلدي. يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا للتعبير عن عابر جين خلوى في البشرة، من أجل دراسة الدقة المناعةponse المترتبة على مثل هذا العلاج في الجلد.

البشرة يؤلف طبقة الأكثر سطحية من الجلد. وهو بمثابة حاجز مادي حفظ المواد الخارجية مثل الأحماض النووية ومسببات الأمراض من دخول الطبقات العميقة من الجلد. وقد وضعت العديد من التقنيات خالية من إبرة لنقل البشرة DNA 3 و 4. DNA في حل أو المرتبطة الجسيمات الشحمية الموجبة أو ناقلات اتش تم تطبيقها مباشرة على البشرة تعديلها مع تقنيات مثل إزالة الطبقة القرنية أو العلاج مع السماط كاشف. إزالة ظهارة متقرن تسهل DNA عبور حاجز البشرة والتفاعل مع الخلايا الكيراتينية والخلايا انجرهانز للحث على الاستجابات المناعية 5. في حين أن مساحة كبيرة متاحة لنقل الحمض النووي ولا ينطوي هذا النهج الإبر، وهناك عيوب بما في ذلك شرطلكميات كبيرة من الحمض النووي (10-100 ميكروغرام)، معاملة قاسية على الجلد عن طريق تجريد، والنتائج غير متناسقة في إحداث استجابة مناعية في الحيوانات تحصين دون تسليم DNA معززة 6. وقد تبين بوساطة Microparticle تسليم داخل الخلايا DNA عارية على الجلد لتكون فعالة للغاية وقابلة للتكرار لإحداث استجابة مناعية 7 و 8. وقد استخدم بندقية الجينات باليد لقصف الموقع المستهدف الجلد مع البلازميد جزيئات الذهب المغلفة DNA 2 ميكرون القطر في الحجم عن طريق تدفق الهواء الهيليوم المضغوط 9. يتم أخذ DNA البلازميد يفترض من قبل الخلايا الجذعية KCsand (DCS) في الجلد ويتم التعبير عن هذا البروتين محليا أو يتم نقلها إلى استنزاف الغدد الليمفاوية من البلدان النامية 10. على الرغم من أن نظام مدفع الجينات بسيط ويتطلب خبرة تقنية محدودة، تكلفة إعداد وتقديم "BUL DNAالسماح "(أي مساحيق الذهب، غاز الهيليوم) وللمدفع الجينات نفسها محدودة التطبيق العام فيها. بالإضافة إلى ذلك، شرط وجود نظام الهليوم تسليم الغاز يحد من سهولة النقل بندقية الجينات عندما تجرى التجارب في مواقع مختلفة. Microseeding وقد ثبت لتحقيق كفاءة أعلى من نقل الجينات من حقنة واحدة والقصف الجسيمات 11. Microseeding يستخدم بندقية الوشم لتقديم DNA على الجلد من دون استخدام الخرز الجسيمات 11. تتأرجح على الأرجح إلى microneedles على الجلد باستخدام هذا النهج تتخلص مباشرة غشاء الخلية، وبالتالي نقل الحمض النووي لخلايا متعددة في نفس الوقت، ولكن الألم الذي يصاحب عدد كبير من الحقن مع 0.254 مم الإبر قطرها هو وضع غير مؤات.

هنا نقدم نهجا بديلا لتسليم DNA في الجسم الحي. و"acufection" 12. بينما يثبت acufection أن يكون ديما سهلة وأقلnding طريقة لتسليم DNA في الجسم الحي، ومقدار الأمثل للDNA لجينات مختلفة والأوقات لوخز الجلد يجب أن يكون الأمثل بعناية للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

واستخدمت 12 أسابيع من العمر لهذه الدراسة - إناث الفئران في 8. C57 / BL6 البرية من نوع (WT) وIL-15 ناقص (Il15 - / -) تم شراؤها الفئران من المركز الوطني مختبر الحيوان (NLAC) وتايوان وتكنيك] مزرعة، على التوالي. IL-15-ناقص (Il15 - / -) وIL-15-المهيمن (Il15 +/- وIl15 + / +) أظهرت نسبة 1: 3 في الجيل الثاني من الصليب من الزيجوت Il15 +/-. النمط الجيني من Il15 - / - وأكد الفئران عن طريق تحليل PCR. واستمرت الفئران في منشأة معينة الممرض الحرة (SPF) في مركز حيوانات التجارب (LAC)، جامعة تايوان الوطنية (NTU) كلية الطب. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بما في ذلك المواد وطرق التخدير وفقا للبروتوكول الحيوان التي وافق عليها كلية تايوان الوطنية جامعة الطب وكلية الصحة العامة المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) (إفادة من الموافقة على بروتوكول الحيوان 20130225).

<ص الطبقة = "jove_title"> 1. إعداد إبر الوخز بالإبر

ملاحظة: الإبر الوخز بالإبر والأجهزة الطبية تتكون من مقبض ونهاية الإبرة (الشكل 1A). وتراوحت أقطارها من إبرة الوخز بالإبر من 0.2 ملم (36 G) إلى 0.35 ملم (28 G). نختار أفضل نقطة من إبرة لتجنب تلف الخلايا المفرط المحتمل خلال وخز الجلد. هناك 4 أطوال مختلفة من الإبرة 0.2 ملم بما في ذلك 13 ملم (0.5 في)، و 25 ملم (1.0 في)، 40 ملم (1.5 في) و 50 ملم (2.0 في) في الطول. وهناك حزمة من 10 الإبر مع طول 13 مم قدمت قبضة أفضل مريحة خلال تتأرجح الإبرة في C57BL / 6 الجلد الماوس. يمكن تعديل المعلمات إذا تم تطبيق الطريقة على الجلد من الحيوانات الكبيرة أو إجراء من قبل الباحثين ويداه أكبر.

  1. إزالة الإبر الوخز بالإبر من العبوة المعقمة، غير مولد للحمى. وضع الإبر على ثنى العقيمة.
  2. استخدام لاصقة وصفها الشريط لربط 10 الإبر معا طغ حزمة (الشكل 1B).
    ملاحظة: يتم ترتيب الإبر 10 هندسيا لتشكيل شكل اسطوانة. للراحة، واستخدام قطعة من فيلم البارافين لتحقيق الاستقرار في الترتيب قبل تطبيق شريط لاصق. تأكد من أن جميع النقاط إبرة على نفس الطائرة. باستخدام حزمة بدلا من إبرة واحدة يسهل القصوى ضخ DNA عن طريق زيادة منطقة التماس بين الإبر والجلد.

2. إعداد كمية كبيرة وخالية من الذيفان الداخلي البلازميد DNA

  1. تحويل الخلايا البكتيرية المختصة كيميائيا مع DNA البلازميد.
  2. اختيار وتطعيم مستعمرة بكتيرية واحدة في 3 مل من LB المتوسطة تحتوي على مضادات حيوية واحتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها.
  3. رفع مستوى الثقافة عن طريق تمييع ثقافة البكتيرية في 1: 100 في 250 مل من LB المتوسطة مع المضادات الحيوية وتهتز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. إعداد كمية كبيرة من الحمض النووي باستخدام الجوده العاليةذ، الذيفان الداخلي عدة إعداد البلازميد الحرة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    يتطلب بروتوكول Acufection عالية النقاء وكمية كبيرة من DNA البلازميد: ملاحظة. استخدام ذات جودة عالية، ويوصى الذيفان الداخلي مجانا وتنقية العمود DNA البلازميد.
  5. أزل DNA في الماء المعقم. متجر DNA في أجزاء مأخوذة صغيرة في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للacufection.
    ملاحظة: تجنب تكرار تجميد وذوبان الجليد من الحمض النووي لضمان ثابت التعبير DNA البلازميد.
  6. تمييع DNA البلازميد 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة لacufection.

3. إجراءات Acufection

ملاحظة: المبلغ الأمثل للDNA ومنطقة من سطح الجلد الهدف قد تختلف عن جينات مختلفة وتحتاج إلى مزيد من الأمثل. قوة الوخز وعدد المرات لتخفيف طبقة قرنية من الجلد أيضا قد تختلف تبعا لسماكة الجلد. يجب أن تحدد هذه الشروط بعناية بعد تقييم مستوى التعبير جين ترانسكري acufectedنقطة من QRT-PCR.

  1. وزن الفئران وإدارة ثلاثي بروم إيثانول (400 ميكروغرام في وزن الجسم جم) عن طريق الحقن البريتوني.
    ملاحظة: 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول هو وكيل حقن مخدر التي كانت تستخدم عادة في الفئران. مصنوعة حلول عن طريق إذابة درجة غير الصيدلانية 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول (2.5 غرام) في الماء المقطر (200 مل) تحتوي على 2.5٪ من 2 ميثيل 2-بيوتانول.
  2. استخدام البيطري، طب العيون مرهم على العينين لمنع جفاف تحت التخدير.
    ملاحظة: تأثير مخدر سيتم يتسبب في 1-2 دقيقة. تحقق من أخمص القدمين قرصة العاكسة لضمان عمق كاف من التخدير قبل العملية.
  3. حلق الجناح جلد ظهري وتطبيق كريم مزيل الشعر بحل بروتينات الكيراتين في جذع الشعرة.
    ملاحظة: سيتم استخدام كريم مزيل الشعر لإزالة الشعر تسهيل ضخ DNA داخل الجلد.
  4. استخدام كرات القطن المياه غارقة لتمحو كريم مزيل الشعر.
    ملاحظة: كريم مزيل الشعر غير قابل للذوبان في الماء. الاستئصال الكامل للفيل كريمل منع سطح دهني وضمان نتيجة أفضل وخز.
  5. استخدام مسحة القطن المعقم غارقة في الايثانول 70٪ لتطهير سطح الجلد.
  6. الأقسام المنطقة المستهدفة (1 سم × 1 سم) على الجلد نزعه مع استنسل قياس مسبقا. ملاحظة: بمناسبة الموقع المستهدف تساعد على تطبيق حزمة إبرة صعودا ونزولا داخل منطقة محددة. وهذا أمر مهم لضمان تقديم نفس الكمية من الحمض النووي لمساحة محددة لتقليل التباين التجربة إلى التجربة.
  7. وضع قطرة 10 ميكرولتر من DNA البلازميد (10 ميكروغرام) على الجلد ملحوظ.
    ملاحظة: كمية من الحمض النووي لacufection يختلف مع جينات مختلفة ونوع ناقلات التعبير. كمية الحمض النووي المستخدمة يجب أن تكون معاير بعناية قبل إجراء التجربة المثيرة للاهتمام. وميكرولتر 10 هو قطرة السائل الصغيرة وأنه يجلس جيدا على الجلد حلق ونزعه دون تنهمر حين وخز. وتشمل المجموعة الضابطة من الفئران التي عولجت مع 10 ميكرولتر ناقلات فارغة DNA للمقارنة مع الفئرانcufected مع الجين الدراسة.
  8. عقد حزمة إبرة الوخز بالإبر (الشكل 1B)، ووخز سطح ملحوظ مع الحركة صعودا ونزولا عن 100 مرات أو حتى الرطوبة من DNA في برنامج تلفزيوني على يختفي الجلد. ملاحظة: قد تحدث بعض احمرار على سطح الجلد. تجنب جعل التخفيضات العميقة التي تنزف. يتم تحديد عدد من صعود وأسفل وخز الاقتراحات على سطح الجلد operably عندما يختفي الرطوبة من DNA في برنامج تلفزيوني (10 ميكرولتر) على الجلد. قررنا 100 مرات في 30 ثانية لأنها أعطت نتائج أكثر اتساقا من الجينات تسليمها acufection. إذا كان ذلك ممكنا، والإبر يمكن إعادة استخدامها لمدة تصل إلى 6 الغرزات الجلد الهدف (1 سم × 1 سم لكل منهما). شطف الإبر في 70٪ من الإيثانول وPBS بين acufection. تغيير الإبر جديدة عندما تكون مملة أو لمختلف DNA البلازميد لتجنب التلوث المتبادل.
  9. وضع الفئران acufected على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى مستيقظا.
  10. عودة الفئران إلى قفص عندما يكون لديهموعي كاف استعادت. ملاحظة: حافظ على الفئران acufected في قفص منفصل (أقل من 5 حيوانات في قفص) من قفص الفئران acufected الامم المتحدة.
  11. وضع زجاجة الماء في مكان والعودة القفص إلى IVC (قفص التهوية بشكل فردي) رف.

العناية 4. بعد العملية

  1. لال 48 ساعة الأولى بعد العملية، تراقب عن كثب الفئران عن أي إزعاج بما في ذلك التغيرات السلوكية (الأرق، والتهيج أو اضطراب في الأكل) أو مظهر غير طبيعي (خشونة الشعر أو الموقف منحنية).

5. إميكويمود (IMQ) علاج الجلد acufected IL-15ΔE7-

ملاحظة: التعبير الترانسكربتي والبروتين إنتاج الجين acufected لا يمكن كشفها في اليوم 3. الفئران acufected مع البلازميد من الفائدة يمكن علاجها مع أنواع مختلفة من المنشطات بعد 3 أيام ترنسفكأيشن. نحن لتوضيح هنا عن طريق علاج الجلد الماوس acufected IL-15ΔE7 مع كريم IMQ. IMQ هو و imidazoquinolin أمين وافقأو علاج الأعضاء التناسلية الخارجية والثآليل ما حول الولادة (13). يظهر العلاج IMQ الموضعية للحث على الأمراض الجلدية مثل الصدفية الإنسان في الفئران مع مظهر الجلد قشاري، وانتشار البشرة وتسلل 12، 14، 15 العدلات الجلد.

ملاحظة: ناقلات بلازميد يحتوي على كامل طول الماوس IL-15 كدنا]، تحت تنظيم استطالة عامل 1 α (PEF)، ويحيط مع إشارة الببتيد IL-2 و علامة FLAG في C-محطة (PEF-ايل 15، 5859 زوج قاعدي)، الذي شيد كما وصفها بامفورد وآخرون. 16. يستخدم البلازميد كما قالب IL-15 لحذف أول 16 الأحماض الأمينية في بقايا 33-48 في اكسون 7 من الجين IL-15 لIL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7، 5811 زوج قاعدي) من خلال الشركات المملوكة للدولة (التوليف استطرادا التداخل) طريقة PCR 17. المستعمرات البكتيرية التي كانت بنجاحتحولت مع IL-15ΔE7 تم التحقق منها من قبل انزيم الهضم تقييد وتليها تسلسل الحمض النووي 12 و 18. وتم إعداد كمية كبيرة من الذيفان الداخلي خالية DNA البلازميد كما هو موضح في الخطوة 2 البروتوكول.

  1. تخدير الفئران acufected عن طريق الحقن داخل الصفاق من ثلاثي بروم إيثانول (400 ميكروغرام في وزن الجسم جم) وتطبيق البيطري مرهم في العيون على العيون لمنع جفاف تحت التخدير. تحقق من أخمص القدمين قرصة العاكسة لضمان عمق كاف من التخدير قبل بدء الإجراءات المنطوق. ملاحظة: بما سيتم التعامل مع الجلد 2 سم × 2 سم للIMQ، وacufected 2 جرعة من PIL-15ΔE7 DNA البلازميد (10 ميكروغرام في 10 ميكرولتر PBS للجرعة الواحدة) في 2 موقعا الهدف (1 سم × 1 سم لكل منهما).
  2. علامة الجناح الجلد (2 سم × 2 سم) تغطي منطقة acufected.
  3. استخدام Q-طرف قضيب لتطبيق موضعيا كريم IMQ على مساحة ملحوظة. ملاحظة: الخطوة 5.1 ويتم فقط من اصل لالجرعة الأولى (60 ملغ / جرعة).وتطبق الجرعات التالية على التوالي على الفئران غير تخدير.
  4. توثيق التغيرات في الجلد الظهري تعامل IMQ اليومية مع كاميرا الفيديو عالية الوضوح. ملاحظة: شخص واحد يحمل الماوس أثناء آخر يتم تسجيل. لا تزال صور إطلاق النار وتحريرها في وقت لاحق.
  5. الموت ببطء الفئران عن طريق حقن جرعة زائدة من ثلاثي بروم إيثانول (800 ميكروغرام في وزن الجسم جم) تليها خلع عنق الرحم في يوم 4 أو 7 أيام بعد العلاج IMQ. يتم استئصاله الجلد ومعالجتها (الخطوات 4،1-4،5).

6. جناسة من الجلد ماوس

  1. استخدام زوج من مقص جراحي لاجراء خفض أفقي من قاعدة الذيل. المضي قدما ثنائيا لقاعدة hindlimb ومواصلة خفض عموديا على طول الجناح إلى قاعدة forelimb.
  2. قشر بعناية البشرة من الأنسجة الكامنة من الخلفية إلى الأمامية. استخدام المقص لقطع الجلد الظهرية. وضع الجلد على طبق بتري معقمة.
  3. استخدام مشرط لاستئصال الهدفالجلد وتجميده في النيتروجين السائل على الفور. ملاحظة: نفس حجم الجلد acufected دون (1 سم × 1 سم) أو مع العلاج IMQ (2 سم × 2 سم) هو ثابت لكل الماوس لتقليل الاختلافات التجربة إلى التجربة.
  4. وضع أنسجة الجلد المجمدة في وسط قبل المبردة هاون 2-المقصورة مع مقابض ومدقة. استخدام مطرقة الرصاص على هاون على يطحنون الأنسجة.
  5. المكان بسرعة الأنسجة المسحوق إلى أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولتر من خلية تحلل كاشف لاستخراج الحمض النووي الريبي أو إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و1X مثبط البروتياز كوكتيل للحصول على المحللة البروتين.

7. H & E والمناعية تلون الجلد القسم

  1. وضع أنسجة الجلد في الكاسيت وتزج به في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها.
  2. تضمين وقسم الأنسجة، والتي في حالتنا كان يقوم بها مختبر علم الأمراض في أمريكا اللاتينية والكاريبي، جامعة تايوان الوطنية. ملاحظة: يتم قطع الجزء في سماكة من 5 ميكرون. مكان secti الأنسجةإضافات على الشرائح ذات شحنة موجبة.
  3. تسخين الشرائح عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. ضع الشرائح في رفوف تلطيخ. تزج رف في خزان المقابلة التي تحتوي على بديل الزيلين لمدة 5 دقائق تليها مرتين عن طريق الغمر متتابعة في 100٪، 95٪، 80٪، 75٪، 60٪ و 50٪ من الإيثانول (5 دقائق لكل منهما) لمعالجة الجفاف. تزج الشرائح في ماء الصنبور لمدة 3 دقائق قبل تلطيخ.
  5. أداء الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين. ملاحظة: تم تنفيذ H & E صمة عار عند الطلب في مختبر علم الأمراض في أمريكا اللاتينية والكاريبي، جامعة تايوان الوطنية.
  6. وصمة عار للالمناعى، منع الباب مع حل كتلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للحد من تلوين الخلفية غير محددة. ملاحظة: يتم وضع حل كتلة تجاريا مع التقنيات المناعية. يرد أي مصل الحيوان في هذا المنتج.
  7. تراجع الشرائح في برنامج تلفزيوني لشطف من الحل كتلة.
  8. تمييع الحل كتلة في برنامج تلفزيوني في 01:10 وإضافة 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) (حل مخفف).
  9. وصمة عار قسم تسلسلي واحد في نفس المدى مع نفس الحل الاستغناء عن الأجسام المضادة الأولية للسيطرة على غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة الثانوية.
  • غسل الشرائح ثلاث مرات في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 (حل TBST) لمدة 5 دقائق لكل منهما. تغيير الحل بين يغسل.
  • ماصة قطرة واحدة من البوليمرات المسمى لكل قسم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ملاحظة: البوليمر وصفت من خلال الجمع بين البوليمرات من الأحماض الأمينية مع البيروكسيديز والضد الثانوية التي تحولت الى جزء من فاب "أعد تجاريا. كاشف جاهزة للاستخدام لتلطيخ المناعى من المقاطع الأنسجة الماوس.
  • غسل الشرائح ثلاث مرات في TBST لمدة 5 دقائق لكل منهما. تغيير الحل بين يغسل.
  • ماصة 3،3'-diaminobenzindine tetrahydrochloride (DAB) حل على قسم الأنسجة وترك الوقوف في درجة حرارة الغرفة حتى يعجل البني مرئيا تحت المجهر مشرق الميدان. ملاحظة: المرة لDAB لترسيب في وجود البيروكسيديز حوالي 30 دقيقة.
  • تزج الشرائح في الماء لوقف النشاط البيروكسيد. تراجع الشرائح في حل الأخضر الميثيل لتلطيخ النووي. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  • وضع ساترة على الجزء الملون التي يتم تغطيتها مع تصاعد المتوسط ​​دائم (8 ميكرولتر لكل قسم).
  • 8. تصوير وتحليل الأنسجة القسم الملون

    1. تصور H & E الملون وIHC أقسام الأنسجة تحت المجهر مشرق الميدان. التقاط الصور باستخدام جهاز تهمة إلى جانب (CCD) وكاميرا تعلق على المجهر. لفتحليل uantitative، برامج التصوير يمكن استخدام
      1. مسح أقسام الملون كلها باستخدام scanscope مع الهدف 20X.
      2. قياس سماكة البشرة ضمن شريحة 1 ملم من البشرة وحساب عدد الخلايا Ki67-مناعيا داخل القطاع.
        يتم تنفيذ الكمية التحليل باستخدام أتمتة المجهر وصورة برامج التحليل: ملاحظة. ويعرف سمك البشرة من المسافة بين الطبقة القاعدية والطبقة الخارجية من البشرة.
      3. حساب عدد الخلايا Ly6G-مناعيا في منطقة الجلد (230 س 270 ميكرون 2 مستطيل) أدناه موضعي الجلد المعالجة IMQ على الفور.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    في حين كان بعض احمرار واضح خلال الساعة الأولى بعد وخز بالإبر الوخز بالإبر، وتطهير الجلد في يوم 2 و لم يلاحظ أي رد فعل سلبي الجلد حتى يوم 7 بعد وخز (الشكل 2A). إبرة الوخز يسببها مستوى منخفض جدا من سوائية التقرن البشرة والحد الأدنى من تسلل الجلد التي كتبها H & E تحليل مقارنة مع الجلد غير المعالجة (الشكل 2B). وكان سمك البشرة (الشكل 2C) وعدد من Ki67 + الخلايا (الشكل 2D) مقارنة بين-وخز الإبر وغير المعالجة الجلد، مما يدل على أن لم الجلد وخز إبرة الوخز بالإبر لا يسبب اضطراب الأنسجة ملحوظ أو انتشار الخلوي في البشرة. بالمقارنة مع إبرة حقنة (1،067 ملم في القطر) 12، وخز بالإبر الوخز بالإبر انخفاض مستويات الناجم من التعبير عن CXCL chemokine-1 والموالية للالتهابات خلوى IL-6 في يوم 2 التي استمرت في الانخفاض في يوم 5 (الشكل 3A). للتحقق من صحة التعبير عن التحوير acufected في الجلد الماوس، وacufected البلازميد معربا عن IL-15 كدنا] في جلد C57BL / 6 (IL-15 KO) الفئران IL-15-ناقص. على الرغم من أن لوحظ انخفاض مستويات النسخ من البلازميد acufected DNA في الجلد نزعه، التذبذب مع إبر الوخز تعزيز مستوى النسخ الجيني (الشكل 3B). تم الكشف عن IL-15 إنتاج في يوم 2 و ظلت مستقرة حتى يوم 7 (الشكل 3C). هذه النتائج تثبت أن acufection ينفخ بشكل فعال DNA البلازميد، ويسمح للتعبير عن البروتين المشفرة في الجلد دون التسبب تنشيط الخلايا الكيراتينية المفرط.

    تم acufected الفئران WT مع ترميز البلازميد IL-15ΔE7. أعرب الفئران IL-15ΔE7 مرنا والبروتين حتى 3يوما بعد ترنسفكأيشن (الشكل 4A). ثم تم التعامل مع الفئران موضعيا مع كريم IMQ في اليوم 3. بينما العلاج IMQ الناجم عن رقائق فضية في السيطرة الفئران WT، خفضت رقائق فضي الناجم IMQ في IL-15ΔE7 acufected الفئران WT (الشكل 4B). ومن المثير للاهتمام، تعبيرا عن acufected IL-15ΔE7 مستعمل بشكل كبير Ly6G + تسلل العدلات في الجلد المعالجة IMQ مقارنة مع unacufected WT الجلد (الشكل 4C) 12. بواسطة acufection، أثبتنا وظيفة جديدة للIL-15ΔE7 في الجلد. IL-15ΔE7 ينظم IMQ الذي يحفز العدلات تسلل.

    شكل 1
    الشكل (1). التوضيح من إبر الوخز بالإبر. يتكون (A) وإبرة الوخز بالإبر (36 G س 0.5 ") لالتعامل مع ونهاية الإبرة. لا بد (B) عشرة إبر الوخز في حزمة باستخدام أشرطة لاصقة. طول حزمة حوالي 4 سم مقاسا الحاكم (اللوحة السفلى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2. وخز إبر الوخز بالإبر التي لا تسبب تلف الجلد ملحوظ أو الكيراتينية التنشيط. (A) مواقع الثلاثي ملحوظ في مربعات رمادية على الجلد الجناح حلق ونزعه من الفأرة ووخز 100 مرة كل بواسطة إبر الوخز. تم التقاط الصور في الساعة الأولى، وتصل إلى 7 أيام بعد وخز لمراقبة تلف الجلد. حلق والجلد نزعه دون وخز إبرة كان يستخدم عنصر التحكم. <قوي> (B) تحليل H & E من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام البشرة من دون علاج أو وخز الإبرة الجلد الماوس. مقياس شريط: 100 ميكرون. وقد تم اختيار (C) واحد ملليمتر جزء من أقسام H & E الملون من دون علاج أو إبرة وخز الجلد الماوس لقياس سماكة البشرة (المسافة من القاعدية إلى الطبقة الخارجية). يمثل كل شريط يعني من سمك البشرة تقاس من 3 أقسام الجلد. يمثل شريط الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). تم اختبار أهمية الفرق بين مجموعات من اختبار ر أونبايريد الطالب. كانت ملطخة (D) أقسام المسلسل من نفس العينات مع مكافحة Ki67 للتحليل المناعى. يمثل كل شريط يعني من Ki67 + خلايا محلية في كل 150 ميكرومتر البشرة في طول لكل قطعة 1 ملم. يمثل شريط الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). تم اختبار أهمية الفرق بين مجموعات من اتجاهين ANOVA الفلالمستحقة على الاختبار اللاحق بونفيروني ل. (NS: لا كبيرة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل (3). Acufection تعرب فعال على البروتين من الفائدة دون التسبب ملحوظ الكيراتينية التنشيط. (A) محلوق وتركت الجلد الجناح نزعه دون علاج (NTC)، الكشط مع 1.067 ملم قطرها (19 G) إبرة حقنة (سير) أو وخز 100 مرات من قبل إبر الوخز (إبرة). تم قياس مستويات النسخي من CXCL-1 و IL-6 في يوم 2 و 5 أيام قبل QRT-PCR (ن = 3). (B) حلق والجلد نزعه من الماوس IL-15-ناقص كان يطبق موضعيا مع قطرة من DNA البلازميد معربا عن IL-15 withouر (إزالة الشعر) أو مع الوخز بالإبر إبرة (إزالة الشعر + وخز). وقد تم قياس النسخ من IL-15 في كل مجموعة في يوم 2 من TAQMAN QRT-PCR. كان النسخ من IL-15 لا يمكن الكشف عنها في السيطرة PBS (NTC) من الفئران IL-15-ناقص. (C) IL-15 إنتاج من الجلد الماوس IL-15-ناقص التي كانت دون علاج أو IL-15-acufected لمختلف أيام تم قياس (نسيج واحد عن كل يوم) من خلال IL-15 ELISA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    الشكل (4). مظاهرة من IL-15ΔE7 خفف الناجم IMQ-فضي مقشر الجلد ويمنع تسلل العدلات. (A) والنسخي مستوى الانتاج والبروتين من IL-15ΔE7 acufected (WT / PIL-15 [تم قياس E7) أو فارغة ناقلات التحكم (WT / pEmpty) عن طريق الجلد QRT-PCR وELISA (ن = 2، كل نقطة زمنية)، على التوالي؛ 6. (B) كان يعامل النواقل فارغ أو acufected IL-15ΔE7 الجلد الجناح في يوم 3 موضعيا مع كريم IMQ (60 ملغ). صور لWT / pEmpty وWT / PIL-15ΔE7 الجناح الماوس في يوم 6 بعد العلاج IMQ. (C) وكانت ملطخة أقسام الجلد من WT / pEmpty أو الفئران WT / PIL-15ΔE7 بعد العلاج IMQ في أيام 3 و 6 مع المضادة للLy6G الأجسام المضادة والواردة. يمثل كل شريط يعني من Ly6G + الخلايا من 4 الفئران المعالجة IMQ. يمثل شريط الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). تم اختبار أهمية الفرق بين مجموعات من اتجاهين تليها ANOVA من قبل الاختبار اللاحق بونفيروني ل. لوحات A و C يتم تعديل بإذن من مجلة التحقيقات الأمراض الجلدية، رقم الرخصة 3901890227597. يرجى النقرهنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    الخطوة الأكثر أهمية لضمان التعبير عن DNA البلازميد acufected هو التأرجح بالتساوي وتخفيف طبقة قرنية من الجلد. وفي الوقت الذي يدفع الإبر بلطف دون قطع الجلد، ويجب أن تكون القوة بالقوة الكافية لخفض السطح. لتسهيل امتصاص الحمض النووي في 10 ميكرولتر حل على 1 سم × مساحة 1 سم، يجب أن الإبر تتذبذب صعودا وهبوطا لنحو 100 مرات في 30 ثانية. يمكن للمرء أن تحديد القوة التي تحتاج لوخز الجلد وبالإشارة إلى عدد المرات التي يتم اللازمة لتحقيق أفضل مستوى التعبير عن الجينات acufected.

    تعديل لكمية DNA البلازميد تطبيق للوصول إلى مستوى مرض من التعبير بعد قد تكون هناك حاجة acufection لأنه يمكن أن تختلف عن جينات مختلفة. يجب أن يتم تنفيذ التجارب المعايرة لتحديد كمية المثلى من DNA البلازميد ليتم تطبيقها قبل التجربة أيضا. والنتائج من تحليل RT-PCR الكمي تساعد على تحديد سكمية ptimal من DNA البلازميد وأفضل حالة للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

    لا تزال الآلية الدقيقة لعملية acufection إلى توضيح. بينما النسخ من تسليمها موضعيا DNA البلازميد حدث في الجلد حلق ونزعه في مستوى منخفض، ووخز الإبر بواسطة الوخز بالإبر تعزيز الكفاءة ترنسفكأيشن (الشكل 3B). وقياسا على بروتوكول microseeding التي ثقوب متعددة مع بندقية الوشم 11، ومن المرجح سهلت-تسليمها acufection DNA البلازميد من خلال كشط غشاء خلية من الخلايا الكيراتينية وبصيلات الشعر 19 و 20. التحفيز من البشرة عن طريق إزالة الشعر، والسماط كاشف والتذبذب إبرة يمكن أن تتسبب في تنشيط الخلايا الكيراتينية إلى حد ما ومواصلة تعزيز امتصاص الحمض النووي عن طريق انجرهانز والبلدان النامية 6. وجود قيود على هذا البروتوكول هو أن كمية DNA البلازميد تناولهاالخلايا قد لا يمكن السيطرة عليها بدقة. ونحن لا نقترح استخدام هذا الأسلوب لعلاج منطقة الجلد كبيرة. لتقليل الاختلافات في مستويات التعبير عن الجينات تسليمها بين التجارب، ينبغي أن تكون ثابتة حجم محلول الحمض النووي وحجم الهدف سطح الجلد لنفس مجموعة من التجارب. لتحقيق نتائج قابلة للتكرار، فإنه من المستحسن أن التجارب تكرار هي التي يتعين القيام بها من قبل نفس الشخص.

    وفيما يتعلق بالجهاز بندقية الجينات وmicroseeding، واستخدام مجموعة من الإبر الوخز بالإبر لتقديم DNA عارية غير مكلفة. الإجراءات هي أيضا واضحة. فهي تتطلب خبرة فنية قليلة جدا لمتابعة بروتوكول acufection. Acufection يسبب الحد الأدنى من الصدمة للحيوانات ولم يتم العثور على فقدان الوزن بعد العملية. مستوى الألم منخفض كما دلل على ذلك عدم وجود تغيير السلوك كبير بعد عملية acufection.

    وخلاصة القول، وذلك باستخدام إبر الوخز بالإبر لتخفيفطبقة قرنية من الجلد لامتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا المضيفة يوفر طريقة بديلة الاقتصادي للتعبير عن البروتين في الجلد الماوس. وهناك طائفة واسعة من الجينات المرتبطة بالمناعة لم يتم بعد تتميز وظيفيا في الجلد 21، وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى إجراء دراسة سريعة لجين رواية على الجلد. توظيف هذه الطريقة، يمكن للمرء بسهولة تحديد ما إذا كان المنتج من الجينات في المصالح لديه أي وظيفة جديدة. يوفر هذا البروتوكول acufection أداة مريحة وقابلة للاكتشافات جديدة في تحوير الاستجابة المناعية لعلاج المرض الجلدي.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم مصالح مالية في الكشف عنها.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من قبل منحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 103-2633-B-002-002، 104-2320-B-002-048). نشكر الدكاترة. بيتي وو هسيه وشين كوو لي في جامعة تايوان الوطنية، ليه زيربوني في جامعة ستانفورد، والدكتور بيتر هوفمان في جامعة هاواي لقراءة المخطوطة، يون شيان في جامعة تايوان الوطنية للمساعدة التقنية، والدكتور ون تشي وي في الزراعة التكنولوجيا الحيوية مركز الأبحاث في أكاديمية سينيكا للحصول على المشورة الفنية.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
    2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
    3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
    4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
    5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
    6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
    7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
    8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
    9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
    10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
    11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
    12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
    13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
    14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
    15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
    16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
    17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
    18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
    19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
    20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
    21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
    تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل &quot;Acufection&quot; وتطبيقه لبحوث الجلد
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter