Summary
Denne protokol er en omkostningseffektivt alternativ til ekspression nøgent plasmid-DNA i musehud. Det overordnede mål med protokollen er at levere immunrelaterede gener i hudvæv at afgrænse den funktionelle rolle af et specifikt gen i kutan inflammation.
Abstract
Dysregulering af immunrespons i huden er forbundet med en række menneskelige hudlidelser. Direkte overførsel af immunrelaterede gener i hudvævet er et fascinerende tilgang til at undersøge immunmodulation af kutane inflammation i musemodeller for humane sygdomme. Her præsenterer vi en omkostningseffektiv protokol, leveret nøgent DNA i musehud og fører til transgen ekspression. Fremgangsmåden er opfundet "acufection", der betegner acu punktering-medieret DNA-trans fektion. At udføre acufection blev musehud først infunderes med DNA i phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter prikkes let med et bundt af akupunktur nåle for at lette absorptionen af DNA og transfektion ind i celler. Plasmid-DNA'et formentlig optages af keratinocyt og dendritiske celler (DC'er) i huden og udtrykt til protein. Mekanisk prick med nåle per se bevirkede ikke skader huden eller fremkalde keratinocyt aktivering. udtrykketaf de transficerede gener blev detekteret i huden på både transkriptionelle og translationelle niveauer efter acufection i 2 dage og opretholdt op til 7 dage. Det primære mål for udviklingen af denne acufection metode var at undersøge et hidtil udefineret isoform af IL-15. Anvendelse af denne fremgangsmåde, et alternativt splejset IL-15-isoformen med delvist fjernede exon 7 (IL-15ΔE7) blev udtrykt i huden og behandles efterfølgende med et Toll-lignende receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), at inducere inflammation. Acufection leveret IL-15ΔE7 i huden undertrykt keratinocytproliferation, epidermal tykkelse og neutrofilrekruttering i IMQ-induceret kutan inflammation. Med stigende interesse i at identificere de regulatoriske mekanismer for kutan inflammation, protokollen beskrevet her tilvejebringer en omkostningseffektiv og alsidigt alternativ til genkanonen system eller mikropodning til DNA levering in vivo. Det kan potentielt give opdagelse af funktionen af et hidtil ukendtgen i huden eller til undersøgelse ny behandling for hudsygdomme.
Introduction
Huden er den første linje af vært forsvar. Keratinocytter (KCS) er den vigtigste celletype i huden på mennesker og mus. Som respons på miljømæssige stimuli (f.eks sollys, ilt, kemikalier og patogene invasion), er KCS aktiveres og producere en bred vifte af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner, såsom IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α og GM-CSF 1. Sammen udløse rekruttering af immunceller til huden. Forværret kutan inflammation er ofte forbundet med en række humane sygdomme, herunder akut ektopisk kontaktdermatitis og kronisk T-cellemedieret inflammation (f.eks allergisk kontakteksem og psoriasis) 2. Modulering proinflammatoriske reaktioner i huden ved at hæmme KC aktivering er en plausibel tilgang til behandling af kutan inflammation. Denne protokol beskriver en ny tilgang til transient at udtrykke et cytokingen i epidermis for at studere immune response en følge af en sådan behandling i huden.
Epidermis komponerer den mest overfladiske lag af huden. Det tjener som en fysisk barriere holde eksterne stoffer såsom nukleinsyrer og patogener i at komme ind i de dybere lag af huden. Adskillige nålefri teknikker er blevet fastsat for epidermal DNA-transfer 3, 4. DNA i opløsning eller forbundet med kationiske liposomer eller adenovirusvektorer er direkte påført på epidermis modificeret med teknikker såsom fjernelse af stratum corneum eller behandling med depilating reagens. Fjernelse af forhornet epitel letter DNA krydser epidermal barriere og interaktion med keratinocytter og Langerhans-celler til at inducere immune 5 responser. Mens en stor overflade er til rådighed for DNA-overførsel og denne fremgangsmåde ikke involverer nåle, der er ulemper, herunder kravetfor de store mængder DNA (10 - 100 ug), barske behandling på huden ved stripning, og de inkonsistente resultater i inducere immunrespons i de immuniserede dyr uden DNA levering booster 6. Mikropartikel-medieret intracellulær levering af nøgent DNA til huden har vist sig at være yderst effektiv og reproducerbar til induktion immunrespons 7, 8. En håndholdt genkanon er blevet brugt til at bombardere huden målstedet med plasmid DNA-coatede guldpartikler 2 um diameter i størrelse ved hjælp af tryksat helium luftstrøm 9. Plasmid-DNA'et formentlig optages af KCsand dendritiske celler (DC'er) i huden og proteinet er lokalt udtrykt eller transporteres til drænende lymfeknuder af DC'er 10. Selvom det gen pistol systemet er enkel og kræver begrænset teknisk erfaring, prisen for at udarbejde og levere "DNA bullad "(dvs. guldpulvere, helium gas) og for genkanonen selv har begrænset sin generelle anvendelse. Derudover kravet om en helium gasleveringssystem begrænser nem genkanon transport, når man udfører eksperimenter ved forskellige steder. mikropodning har vist sig at opnå en højere effektivitet af genoverførsel end enkelt injektion og partikelbombardement 11. mikropodning bruger en tatovering pistol at afgive DNA til huden uden brug af partikel perler 11. Oscillerende mikronålene på huden ved hjælp af denne fremgangsmåde sandsynligvis direkte skrabe cellemembranen og dermed overføre DNA til flere celler samtidig. Men smerter forbundet med det store antal injektioner med nåle mm diameter 0,254 er en ulempe.
Her giver vi en alternativ tilgang til DNA levering in vivo. Den "acufection" 12. Mens acufection viser sig at være en nem og mindre demande fremgangsmåde til DNA-afgivelse in vivo, den optimale mængde af DNA til forskellige gener og de tidspunkter at punktere huden skal være omhyggeligt optimerede for at opnå reproducerbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hunmus ved 8 - 12 uger gamle, blev anvendt til denne undersøgelse. C57 / BL6 vildtype (WT) og IL-15 deficient (IL15 - / -) mus blev fremskaffet fra National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan og Taconic Farm, hhv. IL-15-deficiente (IL15 - / -) og IL-15-dominant (IL15 +/- og IL15 + / +) viste en 1: 3-forhold i anden generation fra kors IL15 +/- heterozygoter. Genotype IL15 - / - mus blev bekræftet ved PCR-analyse. Musene blev opretholdt i SPF (SPF) facilitet på Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Alle procedurer dyr, herunder bedøvende materialer og metoder blev udført i overensstemmelse med dyrets protokol godkendt af National Taiwan University College of Medicine og College of Public Health Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (Affidavit af Godkendelse af Animal protokollen 20.130.225).
<p class = "jove_title"> 1. Fremstilling af akupunktur nåleBEMÆRK: Akupunkturnåle er medicinsk udstyr bestående af et håndtag og en nåleende (figur 1A). Diametrene af akupunkturnål varierede fra 0,2 mm (36 G) til 0,35 mm (28 G). Vi udvælger de fineste punkt af nålen for at undgå potentiel stor skade cellen under prikkende huden. Der er 4 forskellige længder af 0,2-mm nål herunder 13 mm (0,5), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) og 50 mm (2,0 in) i længde. Et bundt 10 nåle med 13 mm længde billede bedst komfortabelt greb under oscillerende nålen på C57BL / 6 mus hud. Parametrene kan ændres, hvis fremgangsmåden anvendes på huden af større dyr eller udført af forskere med større hænder.
- Fjern akupunktur nåle fra den sterile, ikke-pyrogene pakke. Placere nåle på en steril afdækning.
- Anvende selvklæbende mærkning tape til at binde 10 nåle sammen ina bundt (figur 1B).
BEMÆRK: De 10 nåle er geometrisk indrettet til at danne en cylinderform. For nemheds skyld, bruge et stykke paraffin film at stabilisere arrangement før påføring af klæbebånd. Sørg for at alle nålen punkter er på samme plan. Anvendelse af en bundt stedet for en enkelt nål letter maksimal DNA infusion ved at forøge kontaktarealet mellem nålene og huden.
2. Fremstilling af en stor mængde og Endotoxin-fri Plasmid-DNA
- Omdanne kemisk kompetente bakterieceller med plasmid-DNA.
- Vælge og pode en enkelt bakteriekoloni i 3 ml LB-medium indeholdende antibiotika og inkuberes ved 37 ° C i en ryster natten over.
- Opskalere kulturen ved fortynding bakteriekulturen ved 1: 100 i 250 ml LB-medium med antibiotika og omrystning natten over ved 37 ° C
- Forberede en stor mængde DNA ved hjælp af en høj kvy, endotoksinfrit plasmidpræparat kit ifølge producentens instruktioner.
BEMÆRK: Acufection protokol kræver høj renhed og en stor mængde plasmid-DNA. Anvendelse af en høj kvalitet, er endotoksinfrit og søjle-oprenset plasmid-DNA anbefales. - Eluere DNA i sterilt vand. Opbevar DNA i små portioner ved -20 ° C indtil klar til acufection.
BEMÆRK: Undgå gentagne fryse-og-tø af DNA for at sikre ensartet plasmid-DNA udtryk. - Fortynd plasmid-DNA til 1 mg / ml i sterilt PBS i acufection.
3. Procedure til Acufection
BEMÆRK: Den optimale mængde DNA og området af mål-hudoverfladen kan variere for forskellige gener og skal optimeres yderligere. Den prikkende kraft og antal gange for at løsne hornlag af huden også kan variere efter tykkelsen huden. skal omhyggeligt bestemmes disse betingelser har vurderet den ekspressionsniveauet af acufected gen transcripts af QRT-PCR.
- Afvej musene og administrere tribromethanol (400 ug pr gm kropsvægt) ved peritoneal injektion.
BEMÆRK: 2,2,2-tribromethanol er en injicerbar bedøvelsesmiddel, der blev almindeligt anvendt i mus. Opløsninger fremstilles ved at opløse et ikke-farmaceutisk kvalitet 2,2,2-tribromethanol (2,5 g) i destilleret vand (200 ml) indeholdende 2,5% af 2-methyl-2-butanol. - Bruge dyrlæge oftalmologisk salve på øjne at forhindre tørhed under anæstesi.
BEMÆRK: bedøvende virkning vil blive induceret i 1 - 2 ud min. Tjek tå knivspids refleks for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi før operation. - Barber dorsale flanke hud og anvende rigtige spørgsmål creme til at opløse keratin proteiner i hårstrået.
BEMÆRK: Anvendelse af rigtige spørgsmål creme til at fjerne hår vil lette infusion af DNA ind i huden. - Bruge vand gennemblødt vatkugler at aftørre hårfjerningsmiddel.
BEMÆRK: hårfjerningsmiddel er opløseligt i vand. Fuldstændig fjernelse af cremen will forhindre en fedtet overflade og sikre en bedre stikkende resultat. - Brug en steril vatpind gennemvædet med 70% ethanol for at desinficere hudoverfladen.
- Mark målområdet (1 cm x 1 cm) på afhåret hud med en forud målt stencil. BEMÆRK: Mærkning målområdet vil bidrage til at anvende nålen bundt op-og-ned inden for et afgrænset område. Dette er vigtigt for at sikre levering af den samme mængde DNA til et specifikt overfladeareal for at minimere eksperiment-til-eksperiment variation.
- Placer en 10 pi dråbe plasmid-DNA (10 ug) på den markerede hud.
BEMÆRK: Mængden af DNA til acufection varierer med forskellige gener og typen af ekspressionsvektor. Mængden af DNA, der anvendes skal titreres forsigtigt før udførelse af eksperimentet af interesse. Den 10 pi er en lille flydende drop og det sidder godt på det barberede og skrabet hud uden at rulle ned, mens prikkende. Omfatter en kontrolgruppe af mus behandlet med 10 pi tom vektor-DNA til sammenligning med mus, encufected med studiet genet. - Hold akupunkturnål bundt (figur 1 B) og prik den markerede overflade med en op-og-ned bevægelse for 100 gange eller indtil fugten fra DNA i PBS på huden forsvinder. BEMÆRK: Nogle rødme i huden overflade kan forekomme. Undgå at dybe nedskæringer, der bløder. Antallet af op-og-ned stikkende bevægelser på hudoverfladen er operativt bestemmes, når fugten fra DNA i PBS (10 pi) forsvinder på huden. Vi besluttede 100 gange i 30 s, fordi det har givet de mest konsistente resultater fra acufection-leverede gener. Hvis relevant, kan nålene genanvendes til op til 6 target hud stikker (1 cm x 1 cm hver). Skyl nålene i 70% ethanol og PBS mellem acufection. Skift til nye nåle, når de er kedelig eller for forskellige plasmid-DNA for at undgå krydskontaminering.
- Placer acufected mus på en varmepude at opretholde kroppens temperatur indtil opvågning.
- Retur mus til deres bur, når de hargenvandt tilstrækkelig bevidsthed. Bemærk: Opbevar acufected mus i separat bur (mindre end 5 dyr pr bur) fra buret af un-acufected mus.
- Put vand flaske på plads og returnere buret til IVC (individuelt ventilerede bur) rack.
4. Postoperativ Care
- For de første 48 timer efter proceduren, nøje overvåge mus for enhver ubehag herunder adfærdsændringer (rastløshed, ophidselse eller spiseforstyrrelse) eller unormalt udseende (ru pels eller foroverbøjet kropsholdning).
5. Imiquimod (IMQ) Behandling af IL-15ΔE7-acufected hud
BEMÆRK: Transkriptionel ekspression og proteinproduktion af acufected gen er påviselige på dag 3. Mus acufected med plasmid af interesse kan behandles med forskellige typer af stimulanser 3 dage efter transfektion. Vi belyser her ved at behandle IL-15ΔE7-acufected musehud med IMQ creme. IMQ er en imidazoquinolin amin godkendt feller behandling af eksterne genitale og perinatale vorter 13. Topisk IMQ behandling er vist at inducere humane psoriasislignende hudlidelser i mus med manifestationen af skællende hud, epidermal proliferation og dermal neutrofil infiltration 12, 14, 15.
BEMÆRK: Plasmidvektoren indeholdt fuldlængde muse IL-15-cDNA, reguleret af forlængelsesfaktor-1 α (pEF), flankeret med et IL-2 signalpeptidet og et FLAG-mærke ved C-terminalen (pEF-IL 15, 5859 basepar), som blev konstrueret som beskrevet af Bamford et al. 16. Plasmidet anvendes som en IL-15 skabelon til at slette de første 16 aminosyrer ved resterne 33 - 48 i exon 7 af IL-15 genet for IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 basepar) ved SOE (syntese ved overlap extension) PCR-metode 17. Bakteriekolonier, der var med succestransformeret med IL-15ΔE7 blev verificeret ved restriktionsenzymfordøjelse og efterfulgt af DNA-sekventering 12, 18. En stor mængde af endotoksin-frit plasmid-DNA blev fremstillet som beskrevet i protokollen trin 2.
- Bedøver acufected mus ved intraperitoneal injektion af tribromethanol (400 ug pr gm kropsvægt) og anvende dyrlæge oftalmologisk salve på øjne at forhindre tørhed under anæstesi. Tjek tå knivspids refleks for at sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi før starten på de operative procedurer. BEMÆRK: Da en 2 cm x 2 cm hud vil blive behandlet for IMQ er 2 doser af pIL-15ΔE7 plasmid-DNA (10 ug i 10 pi PBS per dosis) acufected på 2 målsteder (1 cm x 1 cm hver).
- Mark flanke hud (2 cm x 2 cm), der dækker acufected område.
- Brug Q-tip applikator til topisk anvendelse IMQ creme på det markerede overfladeareal. Bemærk: trin 5.1 udføres kun for den første dosis (60 mg / dosis).De næste på hinanden følgende doser anvendes på ikke-bedøvede mus.
- Dokument ændringerne i IMQ-behandlet dorsale hud dagligt med en high definition videokamera. Bemærk: Én person holder musen, mens en anden optager. Stadig billeder er skudt og redigeret på et senere tidspunkt.
- Aflive mus ved injektion af en overdosis af tribromethanol (800 ug pr gm kropsvægt) efterfulgt af cervikal dislokation på dag 4 eller dag 7 efter IMQ behandling. Huden bliver skåret ud og behandlet (trin 4,1 - 4.5).
6. homogenat af musehud
- Brug et par kirurgiske sakse til at lave en vandret snit fra haleroden. Fortsæt bilateralt til bunden af bagben og fortsætte med at skære lodret langs flanken til bunden af forben.
- Træk forsigtigt huden fra det underliggende væv fra bageste til den forreste. Brug en saks til at afskære den dorsale hud. Placer huden på en steril petriskål.
- Brug en skalpel for at udskære målhuden og fryse det i flydende nitrogen umiddelbart. Bemærk: Det samme størrelse acufected hud uden (1 cm x 1 cm) eller med IMQ behandling (2 cm x 2 cm) er fastgjort til hver mus for at minimere eksperiment-til-eksperiment variationer.
- Placer frosne hud væv i centrum for en forkølet 2-rums mørtel med håndtag og en støder. Brug en ledende hammer på mørtel at pulverisere vævet.
- Hurtigt placere det pulveriserede væv til et nyt rør indeholdende 500 pi cellelysereagens til RNA-ekstraktion eller til et rør indeholdende 50 pi PBS og 1x protease inhibitor cocktail til opnåelse proteinlysat.
7. H & E og immunhistokemisk farvning af hud Sektion
- Placer hudvæv i en kassette og nedsænke det i 4% paraformaldehyd natten over.
- Indkapsle og vævssnit, som i vores tilfælde blev udført ved Pathology Laboratory ved LAC, NTU. Bemærk: Sektionen skæres ved en tykkelse på 5 um. Sted væv sections onto positivt ladede dias.
- Opvarm objektglassene ved 65 ° C i 15 min.
- Placer dias i en farvning rack. Fordybe stativet i tilsvarende tank indeholdende xylen erstatning for 5 min to gange efterfulgt af sekventiel nedsænkning i 100%, 95%, 80%, 75%, 60% og 50% ethanol (5 min hver) for rehydrering. Fordyb dias i postevand i 3 min før farvning.
- Udfør hæmatoxylin og eosinfarvning. Bemærk: H & E-farvning blev udført efter anmodning på Pathology Laboratory ved LAC, NTU.
- Til immunhistokemisk farvning, blokere sektion med blok opløsning ved stuetemperatur i 5 minutter for at reducere ikke-specifik baggrundsfarvning. Bemærk: Blokken opløsning kommercielt udviklet med immunfarvningsmønstre teknikker. Intet dyr serum indeholdt i dette produkt.
- Dyp slæden i PBS for at skylle ud blokken opløsning.
- Fortynd blokken opløsning i PBS ved 1:10 og der tilsættes 2% føtalt bovint serum (FBS) (fortyndingsmiddelopløsning).
- Farv en seriel sektion i samme løb med den samme opløsning udelade det primære antistof til kontrol for ikke-specifik binding af det sekundære antistof.
8. Foto og analyse af Stained vævssnit
- Visualisere H & E-farvede og IHC vævssnit under et lyst felt mikroskop. Tag billeder med charge coupled device (CCD) kamera fastgjort til mikroskopet. for qKVANTITATIV analyse, kan imaging software bruges
- Scan hele farvede sektioner ved hjælp af en scanscope med en 20X objektiv.
- Måle epidermal tykkelse inden for en 1-mm segment af overhuden og tælle antallet af Ki67-immunreaktive celler i segmentet.
BEMÆRK: Kvantitativ analyse udføres ved hjælp af mikroskopi automation & billedanalyse-software. Epidermal tykkelse er defineret ved afstanden mellem det basale lag og det yderste lag af epidermis. - Tæl antallet af Ly6G-immunreaktive celler i det dermale område (230 x 270 um 2 rektangel) umiddelbart under topisk IMQ-behandlet hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens nogle rødme var tydelig inden for den første time efter prikning med akupunktur nåle, huden blokerede på dag 2 og blev observeret nogen negativ hudreaktion op til dag 7 efter prikning (figur 2A). Nål stikkende induceret meget lavt niveau af epidermal orthokeratosis og minimal dermal infiltration af H & E-analyse sammenlignet med ubehandlet hud (figur 2B). Den epidermale tykkelse (figur 2C) og antallet af Ki67 + -celler (figur 2D) var sammenlignelige mellem nåle-prikkes og ubehandlet hud, hvilket viser, at akupunkturnål-prikket hud forårsagede ikke mærkbar vævssprængning eller cellulær proliferation i epidermis. Sammenlignet med sprøjtenålen (1,067 mm i diameter) 12, prikkende med akupunktur nåle inducerede reducerede niveauer af udtrykkene for chemokin CXCL-1 og proinflammatoriske cytokin IL-6 på dag 2, der fortsatte med at falde på dag 5 (figur 3A). At validere ekspressionen af acufected transgen i musehud blev et plasmid, der udtrykker IL-15-cDNA acufected i huden af IL-15-deficiente C57BL / 6 (IL-15 KO) mus. Selv om der blev observeret lave niveauer af transkription fra acufected plasmid-DNA i afhåret hud, oscillation med akupunktur nåle forøgede niveauet af gentranskription (figur 3B). IL-15 produktion blev detekteret på dag 2 og forblev stabil op til dag 7 (figur 3C). Disse resultater viser, at acufection effektivt tilfører plasmid-DNA'et og muliggør ekspression af det kodede protein i huden uden at inducere overdreven aktivering keratinocyt.
WT mus blev acufected med et plasmid, der koder for IL-15ΔE7. Mus udtrykte IL-15ΔE7 mRNA og proteinet indtil 3dage efter transfektion (figur 4A). Musene blev derefter topisk behandlet med IMQ fløde på dag 3. Mens IMQ behandling inducerede sølvfarvede flager i kontrol WT mus blev IMQ inducerede sølvfarvede flager reduceret i IL-15ΔE7 acufected WT mus (figur 4B). Interessant ekspression af acufected IL-15ΔE7 inhiberede signifikant Ly6G + neutrofil infiltration i IMQ-behandlet hud sammenlignet med unacufected WT huden (figur 4C) 12. Ved acufection demonstrerede vi den nye funktion af IL-15ΔE7 i huden. IL-15ΔE7 modulerer IMQ-inducerende neutrofil infiltration.
Figur 1. Illustration af akupunktur nåle. (A) akupunkturnål (36 G x 0,5" ) er sammensat af enhåndtere og en nåleende. (B) Ti akupunktur nåle er bundet i et bundt under anvendelse af klæbebånd. Længden af bundtet er ca. 4 cm målt ved lineal (nederste panel). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Prikkende af akupunktur nåle ikke forårsager Mærkbar Hud Skader eller Keratinocyt Aktivering. (A) Triple steder markeret med grå firkanter på barberet og afhåret flanke hud mus blev prikket 100 gange hver af akupunktur nåle. Fotografier blev taget på den første time og op til 7 dage efter prikkende at overvåge hudskader. Barberet og afhåret hud uden nål stikkende blev anvendt som kontrol. <strong> (B) H & E-analyse af formalin-fikserede, paraffinindlejrede hudsektioner fra ubehandlet eller nål-prikkes musehud. Målestok: 100 um. (C) En millimeter-segment af H & E-farvede snit fra ubehandlede eller nål-prikket musehud blev valgt til måling af epidermal tykkelse (afstanden fra basale til det yderste lag). Hver søjle repræsenterer middelværdien af epidermal tykkelse målt fra 3 hudsektioner. Fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Betydningen af forskellen mellem grupperne blev testet ved uparret Students t-test. (D) Serielle sektioner af de samme prøver blev farvet med anti-Ki67 til immunohistokemisk analyse. Hver søjle repræsenterer middelværdien af Ki67 + -celler lokaliseret i hver 150 um-epidermis længde pr 1 mm segment. Fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Betydningen af forskellen mellem grupper blev testet ved to-vejs ANOVA follskylder Bonferroni post hoc-test. (ns: ikke signifikant). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Acufection Effektivt udtrykker proteinet af interesse uden at forårsage Mærkbar Keratinocyt Aktivering. (A) barberet og afhåret flanke hud blev efterladt ubehandlede (NTC), slibning med 1,067 mm diameter (19 G) sprøjtenål (Syr.) Eller prikkende 100 gange af akupunktur nåle (ACU.). De transkriptionelle niveauer af CXCL-1 og IL-6 på dag 2 og dag 5 blev målt ved QRT-PCR (n = 3). (B) barberet og afhåret hud af IL-15-deficiente mus blev topisk påført med en dråbe af et plasmid DNA, der udtrykker IL-15 without (depilation) eller med akupunkturnål stikkende (depilation + prick). Transkription af IL-15 i hver gruppe på dag 2 blev målt ved TaqMan QRT-PCR. Transkription af IL-15 kunne ikke påvises i PBS-kontrol (NTC) af IL-15-deficiente mus. (C) IL-15-produktion fra IL-15-deficiente mus hud, der var ubehandlet eller IL-15-acufected til forskellige dage (én væv for hver dag) blev målt ved IL-15 ELISA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Demonstration af IL-15ΔE7 Dæmper IMQ-induceret sølvfarvede skællende hud og Hæmmer neutrofil infiltration. (A) Den transkriptionelle niveau og proteinproduktion af IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; E7) eller tom vektor-kontrol (WT / pEmpty) hud blev målt ved QRT-PCR og ELISA (n = 2, hvert tidspunkt), hhv. (B) Tomme vektor- eller IL-15ΔE7-acufected flanke hud på dag 3 blev topisk behandlet med IMQ fløde (60 mg). Fotografier af WT / pEmpty og WT / pIL-15ΔE7 muse flanke på dag 6 efter IMQ behandling. (C) Hud sektioner fra WT / pEmpty eller WT / Pil-15ΔE7 mus efter IMQ behandling på dag 3 og 6 blev farvet med anti-Ly6G antistof og optalt. Hver søjle repræsenterer middelværdien af Ly6G + -celler fra 4 IMQ-behandlede mus. Fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Betydningen af forskellen mellem grupperne blev testet ved to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc-test. Paneler A og C er ændret med tilladelse fra Journal of Investigative Dermatology, licensnummer 3901890227597. Klikher for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trin for at sikre ekspressionen af acufected plasmid-DNA er til jævnt oscillere og løsne hornlag af huden. Samtidig med at skubbe nåle forsigtigt uden at skære huden skal kraften være hårdt nok til at nedtrykke overfladen. For at lette absorption af DNA i 10 pi opløsning på en 1 cm x 1 cm overfladeareal, bør nåle oscillere op-og-ned til omkring 100 gange på 30 s. Kan man bestemme den kraft, der skal punktere huden og ved at notere det antal gange, der er nødvendige til opnåelse af bedste ekspressionsniveauet for acufected gen.
Modifikation for mængden af plasmid-DNA anvendes til at nå et tilfredsstillende niveau af ekspression efter acufection kan være nødvendig, fordi det kan variere for forskellige gener. bør udføres titreringsforsøg for at bestemme den optimale mængde af plasmid-DNA, der skal anvendes inden forsøget samt. Resultater fra kvantitativ RT-PCR-analyse vil hjælpe med til at bestemme optimal mængde plasmid-DNA og den bedste tilstand til at opnå reproducerbare resultater.
Den præcise mekanisme af acufection proces uafklaret. Mens transkription fra topisk leveret plasmid-DNA fandt sted i barberet og afhåret hud på lavt niveau, prikkende ved akupunktur nåle forbedrede transfektionseffektivitet (figur 3B). Analogt mikropodning protokol, hvor flere perforationer med tatovering pistol 11 er acufection leveret plasmid-DNA sandsynligvis lettes ved skrab af cellemembran keratinocytter og hårsækkene 19, 20. Stimulationer af epidermis efter hårfjerning, depilating reagens og nål svingning kan inducere keratinocyt aktivering til en vis grad og yderligere forbedre DNA-optagelse af Langerhans og DC'er 6. En begrænsning ved denne protokol er, at mængden af plasmid-DNA optagesaf celler kan ikke styres nøjagtigt. Vi har ikke foreslå at bruge denne metode til at behandle et stort hudområde. For at minimere variationer i ekspressionsniveauerne af den leverede gen blandt eksperimenter, bør volumenet af DNA-opløsningen og størrelsen af target hudoverfladen fastsættes for det samme sæt af eksperimenter. At generere reproducerbare resultater, er det tilrådeligt, at replikate eksperimenter skal udføres af den samme person.
Med hensyn til genpistolanordning og mikropodning, at anvendelsen af et bundt af akupunktur nåle levere nøgent DNA er billig. Procedurerne er også ligetil. Det kræver meget lidt teknisk erfaring at følge acufection protokol. Acufection forårsager minimal traume for dyr, og ingen vægttab findes efter operationen. Niveauet af smerte er lav som bedømt ved fravær af væsentlige adfærdsændringer efter acufection drift.
Sammenfattende anvendelse akupunktur nåle til at løsnehornlag af huden for DNA-optagelse ved værtsceller tilvejebringer en økonomisk alternativ fremgangsmåde til at udtrykke et protein i musehud. Et bredt spektrum af immun-relaterede gener er endnu ikke funktionelt karakteriseret i huden 21, og dette understreger behovet for en hurtig undersøgelse af et hidtil ukendt gen på huden. Anvendelse af denne metode kan man let bestemme, om produktet af genet af interesse har nogen hidtil ukendt funktion. Denne acufection protokol giver en bekvem og realistisk værktøj til nye opdagelser i modulerende immunrespons til at helbrede kutan sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser til at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af bevilling fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MEST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Vi takker Drs. Betty Wu-Hsieh og Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni på Stanford University og Dr. Peter Hoffmann ved University of Hawaii for at læse manuskriptet, Yun Chien på NTU for teknisk assistance, og Dr. Wen-Chi Wei på landbrug bioteknologi Research center ved Academia Sinica for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
