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Immunology and Infection

"Acufection" और त्वचा अनुसंधान करने के लिए अपने आवेदन के द्वारा एक आर्थिक डीएनए वितरण प्रणाली का विकास

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस त्वचा में नग्न प्लाज्मिड डीएनए व्यक्त करने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है। प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य त्वचीय सूजन में एक विशिष्ट जीन की कार्यात्मक भूमिका चित्रित करने के लिए त्वचा के ऊतकों में प्रतिरक्षा से संबंधित जीन प्रदान करने के लिए है।

Abstract

त्वचा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अनियंत्रण कई मानव त्वचा विकारों के साथ जुड़ा हुआ है। त्वचा के ऊतकों में प्रतिरक्षा संबंधित जीन का सीधा हस्तांतरण एक आकर्षक दृष्टिकोण मानव रोगों के माउस मॉडल में त्वचीय सूजन की प्रतिरक्षा मॉडुलन जांच करने के लिए है। यहाँ हम एक लागत प्रभावी प्रोटोकॉल है कि माउस त्वचा में नग्न डी एन ए को जन्म दिया और ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है प्रस्तुत करते हैं। विधि "acufection" गढ़ा है, एसीयू पंचर की मध्यस्थता डीएनए ट्रांस fection को संकेतित करते। acufection करने के लिए, माउस त्वचा पहले फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में डीएनए के साथ संचार किया गया था और उसके बाद डीएनए के अवशोषण और कोशिकाओं में अभिकर्मक की सुविधा के लिए एक्यूपंक्चर सुइयों का एक बंडल के साथ हल्के से चुभ। प्लाज्मिड डीएनए शायद keratinocyte और त्वचा में वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) द्वारा लिया और प्रोटीन में व्यक्त किया जाता है। सुई से प्रति के साथ मैकेनिकल चुभन त्वचा को नुकसान का कारण या keratinocyte सक्रियण प्रेरित नहीं किया। भावट्रांसफ़ेक्ट जीनों के 2 दिनों के लिए acufection निम्नलिखित दोनों ट्रांस्क्रिप्शनल और अनुवादकीय स्तरों पर त्वचा में पता चला और 7 दिन तक बनाए रखा गया था। इस acufection विधि के विकास के लिए प्राथमिक लक्ष्य आईएल 15 के एक पहले से अपरिभाषित isoform जांच करने के लिए किया गया था। इस विधि, आंशिक रूप से नष्ट कर दिया एक्सॉन 7 (आईएल 15ΔE7) के साथ वैकल्पिक रूप से spliced ​​आईएल 15 isoform उपयोग कर रहा था त्वचा में व्यक्त किया और बाद में एक टोल की तरह रिसेप्टर 7 (TLR7) एगोनिस्ट, Imiquimod (IMQ) के साथ इलाज, सूजन प्रेरित करती थीं। Acufection वितरित त्वचा में आईएल 15ΔE7 IMQ प्रेरित त्वचीय सूजन में keratinocyte प्रसार, एपिडर्मल मोटाई और न्युट्रोफिल भर्ती को दबा दिया। त्वचा संबंधी सूजन के नियामक तंत्रों की पहचान करने में रुचि वृद्धि के साथ, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित जीन बंदूक प्रणाली या विवो में डीएनए प्रसव के लिए microseeding करने के लिए एक लागत प्रभावी और बहुमुखी विकल्प प्रदान करता है। यह संभवतः एक उपन्यास के समारोह की खोज के लिए अनुमति दे सकतात्वचा में या त्वचा संबंधी रोगों के लिए नए उपचार की जांच के लिए जीन।

Introduction

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त्वचा मेजबान रक्षा की पहली पंक्ति है। केरेटिनकोशिकाएं (सी एस) मनुष्यों और चूहों की त्वचा में प्रमुख सेल प्रकार हैं। पर्यावरण उत्तेजनाओं (जैसे सूरज की रोशनी, ऑक्सीजन, रसायन और रोगजनक आक्रमण) के जवाब में, के सी एस सक्रिय और proinflammatory साइटोकिन्स और इस तरह के आईएल 8, आईएल -6, आईएल 1α, आईएल 1β, TNF- रूप chemokines की एक विस्तृत सरणी का उत्पादन कर रहे हैं α और जीएम-सीएसएफ 1। साथ में वे त्वचा के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती ट्रिगर। बहुत बिगड़ त्वचीय सूजन अक्सर तीव्र अस्थानिक संपर्क जिल्द की सूजन और क्रोनिक टी सेल की मध्यस्थता सूजन (जैसे एलर्जी संपर्क जिल्द की सूजन और सोरायसिस) 2 सहित कई मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है। केसी सक्रियण बाधा त्वचा में समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं modulating एक सुखद दृष्टिकोण त्वचीय सूजन के इलाज के लिए है। यह प्रोटोकॉल एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करता है क्षणिक प्रतिरक्षा रेस अध्ययन करने के लिए बाह्य त्वचा में साइटोकाइन जीन व्यक्त करने के लिएponse त्वचा में इस तरह के एक उपचार के लिए परिणामी।

एपिडर्मिस त्वचा का सबसे ऊपरी सतह तैयार करता। यह एक शारीरिक बाधा ऐसे न्यूक्लिक एसिड और त्वचा की गहरी परतों में प्रवेश करने से रोगज़नक़ों के रूप में बाहरी पदार्थ रखने के रूप में कार्य करता है। कई सुई से मुक्त तकनीक एपिडर्मल डीएनए हस्तांतरण 3, 4 के लिए स्थापित किया गया है। समाधान में डीएनए या धनायनित लिपिड या एडीनोवायरस वैक्टर के साथ जुड़े सीधे इस तरह परत कॉर्नियम को हटाने या अभिकर्मक depilating साथ इलाज के रूप में बाह्य त्वचा तकनीक के साथ संशोधित करने के लिए लागू किया गया है। श्रृंगित उपकला की हटाने डीएनए एपिडर्मल बाधा और केरेटिनकोशिकाओं और Langerhans कोशिकाओं के साथ बातचीत को पार 5 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करने की सुविधा। जबकि एक बड़ा सतह क्षेत्र डीएनए हस्तांतरण के लिए उपलब्ध है और इस दृष्टिकोण सुइयों को शामिल नहीं करता है, वहाँ आवश्यकता सहित नुकसान कर रहे हैंअलग करना द्वारा - (100 माइक्रोग्राम 10), त्वचा पर कठोर उपचार, और डीएनए वितरण बूस्टर 6 बिना प्रतिरक्षित पशुओं में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्प्रेरण में असंगत परिणाम डीएनए की एक बड़ी मात्रा के लिए। Microparticle की मध्यस्थता त्वचा के लिए नग्न डीएनए के intracellular वितरण अत्यधिक कुशल और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 7, 8 उत्प्रेरण के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए दिखाया गया है। एक हाथ से आयोजित किया जीन बंदूक प्लाज्मिड डीएनए लेपित सोने के कणों दबाव हीलियम हवा का प्रवाह 9 के माध्यम से आकार में 2 सुक्ष्ममापी व्यास के साथ त्वचा लक्ष्य साइट बौछार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्लाज्मिड डीएनए शायद त्वचा में KCsand वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) द्वारा लिया जाता है और प्रोटीन स्थानीय रूप से व्यक्त किया जाता है या डीसी 10 से draining लिम्फ नोड्स के लिए ले जाया जा रहा है। हालांकि जीन बंदूक प्रणाली सरल है और सीमित तकनीकी अनुभव, तैयारी और "डीएनए बुल देने के लिए लागत की आवश्यकता हैचलो "(यानी सोने पाउडर, हीलियम गैस) और जीन बंदूक के लिए ही अपने सामान्य आवेदन सीमित है। इसके अतिरिक्त, एक हीलियम गैस वितरण प्रणाली के लिए आवश्यकता जीन बंदूक परिवहन में आसानी को सीमित करता है जब प्रयोगों विभिन्न स्थानों पर आयोजित की जाती हैं। Microseeding एक इंजेक्शन और कण बमबारी 11 से जीन स्थानांतरण के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के प्रदर्शन किया गया है। Microseeding कण मोती के उपयोग के बिना त्वचा के लिए डीएनए वितरित करने के लिए एक टैटू बंदूक का उपयोग करता है 11। दोलन त्वचा इस दृष्टिकोण का उपयोग करने पर microneedles की संभावना है सीधे कोशिका झिल्ली को स्क्रैप और इस तरह एक ही समय में कई कक्षों के लिए डीएनए हस्तांतरण। हालांकि, 0.254 मिमी व्यास सुइयों के साथ इंजेक्शन की बड़ी संख्या के साथ जुड़े दर्द एक नुकसान है।

यहाँ हम विवो में डीएनए वितरण लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। "Acufection" 12 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था। acufection साबित होता है जबकि एक आसान और कम dema होने के लिएविवो में डीएनए प्रसव के लिए विधि nding, विभिन्न जीनों और कई बार त्वचा चुभन के लिए डीएनए की सर्वोत्कृष्ट मात्रा ध्यान से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना है।

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Protocol

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8 में मादा चूहों - उम्र के 12 सप्ताह के इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया। C57 / BL6 जंगली प्रकार (WT) और आईएल -15 की कमी (Il15 - / -) चूहों राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (NLAC), ताइवान और Taconic खेत से क्रमशः खरीदे गए थे। Il15 +/- heterozygotes के पार से दूसरी पीढ़ी में 3 अनुपात: आईएल 15 की कमी (Il15 - - /) और आईएल 15-प्रमुख (Il15 +/- और Il15 + / +) एक 1 से पता चला है। Il15 के जीनोटाइप - / - चूहों पीसीआर विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई। चूहे प्रयोगशाला पशु केंद्र (एलएसी), नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय (NTU) मेडिसिन के कॉलेज में विशिष्ट रोगजन नि: शुल्क (एसपीएफ) सुविधा में बनाए रखा गया था। संवेदनाहारी सामग्री और तरीकों सहित सभी पशु प्रक्रियाओं नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन एवं जन स्वास्थ्य संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) (पशु प्रोटोकॉल 20,130,225 का अनुमोदन का शपथ पत्र) के कॉलेज द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

<p class = "jove_title"> 1। एक्यूपंक्चर सुइयों की तैयारी

नोट: एक्यूपंक्चर सुई चिकित्सा एक हैंडल और एक सुई अंत (चित्रा 1 ए) से बना उपकरण होते हैं। एक्यूपंक्चर सुई के व्यास 0.35 मिमी (28 जी) के लिए 0.2 मिमी (36 जी) से लेकर। हम सुई के बेहतरीन बिंदु का चयन त्वचा चुभन के दौरान संभावित अतिरिक्त कोशिका क्षति से बचने के लिए। वहाँ 13 मिमी (0.5 में), 25 मिमी (1.0 में), 40 मिमी (1.5 में) और लंबाई में 50 मिमी (2.0 में) सहित 0.2-मिमी सुई के 4 समान नहीं हैं। 13 मिमी लंबाई के साथ 10 सुइयों का एक बंडल C57BL 6 / माउस त्वचा पर सुई दोलन के दौरान सबसे अच्छा आरामदायक पकड़ प्रदान की है। अगर विधि बड़े जानवरों की त्वचा के लिए आवेदन किया या बड़ा हाथों से शोधकर्ताओं द्वारा किया जाता है मापदंडों को संशोधित किया जा सकता है।

  1. बाँझ, गैर ज्वरकारक पैकेज से एक्यूपंक्चर सुई निकालें। एक बाँझ कपड़ा पर सुइयों रखें।
  2. मैं एक साथ 10 सुइयों बाध्य करने के लिए चिपकने वाला लेबल टेप का प्रयोग करेंna बंडल (चित्रा 1 बी)।
    नोट: 10 सुइयों ज्यामितीय एक सिलेंडर आकार के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं। सुविधा के लिए, तेल फिल्म के एक टुकड़े का उपयोग चिपकने वाला टेप लागू करने से पहले व्यवस्था को स्थिर करने के। सभी सुई अंक एक ही तल पर हैं सुनिश्चित करें। एक एकल सुई के बजाय एक बंडल का उपयोग सुइयों और त्वचा के बीच संपर्क क्षेत्र में वृद्धि से अधिक से अधिक डीएनए अर्क की सुविधा।

2. एक बड़ी राशि की तैयारी और अन्तर्जीवविष मुक्त प्लाज्मिड डीएनए

  1. प्लाज्मिड डीएनए के साथ रासायनिक सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं रूपांतरण।
  2. का चयन करें और पौंड मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं युक्त के 3 एमएल में एक भी जीवाणु कॉलोनी टीका और रात भर एक शेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पौंड माध्यम के 100 से 250 में एमएल और 37 डिग्री पर रात में मिलाते हुए सी: 1 पर बैक्टीरियल संस्कृति कमजोर द्वारा संस्कृति पैमाने
  4. एक उच्च गुणवत्ता का उपयोग करके डीएनए के एक भारी मात्रा में तैयार करेंy, अन्तर्जीवविष मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट निर्माता के निर्देशों के।
    नोट: Acufection प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता और प्लाज्मिड डीएनए की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। एक उच्च गुणवत्ता का प्रयोग करें, अन्तर्जीवविष मुक्त और कॉलम-शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए की सिफारिश की है।
  5. बाँझ पानी में डीएनए elute। -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में स्टोर डीएनए acufection के लिए तैयार है जब तक।
    नोट: डीएनए के दोहराया फ्रीज और पिघलाव बचें संगत प्लाज्मिड डीएनए अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए।
  6. acufection के लिए बाँझ पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल के लिए प्लाज्मिड डीएनए पतला।

3. Acufection करने की प्रक्रिया

नोट: डीएनए की सर्वोत्कृष्ट मात्रा और लक्ष्य त्वचा की सतह के क्षेत्र विभिन्न जीनों के लिए अलग-अलग हो और आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। चुभन बल और समय की संख्या त्वचा की सींग का बना हुआ परत ढीला भी त्वचा घनत्व के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इन शर्तों को ध्यान से acufected जेने ट्रांसक्री की अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के बाद निर्धारित किया जाना चाहिएQRT- पीसीआर द्वारा अंक।

  1. चूहों का वजन और peritoneal इंजेक्शन द्वारा tribromoethanol (प्रति ग्राम शरीर के वजन 400 माइक्रोग्राम) के लिए प्रशासन।
    ध्यान दें: 2,2,2-tribromoethanol एक इंजेक्शन संवेदनाहारी एजेंट है कि आमतौर पर चूहों में इस्तेमाल किया गया था है। समाधान आसुत जल (200 एमएल) 2 मिथाइल-2-butanol का 2.5% युक्त एक गैर दवा ग्रेड 2,2,2-tribromoethanol (2.5 ग्राम) भंग से बनते हैं।
  2. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक आंखों मरहम का प्रयोग करें।
    नोट: - 2 मिनट एनेस्थेटिक प्रभाव 1 में प्रेरित किया जाएगा। पैर के अंगूठे चुटकी पलटा चेक ऑपरेशन से पहले संज्ञाहरण की गहराई पर्याप्त सुनिश्चित करने के लिए।
  3. पृष्ठीय पार्श्व त्वचा दाढ़ी और बाल शाफ्ट में केरातिन प्रोटीन भंग करने के लिए लोमनाशक क्रीम लागू होते हैं।
    नोट: बाल हटाने के लिए लोमनाशक क्रीम का प्रयोग त्वचा में डीएनए के अर्क सुविधा होगी।
  4. पानी से लथपथ कपास गेंदों का प्रयोग करें लोमनाशक क्रीम बंद साफ करने के लिए।
    ध्यान दें: लोमनाशक क्रीम पानी में घुलनशील है। क्रीम Wil को पूरी तरह निकालाएल एक चिकना सतह रोकने के लिए और एक बेहतर चुभन परिणाम सुनिश्चित करते हैं।
  5. त्वचा की सतह कीटाणुरहित करने के लिए एक बाँझ कपास पट्टी 70% इथेनॉल में भिगो का प्रयोग करें।
  6. मार्क लक्षित क्षेत्र (1 सेमी x 1 सेमी) एक पूर्व मापा जाता स्टेंसिल साथ depilated त्वचा पर। नोट: लक्ष्य साइट अंकन ऊपर-नीचे एक परिभाषित क्षेत्र के भीतर सुई बंडल लागू करने के लिए मदद मिलेगी। इस प्रयोग करने के लिए प्रयोग की विविधता को कम करने के लिए एक विशिष्ट सतह क्षेत्र के लिए डीएनए के एक ही राशि का वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  7. उल्लेखनीय त्वचा पर प्लाज्मिड डीएनए (10 माइक्रोग्राम) के एक 10 μL बूंद रखें।
    नोट: acufection के लिए डीएनए की राशि विभिन्न जीनों और अभिव्यक्ति वेक्टर के प्रकार के साथ बदलता रहता है। इस्तेमाल किया डीएनए की मात्रा को ध्यान से ब्याज की प्रयोग आयोजन करने से पहले titrated किया जाना चाहिए। 10 μL एक छोटा सा तरल ड्रॉप है और यह नीचे रोलिंग जबकि चुभन बिना मुंडा और depilated त्वचा पर अच्छी तरह से बैठता है। 10 μL खाली वेक्टर डीएनए के साथ इलाज चूहों के एक नियंत्रण समूह चूहों एक साथ तुलना करने के लिए शामिल करेंअध्ययन जीन के साथ cufected।
  8. एक्यूपंक्चर सुई बंडल (चित्रा 1 बी) पकड़ो और 100 बार के लिए या पीबीएस में डीएनए से नमी पर त्वचा गायब हो जाता है जब तक एक अप-और-डाउन गति के साथ चिह्नित सतह चुभन। नोट: त्वचा की सतह से कुछ लाली हो सकती है। कटौती है कि खून बहाना बनाने से बचें। त्वचा की सतह पर गतियों चुभन ऊपर-नीचे की संख्या operably निर्धारित जब पीबीएस में डीएनए से नमी (10 μL) त्वचा पर गायब हो जाता है है। हम 30 सेकेंड में 100 गुना का फैसला किया है, क्योंकि यह acufection वितरित जीन से सबसे सुसंगत परिणाम दे दी है। यदि लागू हो, सुइयों 6 लक्ष्य त्वचा चुभन (1 सेमी x 1 सेमी प्रत्येक) के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। 70% इथेनॉल और पीबीएस acufection के बीच में सुई रिंस करें। नई सुइयों के लिए परिवर्तित करें जब वे सुस्त या अलग प्लाज्मिड डीएनए पार संदूषण से बचने के लिए कर रहे हैं।
  9. एक हीटिंग पैड पर acufected चूहों रखें शरीर का तापमान जाग जब तक बनाए रखने के लिए।
  10. उनके पिंजरे चूहों लौटें वे जबवापस पा ली पर्याप्त चेतना। नोट: अलग पिंजरे में acufected चूहों रखें अन-acufected चूहों के पिंजरे से (कम से कम 5 पिंजरे प्रति जानवरों)।
  11. जगह में पानी की बोतल रखो और आईवीसी (व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरे) रैक करने के लिए पिंजरे लौटने।

4. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. प्रक्रिया के बाद पहले 48 घंटे के लिए, बारीकी से व्यवहार में परिवर्तन (बेचैनी, आंदोलन या खाने विकार) या असामान्य उपस्थिति (किसी न किसी बाल कोट या झुके मुद्रा) सहित किसी भी असुविधा के लिए चूहों की निगरानी।

5. Imiquimod (IMQ) आईएल 15ΔE7-acufected त्वचा का उपचार

नोट: acufected जीन की Transcriptional अभिव्यक्ति और प्रोटीन के उत्पादन दिन 3. चूहे के साथ ब्याज की प्लाज्मिड 3 दिन अभिकर्मक के बाद उत्तेजक के विभिन्न प्रकार के साथ इलाज किया जा सकता acufected पर पता लगता है। हम IMQ क्रीम के साथ आईएल 15ΔE7-acufected माउस त्वचा के उपचार से यहां दिखाए गए हैं। IMQ एक imidazoquinolin अमाइन अनुमोदित च हैया बाह्य जननांग मौसा और प्रसवकालीन 13 इलाज। सामयिक IMQ उपचार परतदार त्वचा, एपिडर्मल प्रसार और चमड़े का न्युट्रोफिल घुसपैठ 12, 14, 15 की अभिव्यक्ति के साथ चूहों में मानव सोरायसिस की तरह त्वचा विकार प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।

नोट: प्लाज्मिड वेक्टर पूर्ण लंबाई माउस आईएल 15 सीडीएनए, निहित बढ़ाव फैक्टर -1 α के नियमन (PEF), सी टर्मिनस (PEF-IL- में एक IL-2 संकेत पेप्टाइड और एक ध्वज टैग के साथ घिरे तहत 15, 5859 आधार जोड़े) है, जो के रूप में बैमफोर्ड एट अल द्वारा वर्णित निर्माण किया गया। 16। (संश्लेषण 48 आईएल 15ΔE7 (PEF-आईएल 15ΔE7, 5811 आधार जोड़े) के लिए आईएल 15 जीन की एक्सॉन 7 में SOE द्वारा - प्लाज्मिड एक आईएल 15 टेम्पलेट के रूप में पहले 16 अमीनो एसिड को नष्ट करने के अवशेषों पर 33 प्रयोग किया जाता है ओवरलैप विस्तार) पीसीआर विधि 17 से। बैक्टीरियल कालोनियों कि सफलतापूर्वक थेआईएल 15ΔE7 साथ बदल प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा सत्यापित और डीएनए अनुक्रमण 12, 18 द्वारा पीछा किया गया। अन्तर्जीवविष मुक्त प्लाज्मिड डीएनए की एक बड़ी मात्रा प्रोटोकॉल चरण 2 में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था।

  1. tribromoethanol (प्रति ग्राम शरीर के वजन 400 माइक्रोग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा acufected चूहों anesthetize और संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक आंखों मरहम लागू होते हैं। ऑपरेटिव प्रक्रियाओं के शुरू होने से पहले संज्ञाहरण की गहराई पर्याप्त आश्वस्त करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा जाँच करें। नोट: के बाद से एक 2 सेमी x 2 सेमी त्वचा IMQ के लिए माना जाएगा, जनहित याचिका-15ΔE7 प्लाज्मिड डीएनए (खुराक प्रति 10 μL पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम) के 2 खुराक 2 लक्षित साइटों पर acufected है (1 सेमी x 1 सेमी प्रत्येक)।
  2. मार्क त्वचा (2 सेमी x 2 सेमी) acufected क्षेत्र को कवर पार्श्व।
  3. क्यू टिप ऐप्लिकेटर का उपयोग स्थानिक चिह्नित सतह क्षेत्र पर IMQ क्रीम लागू करने के लिए। नोट: कदम 5.1 केवल पहली खुराक (60 मिग्रा / खुराक) के लिए किया जाता है।अगले लगातार खुराक गैर anesthetized चूहों पर लागू होते हैं।
  4. एक उच्च परिभाषा कैमकॉर्डर के साथ दैनिक IMQ इलाज पृष्ठीय त्वचा के परिवर्तन दस्तावेज़। ध्यान दें: एक व्यक्ति माउस, जबकि एक अन्य रिकॉर्डिंग है रखती है। फिर भी चित्रों को गोली मार दी और बाद में संपादित कर रहे हैं।
  5. tribromoethanol की अधिक मात्रा (प्रति ग्राम शरीर के वजन 800 माइक्रोग्राम) दिन 4 या दिन 7 IMQ उपचार के बाद पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद इंजेक्शन लगाने के द्वारा चूहों euthanize। त्वचा excised और संसाधित किया जाता है (4.1 चरण - 4.5)।

6. माउस त्वचा की Homogenate

  1. पूंछ के आधार से एक क्षैतिज कटौती बनाने के लिए शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। hindlimb के आधार पर द्विपक्षीय रूप से आगे बढ़ें और अग्र- अंग के आधार पर दिशा के साथ खड़ी कटौती करने के लिए जारी है।
  2. ध्यान से पूर्वकाल के पीछे से अंतर्निहित ऊतक से त्वचा छील। पृष्ठीय त्वचा काट कैंची का प्रयोग करें। एक बाँझ पेट्री डिश पर त्वचा रखें।
  3. लक्ष्य उत्पाद शुल्क के लिए एक छुरी का प्रयोग करेंत्वचा और तरल नाइट्रोजन में इसे तुरंत फ्रीज। ध्यान दें: एक ही बिना acufected त्वचा का आकार (1 सेमी एक्स 1 सेमी) या IMQ उपचार के साथ (2 सेमी x 2 सेमी) प्रत्येक माउस प्रयोग करने के लिए प्रयोग विविधताओं को कम करने के लिए तय हो गई है।
  4. हैंडल और मूसल के साथ एक पूर्व ठंडा 2-डिब्बे मोर्टार के केंद्र में जमे हुए त्वचा ऊतक रखें। ऊतक टुकड़े टुकड़े करना के लिए मोर्टार पर एक का नेतृत्व हथौड़ा का उपयोग करें।
  5. जल्दी शाही सेना निकासी के लिए या एक ट्यूब प्रोटीन lysate प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 50 μL और 1x प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त करने के लिए सेल अभिकर्मक के 500 μL युक्त एक नया ट्यूब को चूर्णित ऊतक जगह।

7. एच एंड ई और इम्युनोहिस्टोकैमिकल त्वचा धारा का धुंधला

  1. एक कैसेट में त्वचा ऊतक रखें और रात भर 4% paraformaldehyde में यह विसर्जित।
  2. एम्बेड और खंड ऊतक है, जो हमारे मामले में एलएसी, NTU पर पैथोलॉजी प्रयोगशाला द्वारा किया गया था। नोट: खंड 5 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई कम से काटा जाता है। प्लेस ऊतक sectiधनात्मक आवेश वाले स्लाइड पर ऑन।
  3. 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड गरम करें।
  4. एक धुंधला रैक में स्लाइड रखें। इसी टैंक 5 मिनट में दो बार 100%, 95%, 80%, 75%, 60% और पुनर्जलीकरण के लिए 50% इथेनॉल (प्रत्येक 5 मिनट) में अनुक्रमिक विसर्जन के बाद के लिए xylene स्थानापन्न युक्त में रैक को डुबो दें। धुंधला से पहले 3 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड्स डुबो दें।
  5. hematoxylin और eosin धुंधला निष्पादित करें। नोट: एच एंड ई दाग एलएसी, NTU पर पैथोलॉजी प्रयोगशाला में अनुरोध पर किया गया था।
  6. प्रतिरक्षाऊतकरसायन दाग के लिए, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ब्लॉक समाधान के साथ खंड ब्लॉक गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए। नोट: ब्लॉक समाधान व्यावसायिक रूप से immunostaining तकनीक के साथ विकसित की है। कोई पशु सीरम इस उत्पाद में निहित है।
  7. पीबीएस में स्लाइड डुबकी ब्लॉक समाधान बाहर कुल्ला करने के लिए।
  8. 01:10 पर पीबीएस में ब्लॉक समाधान पतला और 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (मंदक समाधान) जोड़ें।
  9. एक ही समाधान प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ते हुए माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन के लिए नियंत्रित करने के लिए के साथ एक ही समय में एक धारावाहिक अनुभाग दाग।
  • धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस में तीन बार से अधिक 0.1% बीच 20 (TBST समाधान) स्लाइड। धोने के बीच समाधान बदलें।
  • प्रत्येक अनुभाग के लेबल पॉलिमर की एक बूंद पिपेट और 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। नोट: लेबल बहुलक व्यावसायिक रूप से peroxidase और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एमिनो एसिड पॉलिमर जो एक फैब 'टुकड़ा करने के लिए कम हो जाता है के संयोजन के द्वारा तैयार किया जाता है। अभिकर्मक के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैमाउस ऊतक वर्गों की प्रतिरक्षाऊतकरसायन धुंधला।
  • धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए TBST में तीन बार स्लाइड। धोने के बीच समाधान बदलें।
  • पिपेट 3,3'-diaminobenzindine tetrahydrochloride (डी ए बी) ऊतक खंड पर समाधान और कमरे के तापमान पर खड़े जब तक एक भूरे रंग के तलछट एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाई देता। नोट: समय डी ए बी peroxidase की उपस्थिति में तलछट के लिए लगभग 30 मिनट है।
  • पानी में स्लाइड विसर्जित peroxidase की गतिविधि को रोकने के लिए। परमाणु धुंधला के लिए मिथाइल हरी समाधान में डुबकी स्लाइड। धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
  • दाग अनुभाग है कि स्थायी बढ़ते मध्यम (अनुभाग प्रति 8 μL) के साथ कवर किया जाता है पर एक coverslip रखें।
  • 8. फोटो और स्टेन्ड ऊतक धारा का विश्लेषण

    1. एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे एच एंड ई दाग और आईएचसी ऊतक वर्गों कल्पना। आरोप डिवाइस युग्मित (सीसीडी) कैमरा खुर्दबीन से जुड़ी का उपयोग कर कब्जा छवियों। q के लिएuantitative विश्लेषण, इमेजिंग सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया जा सकता
      1. एक 20X उद्देश्य के साथ एक scanscope का उपयोग कर पूरे रंगीन वर्गों स्कैन करें।
      2. एपिडर्मिस की एक 1 मिमी खंड के भीतर एपिडर्मल मोटाई का आकलन करें और खंड के भीतर Ki67-immunoreactive कोशिकाओं की संख्या गिनती।
        नोट: मात्रात्मक विश्लेषण माइक्रोस्कोपी स्वचालन और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है। एपिडर्मल मोटाई बेसल परत और बाह्य त्वचा की सबसे बाहरी परत के बीच की दूरी से परिभाषित किया गया है।
      3. चमड़े का क्षेत्र (230 x 270 सुक्ष्ममापी 2 आयत) सामयिक IMQ का इलाज त्वचा तुरंत नीचे में Ly6G-immunoreactive कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।

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    Representative Results

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    जबकि कुछ लालिमा एक्यूपंक्चर सुइयों के साथ चुभन के बाद पहले घंटे के भीतर स्पष्ट किया गया है, त्वचा 2 दिन पर मंजूरी दे दी और 7 दिन तक कोई प्रतिकूल त्वचा की प्रतिक्रिया चुभन (चित्रा 2 ए) के बाद देखा गया था। सुई चुभन अनुपचारित त्वचा (चित्रा 2 बी) के साथ तुलना में एच एंड ई विश्लेषण द्वारा एपिडर्मल orthokeratosis और कम से कम त्वचीय घुसपैठ की बहुत कम स्तर प्रेरित किया। एपिडर्मल मोटाई (चित्रा 2C) और Ki67 + कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 2 डी) सुई चुभ और अनुपचारित त्वचा के बीच तुलनीय थे, का प्रदर्शन है कि एक्यूपंक्चर सुई चुभ त्वचा ध्यान देने योग्य ऊतक विघटन या बाह्य त्वचा में सेलुलर प्रसार का कारण नहीं था। सिरिंज सुई की तुलना में (व्यास में 1.067 मिमी) 12, एक्यूपंक्चर सुइयों के साथ केमोकाइन CXCL की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कम स्तरों चुभन-1 और proinflammatory cytokine आईएल -6 2 दिन पर उस दिन 5 (चित्रा 3A) पर कम करने के लिए जारी रखा। माउस त्वचा में acufected ट्रांस्जीन की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए, एक प्लाज्मिड आईएल 15 सीडीएनए व्यक्त आईएल 15 की कमी C57BL 6 / (आईएल 15 KO) चूहों की त्वचा में acufected किया गया था। हालांकि acufected प्लाज्मिड डीएनए से प्रतिलेखन के निम्न स्तर depilated त्वचा में मनाया गया, एक्यूपंक्चर सुइयों के साथ दोलन जीन प्रतिलेखन के स्तर (चित्रा 3 बी) बढ़ाया। आईएल 15 उत्पादन 2 दिन का पता चला और दिन 7 (चित्रा -3 सी) के लिए स्थिर बना रहा। इन परिणामों कि acufection प्रभावी रूप से प्लाज्मिड डीएनए रहता और अत्यधिक keratinocyte सक्रियण उत्प्रेरण के बिना त्वचा में इनकोडिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है का प्रदर्शन।

    WT चूहों एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग आईएल 15ΔE7 साथ acufected रहे थे। चूहे व्यक्त आईएल 15ΔE7 mRNA और प्रोटीन 3 तकदिन अभिकर्मक (चित्रा 4 ए) के बाद। चूहों तो स्थानिक 3. दिन IMQ क्रीम के साथ इलाज नियंत्रण WT चूहों में IMQ उपचार प्रेरित चांदी के गुच्छे, IMQ प्रेरित चांदी के गुच्छे आईएल 15ΔE7 में कम हो गई थी जबकि WT चूहों (चित्रा 4 बी) acufected रहे थे। दिलचस्प बात यह है acufected आईएल 15ΔE7 की अभिव्यक्ति काफी साथ unacufected WT त्वचा (चित्रा 4C) 12 की तुलना में IMQ का इलाज त्वचा में Ly6G + न्युट्रोफिल घुसपैठ हिचकते। acufection करके, हम त्वचा में आईएल 15ΔE7 के उपन्यास समारोह का प्रदर्शन किया। आईएल 15ΔE7 IMQ प्रेरित न्युट्रोफिल घुसपैठ modulates।

    आकृति 1
    चित्रा 1। एक्यूपंक्चर सुइयों का चित्रण। (ए) एक्यूपंक्चर सुई (36 जी x 0.5 ") एक से बना हैसंभालने के लिए और एक सुई अंत। (बी) के दस एक्यूपंक्चर सुई एक बंडल चिपकने वाला टेप का उपयोग में बंधे हुए हैं। बंडल की लंबाई लगभग 4 सेमी के रूप में शासक (कम पैनल) द्वारा मापा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्र 2। एक्यूपंक्चर सुई द्वारा चुभन का कारण नहीं है ध्यान देने योग्य त्वचा को नुकसान या केरेटिनकोशिका सक्रियण। (ए) ट्रिपल साइटों को माउस की मुंडा और depilated पार्श्व त्वचा पर सलेटी वर्गों में चिह्नित 100 बार प्रत्येक चुभ गया था एक्यूपंक्चर सुई द्वारा। फोटो त्वचा को नुकसान की निगरानी के लिए चुभन के बाद 7 दिनों के लिए पहले घंटे पर और ऊपर ले जाया गया। मुंडा और सुई चुभन के बिना depilated त्वचा नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। <strong> (बी) एच एंड ई अनुपचारित या सुई चुभ माउस त्वचा से formalin-तय, पैराफिन एम्बेडेड त्वचा वर्गों का विश्लेषण। स्केल बार: 100 सुक्ष्ममापी। (सी) अनुपचारित या सुई चुभ माउस त्वचा से एच एंड ई दाग वर्गों में से एक मिलीमीटर खंड एपिडर्मल मोटाई (सबसे बाहरी परत को बेसल से दूरी) को मापने के लिए चुना गया था। प्रत्येक बार 3 त्वचा वर्गों से मापा जाता एपिडर्मल मोटाई की संकरी प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि बार मतलब (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है। समूहों के बीच अंतर के महत्व अयुगल विद्यार्थी t- परीक्षण द्वारा परीक्षण किया गया था। (डी) एक ही नमूने के सीरियल वर्गों प्रतिरक्षाऊतकरसायन विश्लेषण के लिए विरोधी Ki67 साथ दाग रहे थे। प्रत्येक बार प्रति 1 मिमी खंड की लंबाई में हर 150 सुक्ष्ममापी-एपिडर्मिस में स्थानीय Ki67 + कोशिकाओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि बार मतलब (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है। समूहों के बीच अंतर के महत्व को दो तरह से एनोवा foll द्वारा परीक्षण किया गया थाBonferroni पद हॉक परीक्षण के द्वारा होता था। (एनएस: महत्वपूर्ण नहीं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    3 चित्र। Acufection प्रभावी रूप से ध्यान देने योग्य केरेटिनकोशिका सक्रियण पहुंचाए बिना ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करता है। (ए) मुंडा और depilated पार्श्व त्वचा अनुपचारित छोड़ दिया गया था (एनटीसी), 1.067 मिमी व्यास (19 जी) सिरिंज सुई (Syr।) के साथ abrading या एक्यूपंक्चर सुई द्वारा 100 बार चुभन (एसीयू।)। दिन 2 और दिन 5 पर CXCL -1 और आईएल -6 की ट्रांस्क्रिप्शनल स्तर से नापा गया QRT- पीसीआर (n = 3)। (बी) मुंडा और आईएल -15 की कमी माउस के depilated त्वचा स्थानिक एक प्लाज्मिड डीएनए आईएल 15 को व्यक्त करने का एक बूंद के साथ लागू किया गया था withouटी (depilation) या एक्यूपंक्चर सुई चुभन (depilation + चुभन) के साथ। 2 दिन प्रत्येक समूह में आईएल 15 के ट्रांसक्रिप्शन TaqMan QRT- पीसीआर द्वारा मापा गया था। आईएल 15 के ट्रांसक्रिप्शन आईएल 15 की कमी चूहों के पीबीएस नियंत्रण (एनटीसी) में undetectable था। (सी) आईएल 15 की कमी माउस त्वचा से आईएल 15 उत्पादन है कि अनुपचारित या था विभिन्न दिनों के लिए आईएल 15-acufected (प्रत्येक दिन के लिए एक ऊतक) आईएल 15 एलिसा द्वारा मापा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4। आईएल 15ΔE7 का प्रदर्शन attenuates IMQ प्रेरित चांदी फ़्लैकी त्वचा और न्युट्रोफिल घुसपैठ को रोकता है। (ए) के ट्रांस्क्रिप्शनल स्तर और प्रोटीन के उत्पादन आईएल 15ΔE7-acufected (WT / जनहित याचिका -15 [6; E7) या खाली वेक्टर नियंत्रण (WT / pEmpty) त्वचा, QRT- पीसीआर और एलिसा (n = 2, हर बार बिंदु) द्वारा मापा गया क्रमशः। (बी) के खाली vector- या 3 दिन में आईएल 15ΔE7-acufected पार्श्व त्वचा स्थानिक IMQ क्रीम (60 मिलीग्राम) के साथ इलाज किया गया था। IMQ उपचार के बाद 6 दिन में WT / pEmpty और WT / जनहित याचिका-15ΔE7 माउस पार्श्व की तस्वीरें। (सी) दिन 3 और 6 पर IMQ उपचार के बाद WT / pEmpty या WT / जनहित याचिका-15ΔE7 चूहों से त्वचा वर्गों विरोधी Ly6G एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रगणित थे। प्रत्येक बार 4 IMQ इलाज चूहों से Ly6G + कोशिकाओं के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि बार मतलब (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है। समूहों के बीच अंतर के महत्व को दो तरह से एनोवा Bonferroni पद हॉक परीक्षण के बाद से परीक्षण किया गया था। पैनलों ए और सी खोजी त्वचा विज्ञान, लाइसेंस नंबर 3901890227597. के जर्नल से अनुमति के साथ संशोधित कर रहे हैं क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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    Discussion

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    acufected प्लाज्मिड डीएनए की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम समान रूप से दोलन और त्वचा की सींग का बना हुआ परत ढीला है। त्वचा काटने के बिना सुई धक्का धीरे करते हैं, बल कठोर सतह दबाना करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। एक 1 सेमी x 1 सेमी सतह क्षेत्र पर 10 μL समाधान में डीएनए के अवशोषण की सुविधा के लिए, सुइयों 30 सेकेंड में 100 गुना के लिए उतार-नीचे दोलन चाहिए। एक बल त्वचा चुभन की जरूरत है और निर्धारित कर सकते हैं बार है कि acufected जीन का सबसे अच्छा अभिव्यक्ति के स्तर की उपज के लिए आवश्यक है की संख्या टिप्पण द्वारा।

    प्लाज्मिड डीएनए की राशि के लिए संशोधन acufection के बाद, क्योंकि यह विभिन्न जीनों के लिए भिन्न हो सकते हैं की जरूरत हो सकती अभिव्यक्ति की एक संतोषजनक स्तर तक पहुँचने के लिए आवेदन किया। अनुमापन प्रयोगों निर्धारित करने के लिए प्लाज्मिड डीएनए के इष्टतम मात्रा के रूप में अच्छी तरह से प्रयोग से पहले लागू करने के लिए किया जाना चाहिए। मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण से परिणाम ओ निर्धारित करने के लिए मदद मिलेगीप्लाज्मिड डीएनए के ptimal मात्रा और सबसे अच्छा शर्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के।

    acufection प्रक्रिया की सटीक तंत्र स्पष्ट किया जाना अभी बाकी है। स्थानिक वितरित प्लाज्मिड डीएनए से प्रतिलेखन निम्न स्तर पर मुंडा और depilated त्वचा में हुई है, बढ़ाया अभिकर्मक दक्षता (चित्रा 3 बी) एक्यूपंक्चर सुई द्वारा चुभन। Microseeding प्रोटोकॉल के सादृश्य है, जिसमें टैटू बंदूक 11 के साथ कई छेद, acufection वितरित प्लाज्मिड डीएनए संभावना केरेटिनकोशिकाओं और बाल कूप 19, 20 की कोशिका झिल्ली की खरोंच के माध्यम से दिया जाता है के द्वारा। बालों को हटाने, depilating अभिकर्मक और सुई दोलन से एपिडर्मिस की stimulations कुछ हद तक keratinocyte सक्रियण प्रेरित कर सकते हैं और आगे लैंगरहैंस और डीसी 6 से डीएनए तेज बढ़ाने के लिए। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा को हाथ में लिया हैकोशिकाओं द्वारा सही ढंग से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। हम इस पद्धति का उपयोग एक बड़ी त्वचा क्षेत्र के इलाज के लिए संकेत नहीं करते। प्रयोगों के बीच वितरित जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव को कम से कम करने के लिए, डीएनए समाधान की मात्रा और लक्ष्य त्वचा की सतह के आकार प्रयोगों के एक ही सेट के लिए किया जाना चाहिए। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि दोहराने प्रयोगों एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा करने के लिए कर रहे हैं।

    जीन बंदूक डिवाइस और microseeding के संबंध में, एक्यूपंक्चर सुइयों का एक बंडल के उपयोग देने के लिए नग्न डी एन ए सस्ती है। प्रक्रियाओं भी सीधा कर रहे हैं। यह बहुत कम तकनीकी अनुभव acufection प्रोटोकॉल का पालन करने की आवश्यकता है। Acufection पशुओं के लिए कम से कम आघात का कारण बनता है और कोई वजन घटाने ऑपरेशन के बाद पाया जाता है। दर्द का स्तर कम के रूप में acufection ऑपरेशन के बाद महत्वपूर्ण व्यवहार में परिवर्तन के अभाव से आंका है।

    सारांश में, एक्यूपंक्चर सुइयों का उपयोग कर ढीलामेजबान कोशिकाओं से डीएनए तेज के लिए त्वचा की सींग का बना हुआ परत माउस त्वचा में एक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक किफायती विकल्प तरीका प्रदान करता है। प्रतिरक्षा संबंधित जीन का एक व्यापक स्पेक्ट्रम अभी तक कार्यात्मक त्वचा 21 में विशेषता है, हो सकता है, और यह त्वचा पर एक उपन्यास जीन की एक त्वरित अध्ययन के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला गया। इस विधि को रोजगार, एक आसानी से तय कर सकते हैं ब्याज की जीन के उत्पाद किसी भी उपन्यास समारोह है या नहीं। यह acufection प्रोटोकॉल त्वचीय रोग का इलाज करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया modulating में नई खोजों के लिए एक सुविधाजनक और व्यावहारिक उपकरण प्रदान करता है।

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    Disclosures

    लेखकों वित्तीय हितों की कोई खुलासा करने के लिए किया है।

    Acknowledgments

    इस काम के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (मोस्ट 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048)। हम डीआरएस धन्यवाद। बेट्टी वू-ह्सिह और NTU में चिएन-कुओ ली, लीघ ज़रबोनी स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय और डॉ पीटर होफ़मैन हवाई विश्वविद्यालय में कम से पांडुलिपि पढ़ने के लिए, तकनीकी सहायता के लिए NTU पर यूं चिएन और कृषि जैव प्रौद्योगिकी में डॉ वेन-ची वेइ तकनीकी सलाह के लिए एकेडेमिया सिनिका पर रिसर्च सेंटर।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

    1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
    2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
    3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
    4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
    5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
    6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
    7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
    8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
    9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
    10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
    11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
    12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
    13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
    14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
    15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
    16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
    17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
    18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
    19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
    20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
    21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
    &quot;Acufection&quot; और त्वचा अनुसंधान करने के लिए अपने आवेदन के द्वारा एक आर्थिक डीएनए वितरण प्रणाली का विकास
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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