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Immunology and Infection

「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

このプロトコルは、マウスの皮膚に裸のプラスミドDNAを発現するための費用対効果の高い代替法です。プロトコルの全体的な目標は、皮膚の炎症における特定の遺伝子の機能的役割を描写するために皮膚組織への免疫関連遺伝子を提供することです。

Abstract

皮膚の免疫応答の調節不全は、多くの人間の皮膚疾患と関連しています。皮膚組織への免疫関連遺伝子の直接転写は、ヒト疾患のマウスモデルにおける皮膚炎症の免疫調節を調査するための魅力的なアプローチです。ここでは、マウスの皮膚に裸のDNAを提供し、導入遺伝子の発現をもたらすコスト効率のプロトコルを提示します。この方法は、ACUパンク媒介DNAトランスフェクションを示す、「acufection」を造語しています。 acufectionを実行するために、マウスの皮膚は、最初のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にDNAを注入した後、細胞にDNAおよびトランスフェクションの吸収を容易にするために、鍼治療針の束で軽く刺しました。プラスミドDNAは、おそらく、ケラチノサイト及び皮膚での樹状細胞(DC)によって取り込まれ、タンパク質に発現されます。針自体に機械的にプリックは、皮膚の損傷を引き起こしたり、ケラチノサイトの活性化を誘導しませんでした。表現トランスフェクトされた遺伝子の2日間acufection次転写および翻訳の両方のレベルで皮膚中で検出されたと7日まで維持。このacufection法の開発のための第一の目標は、IL-15の以前に未定義のアイソフォームを調査することでした。炎症を誘導するために、皮膚中で発現させ、続いてToll様受容体7(TLR7)アゴニスト、イミキモド(IMQ)で処理し、この方法は、部分的に欠失し、エクソン7(IL-15ΔE7)と選択的にスプライシングされたIL-15アイソフォームを用いました。皮膚におけるAcufection送達IL-15ΔE7はIMQ誘発性皮膚炎症においてケラチノサイト増殖、表皮の厚さと好中球動員を抑制しました。皮膚炎症の調節機構を同定することに関心の高まりとともに、ここで説明するプロトコルは、 インビボにおける DNA送達のための遺伝子銃システム又はmicroseedingに費用効果的かつ多目的な代替物を提供します。これは、潜在的に小説の機能の発見を可能にすることができます皮膚内または皮膚疾患の新しい治療法を調査するための遺伝子。

Introduction

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皮膚は、宿主防御の第一線です。ケラチノサイト(KCS)は、ヒトとマウスの皮膚における主要な細胞型です。環境刺激( 例えば、日光、酸素、化学物質や病原性浸潤)に応答して、KCSは、活性化され、このようなIL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの広い配列を生成していますαおよびGM-CSF 1。彼らは一緒に皮膚への免疫細胞の動員を誘発します。悪化皮膚炎症は、多くの場合、急性異所性接触性皮膚炎および慢性のT細胞媒介性炎症( 例えば、アレルギー性接触性皮膚炎および乾癬)2を含む多数のヒト疾患に関連付けられています。 KC活性化を阻害することにより、皮膚の炎症誘発性の応答を調節することは、皮膚の炎症を治療するためのもっともらしいアプローチです。このプロトコルは、一過性免疫解像度を研究するために、表皮におけるサイトカイン遺伝子を発現するための新しいアプローチを説明します皮膚のような治療に必然ponse。

表皮は、皮膚の最表層を構成します。それは、皮膚のより深い層に侵入するような核酸および病原体などの外部物質を保持物理的障壁として働きます。いくつかの無針技術は、表皮のDNAの転送3、4のために確立されています。溶液中のDNAまたはカチオン性リポソームまたはアデノウイルスベクターに関連した直接そのような角質層の除去または試薬を脱毛での処理のような技術を用いて修飾された表皮に適用されています。角化上皮の除去は、DNAケラチノサイトおよび免疫応答5を誘発するランゲルハンス細胞と表皮バリアとの相互作用を横断を容易にします。大きな表面積は、DNAの転送のために利用可能であり、このアプローチは、針を必要としませんが、要件を含む欠点があります( - 100μgの10)、ストリッピングによって皮膚に過酷な治療、及びDNA送達ブースター6なしで免疫された動物において免疫応答を誘導するのに矛盾した結果、DNAの大量のために。皮膚への裸のDNAの微粒子媒介性の細胞内送達は、免疫応答7,8誘導するための非常に効率的で再現性のあることが示されています。手持ち遺伝子銃は、加圧されたヘリウム空気流9により径2μm直径プラスミドDNA被覆金粒子による皮膚の標的部位に衝突するために使用されています。プラスミドDNAは、おそらく皮膚にKCsand樹状細胞(DC)によって取り込まれ、タンパク質が局所的に発現されるか、またはDCを10によって流入領域リンパ節に輸送されます。遺伝子銃システムはシンプルで、限られた技術的な経験を必要とし、「DNA BULを準備し、提供するためのコストが、う」( すなわち、金粉末、ヘリウムガス)および遺伝子銃用自体は、その一般的な適用を制限している。実験は異なる場所で行われる場合に加えて、ヘリウムガス供給システムの要件は、遺伝子銃の輸送の容易さを制限する。Microseeding単回注射、粒子ボンバードメント11よりも遺伝子導入の高い効率を達成することが実証されている。Microseedingは粒子ビーズ11を使用せずに皮膚にDNAを送達するために入れ墨銃を使用する。このアプローチを用いて皮膚上にマイクロニードルを発振する可能性があります直接細胞膜をこすり、したがって、同時に複数の細胞にDNAを移す。ただし、0.254ミリメートル直径の針を注射の多数に関連する疼痛が欠点です。

ここでは、in vivoでの DNA送達するための別のアプローチを提供します。 「acufection」 12を使用して実証されました。 acufectionは簡単で、あまりDEMAであると証明する一方でインビボにおける DNA送達のための方法をnding、異なる遺伝子及び皮膚を刺すための時間のDNAの最適量は注意深く再現性のある結果を得るために最適化されなければなりません。

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Protocol

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8の雌マウス - 生後12週は、この研究のために使用しました。 C57 / BL6野生型(WT)とIL-15欠損(IL15 - / - )マウスは、それぞれ国立研究所動物センター(NLAC)、台湾とをTaconic農場から購入しました。 IL-15欠損(IL-15 - / - )およびIL-15ドミナント(IL15 +/-及びIL15 + / +)は 1を示した:IL15 +/-ヘテロ接合体の断面から第二世代の3比。 IL-15の遺伝子型- / -マウスは、PCR分析により確認しました。マウスは、実験動物センター(LAC)、国立台湾大学医学部(NTU)大学の特定病原体フリー(SPF)施設で維持しました。麻酔薬の材料および方法を含むすべての動物の手順は、公衆衛生施設内動物管理使用委員会(IACUC)(動物議定20130225の承認の宣誓供述書)の国立台湾大学医学部の大学や専門学校で承認された動物のプロトコルに従って行いました。

<Pクラス= "jove_title"> 1。鍼の調製

注:鍼治療の針は、ハンドルとニードル端( 図1A)からなる医療装置です。鍼治療の針の直径を0.2mm(36 G)から0.35ミリメートル(28 G)の範囲でした。私たちは肌を刺す時に潜在的な過剰な細胞の損傷を避けるために、針の最高のポイントを選択します。長さ13ミリメートル(0.5インチ)、25ミリメートル(1.0)、40ミリメートル(1.5)および50mM(2.0)を含む0.2 mmの針の4つの異なる長さが存在します。 13ミリメートルの長さ10針の束は、C57BL / 6マウスの皮膚に針を振動中最良の快適なグリップを提供しました。この方法は、大型動物の皮膚に適用されるか、大きな手で研究者によって行われた場合のパラメータを変更することができました。

  1. 無菌の、非発熱性パッケージから鍼を削除します。滅菌ドレープの上に針を置きます。
  2. 私は一緒に10針をバインドするために、接着ラベルテープを使用しますNA束( 図1B)。
    注:10針が幾何学的に円筒形状を形成するように配置されています。便宜上、粘着テープを適用する前に、装置を安定化させるためにパラフィンフィルム片を使用します。すべてのニードルポイントが同一平面上にあることを確認します。代わりに、単一の針の束を使用することで、針と皮膚との接触面積を増やすことで、最大のDNAの注入を容易にします。

大量かつエンドトキシンフリープラスミドDNAの調製

  1. プラスミドDNAを化学的にコンピテント細菌細胞を形質転換します。
  2. 選択し接種単一細菌コロニーを抗生物質を含むLB培地3mLにし、シェーカーで一晩37℃でインキュベートします。
  3. 抗生物質を含むLB培地250mLに100と37℃で一晩振とう:1で細菌培養物を希釈することによって、培養をスケールアップ
  4. 高品質Reduceを用いてDNAを大量に調製しますY、製造者の指示に従って、エンドトキシンフリーのプラスミド調製キット。
    注:Acufectionプロトコルは、高純度のプラスミドDNAを大量に必要とします。高品質の使用は、エンドトキシンフリーでカラム精製プラスミドDNAが推奨されます。
  5. 滅菌水中にDNAを溶出します。 acufection直前まで-20°Cで小分けに保管してDNA。
    注:一貫性のプラスミドDNAの発現を確実にするためにDNAの繰り返し凍結と融解を避けてください。
  6. acufection無菌PBS中1mg / mLのプラスミドDNAを希釈します。

Acufection 3.手順

注:DNAの最適量および標的皮膚表面の領域は、異なる遺伝子に対して変化し、さらに最適化される必要があるかもしれません。穿刺力及び回数は、皮膚の厚さに応じて変えることができるまた、皮膚の角質層を緩め。これらの条件は慎重acufected ジーン・トランスクリーの発現レベルを評価した後に決定されなければなりません定量RT-PCRによってPTS。

  1. マウスを秤量し、腹腔内注射によりトリブロモエタノール(グラム体重あたり400μgの)を管理します。
    注:2,2,2-トリブロモエタノールは、一般的にマウスで使用された注射用麻酔剤です。溶液は、2-メチル-2-ブタノール2.5%を含有する蒸留水(200 mL)中の非医薬品グレードの2,2,2-トリブロモエタノール(2.5 g)を溶解することにより作製されます。
  2. 麻酔下で乾燥するのを防ぐために、目に獣医眼科軟膏を使用してください。
    注: - 2分麻酔効果は1に誘導されます。操作の前に麻酔の十分な深さを確保するために、つま先ピンチ反射を確認してください。
  3. 背側脇腹の皮膚を剃ると毛幹にケラチンタンパク質を溶解するために脱毛クリームを適用します。
    注:髪を除去するための脱毛クリームの使用は、皮膚へのDNAの注入を容易にするであろう。
  4. 脱毛クリームを拭き取る水に浸した綿球を使用してください。
    注:脱毛クリームは水溶性です。クリームウィルの完全な除去lは脂っこい表面を防止し、より良い穿刺の結果を確認してください。
  5. 皮膚表面の消毒に70%エタノールに浸した滅菌綿棒を使用してください。
  6. 予め測定ステンシルと脱毛皮膚にマーク対象領域(X 1、CM1センチ)。注:ターゲットサイトをマーキングすると、上下定義された領域内針バンドルを適用するのに役立ちます。これは、実験間変動を最小限にするために特定の表面領域にDNAの同量の送達を保証することが重要です。
  7. マークされた皮膚へのプラスミドDNA(10μgの)の10μLのドロップを置きます。
    注:acufectionためのDNAの量は、異なる遺伝子および発現ベクターの種類に応じて変化します。使用されたDNAの量は慎重に関心の実験を行う前に滴定されるべきです。 10μL、小さな液滴であり、それは刺しながら転がり落ちずに剃り、脱毛肌によく座っています。マウスAと比較するために、10μLの空のベクターDNAで処置したマウスのコントロール群を含みます研究遺伝子とcufected。
  8. 鍼治療の針束( 図1B)を保持し、100倍または消失皮膚にPBS中のDNAからの水分まで上下運動でマークされた表面を刺します。注:皮膚表面の一部赤みが発生する可能性があります。出血深い切り傷を作ることは避けてください。 PBS中のDNAからの水分(10μL)を皮膚に消える場合、皮膚表面上の上下穿刺動作の数が動作可能に決定されます。それはacufection配信される遺伝子から最も一貫した結果を与えているので、私たちは30秒で100回を決めました。該当する場合、針は、最大6つの標的皮膚呵責(1センチメートルX 1センチメートル毎)に再利用することができます。 acufectionの間に70%エタノール及びPBSで針をすすぎます。彼らは鈍いか、交差汚染を避けるために、異なるプラスミドDNAのためのものであるときに新しい針に変更します。
  9. 覚醒するまで、体温を維持するために、加熱パッド上acufectedマウスを置き。
  10. 彼らが持っているとき、自分のケージにマウスを返します。十分な意識を取り戻しました。注:未acufectedマウスのケージから別のケージにacufectedマウスを保持し(ケージ当たり5匹の未満の動物)。
  11. 場所に水のボトルを入れて、IVC(個別に換気ケージ)ラックにケージを返します。

4.術後ケア

  1. 処置後最初の48時間、密接に行動変化(情動不安、攪拌または摂食障害)または異常な外観(粗い被毛又は猫背姿勢)を含む任意の不快感のために、マウスを監視します。

IL-15ΔE7-acufectedスキンの5イミキモド(IMQ)トリートメント

注:acufected遺伝子の転写発現とタンパク質の生産は、目的のプラスミドをトランスフェクションの3日後に覚せい剤の異なる種類で処理することが可能でacufected 3日目のマウスで検出可能です。私たちは、IMQクリームとIL-15ΔE7-acufectedマウスの皮膚を処理することによって、ここに示しています。 IMQがfを承認したイミダゾキノリンアミンでありますまたは外性器や周産期いぼ13を処理します。局所IMQ処理は、薄片状皮膚、表皮増殖および皮膚好中球浸潤12、14、15の発現を有するマウスにヒト乾癬様皮膚疾患を誘発することが示されています。

注:プラスミドベクターが含まれる完全長マウスIL-15 cDNAを、伸長因子1α(PEF)の調節下で、C末端にIL-2シグナルペプチドおよびFLAGタグと隣接し(PEF-IL- 15、バンフォードによって記載されるように構築された5859塩基対)。 16。プラスミドは残基で33最初の16個のアミノ酸を削除するためのIL-15をテンプレートとして使用される - SOEによってIL-15ΔE7ためのIL-15遺伝子のエキソン7 48(PEF-IL-15ΔE7、5811塩基対)(合成オーバーラップ伸長)PCR法17によって。成功した細菌コロニーIL-15ΔE7で形質転換し、制限酵素消化によって確認し、DNA配列12、18により追跡しました。プロトコルのステップ2に記載したようにエンドトキシンフリープラスミドDNAの大量調製しました。

  1. トリブロモエタノール(グラム体重あたり400μgの)の腹腔内注射によりacufectedマウスを麻酔し、麻酔下で乾燥を防ぐために、目に獣医眼科軟膏を適用します。手術手順の開始前に、麻酔の十分な深さを確保するためにつま先ピンチ反射を確認してください。注記さ:2 cm×2センチ皮膚がIMQために処理されるので、のpIL-15ΔE7プラスミドDNA(用量あたり10μLのPBS中10μg)の2つの用量を2つの標的部位(1センチメートルX 1センチメートル毎)にacufectedれます。
  2. マークは、皮膚(×2 cm 2のCM)acufected領域をカバーに隣接します。
  3. 局所的にマークされた表面積にIMQクリームを適用するにはQ-チップアプリケーターを使用してください。注:ステップ5.1は第一の用量(60 /用量)のためにのみ行われます。次の連続投与は、非麻酔したマウスに適用されます。
  4. ハイビジョンビデオカメラで毎日IMQ処理した背部皮膚の変化を文書化します。注意:一人は別が記録している間にマウスを保持しています。静止画を撮影し、後で編集しています。
  5. IMQ処理後4日目または7日目に頸椎脱臼続いトリブロモエタノールの過剰摂取(グラム体重あたり800μgの)を注射することによってマウスを安楽死させます。皮膚を切除し、処理された( - 4.5 4.1ステップ)。

マウス皮膚の6ホモジネート

  1. 尾の付け根から水平カットを作るために、手術ハサミを使用してください。後肢のベースに左右対称に進み、前肢のベースに脇腹に沿って垂直に切断し続けます。
  2. 慎重に、前方への後部から下部組織から皮膚の皮をむきます。背部皮膚をカットするはさみを使用してください。滅菌ペトリ皿の上に皮を置きます。
  3. ターゲットを切除する外科用メスを使用します皮膚、直ちに液体窒素で凍結。注:(X 1、CM1 cm)の無し又はIMQ処理(×2 cm 2のCM)とacufected皮膚の同じ大きさは、実験間の変動を最小限に抑えるために、各マウスのために固定されています。
  4. ハンドル付き予冷2区画乳鉢及び乳棒の中心で凍結皮膚組織を置きます。組織を粉砕するモルタルのリードハンマーを使用してください。
  5. 迅速RNA抽出のため、またはタンパク質溶解物を得るための50のPBSμL及び1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むチューブに細胞溶解試薬の500μLを含む新しいチューブに粉砕組織を置きます。

7.皮膚切片のH&Eおよび免疫組織化学染色

  1. カセット内の皮膚組織を置き、一晩、4%パラホルムアルデヒドでそれを浸します。
  2. 我々の場合にはLAC、NTUで病理学研究所で行われた埋め込みやセクションの組織、。注:セクションを5μmの厚さで切断されます。組織sectiを配置正に荷電したスライド上のアドオン。
  3. 15分間65℃でスライドを加熱します。
  4. 染色ラックにスライドを置きます。二回、100%、95%、80%、再水和のための75%、60%および50%エタノール(5分毎)に順次浸漬して、続いて5分間のキシレン代替物を含む対応するタンクにラックを浸します。染色の前に、3分間スライドを水道水で浸します。
  5. ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。注:H&E染色はLAC、NTUで病理研究所で要求に応じて行きました。
  6. 免疫組織化学染色のために、非特異的バックグラウンド染色を減少させるために5分間室温でブロック溶液でセクションをブロックします。注:ブロック溶液は市販の免疫染色技術を用いて開発されています。いいえ動物血清は、この製品に含まれていません。
  7. ブロック溶液をリンスするためにPBSでスライドを浸し。
  8. 1:10でPBSでブロック溶液を希釈し、2%ウシ胎児血清(FBS)(希釈溶液)を加えます。
  9. 二次抗体の非特異的結合を制御するために、一次抗体を省略し、同じ溶液で同じラン内の1つの連続切片を染色します。
  • 洗浄は、5分ごとにTBS中で3回+ 0.1%のTween-20(TBST溶液)をスライドさせます。洗浄の間に変更するソリューション。
  • 各セクションに標識されたポリマーの一滴をピペットで40分間室温でインキュベート。注:標識されたポリマーは、商業的にFab」フラグメントに還元されるペルオキシダーゼ及び二次抗体とアミノ酸ポリマーを組み合わせることによって調製されます。試薬は、使用する準備ができていますマウスの組織切片の免疫組織化学染色。
  • 洗浄は5分ごとに、TBSTで3回スライド。洗浄の間に変更するソリューション。
  • 組織切片上にピペット3,3'- diaminobenzindine四塩酸塩(DAB)溶液と褐色の沈殿物が明視野顕微鏡下で表示されるまで、室温で放置します。注:DABペルオキシダーゼの存在下で沈殿する時間は約30分です。
  • ペルオキシダーゼ活性を停止するために、水にスライドを浸します。核染色のためのメチルグリーン溶液中でディップスライド。洗浄は、5分ごとにPBSで3回スライドします。
  • 永久封入剤(セクション当たり8μL)で覆われている染色切片上にカバースリップを置きます。
  • ステンド組織切片の8写真と分析

    1. 明視野顕微鏡下でH&E染色およびIHC組織切片を視覚化します。顕微鏡に取り付けられた電荷結合素子(CCD)カメラを用いて画像を捕捉します。 Qについてuantitative分析、イメージングソフトウェアを使用することができます
      1. 20Xの目的でscanscopeを使用して全体の染色切片をスキャンします。
      2. 表皮の1mmのセグメント内の表皮の厚さを測定し、セグメント内のKi67免疫反応性細胞の数を数えます。
        注:定量分析は、顕微鏡の自動化&画像解析ソフトウェアを使用して行われます。表皮の厚さは、基底層および表皮の最外層との間の距離によって定義されます。
      3. 直ちに局所IMQ処理された皮膚下の皮膚領域(230 X 270μm2の長方形)でLy6G免疫反応性細胞の数を数えます。

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    Representative Results

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    いくつかの赤みが鍼治療針を穿刺した後に最初の時間以内に明らかであったが、皮膚は2日目にクリアされ、7日目までの有害な皮膚反応は、( 図2A)を穿刺した後に観察されませんでした。針の穿刺は、未処置皮膚( 図2B)と比較してH&E分析によって表皮orthokeratosisと最小の皮膚浸透の非常に低いレベルを誘導しました。表皮の厚さ( 図2C)およびKi67 +細胞( 図2D)の数は、鍼灸針穿刺皮膚は、表皮が顕著に組織破壊又は細胞増殖を引き起こさなかったことを実証し、ニードル刺しと未処理の皮膚との間で同等でした。ケモカインCXCLの発現レベルの低下を誘導した鍼治療針で穿刺注射針(直径1.067ミリメートル)12、と比較-1および炎症誘発性サイトカインIL-6の2日目、5日目( 図3A)に減少し続けました。マウス皮膚におけるacufectedトランスジーンの発現を検証するために、IL-15のcDNAを発現するプラスミドは、IL-15欠損C57BL / 6(IL-15 KO)マウスの皮膚にacufectedました。 acufectedプラスミドDNAからの転写の低いレベルが脱毛皮膚で観察されたが、鍼治療針と振動は、遺伝子転写( 図3B)のレベルを向上させます。 IL-15産生は、2日目に検出され、7日目( 図3C)まで安定なままでした。これらの結果は、acufectionが効果プラスミドDNAを注入すると、過剰な角化細胞の活性化を誘導することなく皮膚にコードされるタンパク質の発現を可能にすることを実証しています。

    WTマウスは、IL-15ΔE7をコードするプラスミドでacufectedました。マウスは3までIL-15ΔE7mRNAおよびタンパク質を発現しましたトランスフェクション( 図4A)日後。 IMQ処理が制御WTマウスにおいて銀フレークを誘導しながらマウスを、次いで局所3日目にIMQクリームで処理し、IMQ誘発性銀色のフレークは、IL-15ΔE7に減少したWTマウス( 図4B)acufected。興味深いことに、acufected IL-15ΔE7の発現は有意にunacufected WT皮膚( 4C)12と比較IMQで処理した皮膚にLy6G +好中球の浸潤を阻害しました。 acufectionによって、我々は皮膚におけるIL-15ΔE7の新規な機能を実証しました。 IL-15ΔE7はIMQ誘導好中球浸潤を変調します。

    図1
    1。 鍼のイラスト。 (A)鍼治療針(36 Gは×0.5" )から構成されていますハンドルと針終了。 (B)十鍼治療針は接着テープを使用してバンドルに結合しています。ルーラー(下のパネル)によって測定されるように、バンドルの長さは約4 cmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図2
    2。 鍼灸針で刺すことは顕著な皮膚の損傷や角化細胞の活性化を生じません。マウスの剃毛及び脱毛脇腹皮膚上のグレーの四角でマーク(A)トリプル部位は、鍼治療針100回ずつ刺しました。写真は、皮膚の損傷を監視するために刺した後、7日に最初の時間にして取り上げました。針穿刺せずに剃り、脱毛皮膚を対照として使用しました。 <未処理または針穿刺マウスの皮膚からのホルマリン固定、パラフィン包埋皮膚切片の強い>(B)H&E解析。スケールバー:100μmです。 (C)未処理または針穿刺マウス皮膚の表皮厚さ(基礎から最外層までの距離)を測定するために選択したから、H&E染色切片の1ミリメートルセグメント。各バーは3枚の皮膚切片から測定した表皮の厚さの平均値を表します。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表しています。群間の差の重要性は、対応のないスチューデントt検定により試験しました。同じ試料の(D)連続切片を免疫組織化学的分析のために抗Ki67を染色しました。各バーは1mmでセグメントあたりの長さのすべての150μmの表皮に局在するのKi67 +細胞の平均を表します。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表しています。群間の差の意義は、双方向ANOVA follで試験しましたボンフェローニの事後テストで負っ。 (NS:有意ではありません)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    3。 Acufectionが効果的に顕著なケラチノサイトの活性化を招くことなく、興味のあるタンパク質を発現します。 (A)(19 G)注射針(SYR)1.067ミリメートル直径と研磨または鍼治療針100回穿刺、剃り、脱毛フランク皮膚は(NTC)を未処理のまま放置した(ACU)。 2日目と5日目にCXCL-1およびIL-6の転写レベルで測定しました QRT-PCR(N = 3)。 (B)剃毛し、IL-15欠損マウスの脱毛皮膚を局所的にIL-15を発現するプラスミドDNAの滴を塗布しwithouT(脱毛)、または鍼治療針穿刺(脱毛+プリック)を有します。 2日目に、各群におけるIL-15の転写を、TaqMan QRT-PCRによって測定しました。 IL-15の転写は、IL-15欠損マウスのPBSコントロール(NTC)で検出されませんでした。未処理であったか、各種日間IL-15-acufected IL-15欠損マウス皮膚(それぞれの日について1つの組織)から(C)IL-15産生は、IL-15 ELISAによって測定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図4
    4。 IL-15ΔE7のデモンストレーションは、IMQによって誘発される銀色のフレーク状の皮膚を減衰させ、好中球浸潤を阻害します。 (A)IL-15ΔE7-acufected(WT /のpIL-15の転写レベルおよびタンパク質産生[6; E7)または空のベクターコントロール(WT / pEmpty)皮膚は、それぞれ、QRT-PCR及びELISA(N = 2、各時間点)によって測定しました。 3日目(B)空ベクター-またはIL-15ΔE7-acufected脇腹の皮膚を局所的にIMQクリームた(60mg)で処理しました。 WT / pEmptyとIMQ処理後6日目WT /のpIL-15ΔE7マウスの脇腹の写真。 (C)3日目及び6にIMQ処理後のWT / pEmpty又はWT /のpIL-15ΔE7マウスからの皮膚切片を抗Ly6G抗体で染色し、数えました。各バーは、4 IMQ処置マウスからLy6G +細胞の平均を表します。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表しています。群間の差の重要性は、ANOVAは、ボンフェローニの事後テストに続いて、双方向でテストしました。パネルAおよびCは、研究皮膚科学のジャーナル、ライセンス番号3901890227597.から許可を得て変更されますクリックしてください。ここでは、この図の拡大版を表示します。

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    Discussion

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    acufectedプラスミドDNAの発現を確実にするために最も重要なステップは、均等に振動し、皮膚の角質層を緩めることです。皮膚を切断することなく穏やかに針を押しながら、力は、表面を押圧しにくい十分であるべきです。 1センチメートルX 1cmの面積に10μL溶液中のDNAの吸収を促進するために、針は30秒で約100回上下に振動するべきです。一つは、肌を刺すとacufected遺伝子の最高発現レベルを得るために必要とされる回数に注目することによってする必要が力を決定することができます。

    プラスミドDNA量の変更は、それが異なる遺伝子を変化させることができるので、acufectionが必要とされてもよいした後、発現の十分なレベルに到達するために適用されます。滴定実験は、同様の実験の前に適用されるプラスミドDNAの最適量を決定するために実行されるべきです。定量的RT-PCR分析の結果は、Oを決定するのに役立ちますプラスミドDNAのptimal量および再現性のある結果を得るための最良の条件。

    acufectionプロセスの正確なメカニズムは明らかにされていません。局所的に送達されるプラスミドDNAからの転写は、トランスフェクション効率( 図3B)拡張鍼治療針によって穿刺、ローレベルで剃り、脱毛、皮膚で発生しています。入れ墨銃11とmicroseedingプロトコルの同様に複数の穿孔により、acufection送達プラスミドDNAは、おそらくケラチノサイトおよび毛包19、20の細胞膜の削れを介して促進されます。脱毛、脱毛試薬及び針振りによる表皮の刺激がある程度ケラチノサイト活性化を誘導し、さらにランゲルハンスとDCS 6によりDNAの取り込みを増強することができます。このプロトコルの制限は、プラスミドDNAの量が取りすることです細胞によって正確に制御されなくてもよいです。私たちは、大きな皮膚領域の治療のために、このメソッドを使用することをお勧めしません。実験の間で送達遺伝子の発現レベルの変動を最小限にするために、DNA溶液の体積および標的皮膚表面の大きさは、実験の同じセットに対して固定されるべきです。再現性のある結果を生成するには、反復実験は、同じ個体によって実行されることをお勧めします。

    遺伝子銃装置とmicroseedingに対して、裸のDNAを送達する鍼治療針の束を使用することは、安価です。手続きも簡単です。それはacufectionプロトコルに従うことが非常に少ない技術的な経験が必要です。 Acufectionは、動物に最小限の外傷を引き起こし、体重減少は、操作の後に発見されませんでした。 acufection操作後の重要な行動変化の有無によって判断されるように、痛みのレベルが低いです。

    要約すると、緩めるために鍼を使用して宿主細胞によるDNA取り込みのための皮膚の角質層は、マウス皮膚中のタンパク質を発現するための経済的な代替方法を提供します。免疫関連遺伝子の広いスペクトルは、まだ機能的に皮膚21を特徴としなければならず、これは皮膚上の新規遺伝子の迅速な研究の必要性を強調しています。この方法を採用し、一方は容易に目的の遺伝子の産物は、任意の新規な機能を有するか否かを決定することができます。このacufectionプロトコルは、皮膚病を治すために免疫応答を調節して新たな発見のための便利かつ実現可能なツールを提供しています。

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    Disclosures

    著者は、開示することは一切金銭興味を持っていません。

    Acknowledgments

    この作品は、科学技術省からの助成金によってサポートされていました(MOST 103から2633-B-002から002; 104から2320-B-002から048)。私たちは、博士に感謝します。原稿を読み取るためのベティ呉謝とハワイ大学のスタンフォード大学博士とピーター・ホフマンのNTUでチェンクオ・リー、リー・ゼボーニ、農業バイオテクノロジーの技術支援のためのNTUでユンチェン、博士ウェン・チ・ウェイ技術的助言のための中央研究院の研究センター。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

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    「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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