Summary
Denne protokollen er et kostnadseffektivt alternativ for uttrykking av nakent DNA-plasmid i musehud. Det overordnede målet for protokollen er å levere immun-relaterte gener i hudvev for å avgrense den funksjonelle rolle av et spesifikt gen i kutan inflammasjon.
Abstract
Feilregulering av immunrespons i hud er forbundet med mange humane hudlidelser. Direkte overføring av immunrelaterte gener i hudvev er en spennende måte å undersøke immunmodulering av kutan inflammasjon i musemodeller av humane sykdommer. Her presenterer vi en kostnadseffektiv protokollen som leveres nakent DNA i musehud og fører til transgen ekspresjon. Fremgangsmåten er laget "acufection", betegner acu punktering-mediert DNA-trans sjon. For å utføre acufection, ble musehud først tilført DNA i fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter stukket lett med en bunt av akupunkturnåler for å lette opptaket av DNA og transfeksjon inn i cellene. Plasmid-DNA blir antagelig tas opp av keratinocytt og dendrittiske celler (DCS) i huden og uttrykte til protein. Mekanisk stikk med nåler per se ikke forårsake hudskader eller indusere keratinocyte aktivering. Uttrykketav de transfekterte gener ble påvist i huden på begge transkripsjonelle og translasjonelle nivåer etter acufection i 2 dager og opprettholdes opp til 7 dager. Det primære målet for utviklingen av denne acufection metoden var å undersøke en tidligere udefinert isoform av IL-15. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, en alternativt spleiset IL-15-isoform med delvis fjernet exon 7 (IL-15ΔE7) ble uttrykt i huden og deretter behandlet med en Toll-lignende reseptor 7 (TLR7) agonist, Imiquimod (IMQ), for å indusere inflammasjon. Acufection levert IL-15ΔE7 i hud trykkes keratinocyttproliferering, epidermal tykkelse og neutrofilrekruttering i IMQ-indusert kutan inflammasjon. Med økende interesse for å identifisere de regulatoriske mekanismer av kutan inflammasjon, protokollen som er beskrevet her gir en kostnadseffektiv og allsidig alternativ til genet våpensystem eller microseeding for DNA-transporten in vivo. Det kan eventuelt gjøre det mulig oppdagelse av funksjonen til en romangen i huden eller for å undersøke ny behandling av kutane sykdommer.
Introduction
Huden er den første linjen i host forsvar. Keratinocytter (KCs) er den hovedcelletype som i hud hos mennesker og mus. I respons på miljømessige stimuli (for eksempel sollys, oksygen, kjemikalier og patogene invasjon), blir KCs aktivert og fremstille et bredt spekter av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, slik som IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α og GM-CSF-1. Sammen utløse rekruttering av immunceller i huden. Forverret kutan inflammasjon er ofte forbundet med en rekke humane sykdommer, inkludert akutt ektopisk kontakteksem og kroniske T-celle-mediert inflammasjon (for eksempel allergisk kontakt dermatitt og psoriasis) 2. Modulering av proinflammatoriske responser i huden ved å hemme aktiveringen KC er en plausibel tilnærming til behandling av kutan inflammasjon. Denne protokollen beskriver en ny tilnærming til forbigående å uttrykke et cytokin gen i epidermis for å studere immun response en følge av en slik behandling i huden.
Epidermis komponerer mest overfladiske lag av huden. Den tjener som en fysisk barriere for å holde eksterne stoffer slik som nukleinsyrer og patogener fra å komme inn i de dypere lag av huden. Flere nålefri teknikker har blitt etablert for epidermal DNA-overføring 3, 4. DNA i løsning eller i forbindelse med kationiske liposomer eller adenovirusvektorer har vært direkte anvendt på overhuden som er modifisert med teknikker, så som fjernelse av stratum corneum eller ved behandling med depilating reagens. Fjerning av forhornet epitelet letter DNA krysset epidermisbarrierefunksjonen og interaksjon med keratinocyter og Langerhans-celler for å indusere immunresponser 5. Mens en stor overflate er tilgjengelig for DNA overføring og denne tilnærmingen ikke involverer nåler, det er ulemper herunder kravetfor de store mengder av DNA (minst 10 - 100 ug), harde behandlingen på huden ved stripping, og de ujevne resultater i indusering av immunrespons i de immuniserte dyrene uten DNA-transporten booster 6. Mikropartikkel-mediert intracellulær levering av nakent DNA til huden har vist seg å være svært effektiv og reproduserbar for å indusere immunrespons 7, 8. En håndholdt genpistol har blitt brukt for å bombardere huden målstedet med plasmid DNA-belagte gull partikler 2 mikrometer diameter i størrelse ved hjelp av helium under trykk luftstrøm ni. Plasmid-DNA blir antagelig tas opp av KCsand dendrittiske celler (DCS) i huden og proteinet blir uttrykt lokalt eller som transporteres til drenerende lymfeknuter ved DC 10. Selv om genpistol systemet er enkelt og krever en begrenset teknisk erfaring, er kostnaden for fremstilling og levering av "DNA bulla "(dvs. gull pulvere, heliumgass) og for den genpistol selv har begrenset dens generelle anvendelse. I tillegg er det behov for en heliumgassleveringssystem begrenser den enkle genpistol transport når forsøkene utføres på forskjellige steder. Microseeding har vist seg å oppnå en høyere effektivitet av genoverføring enn enkel injeksjon og partikkelbombardement 11. Microseeding benytter en tatovering pistol for å levere DNA til huden uten bruk av partikkel kuler 11. oscillering av mikronåler på huden ved hjelp av denne metode vil sannsynligvis direkte skrape cellemembranen og derved overføre DNA til flere celler samtidig. imidlertid, smerte forbundet med det store antall injeksjoner med 0,254 mm diameter nåler er en ulempe.
Her gir vi en alternativ tilnærming til DNA levering in vivo. Den "acufection" 12. Mens acufection viser seg å være en enkel og mindre demanding metode for DNA-transporten in vivo, den optimale mengden av DNA for forskjellige gener og tider for å stikke brukerens hud må være nøye optimalisert for å oppnå reproduserbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hunnmus 8 - 12 ukers alder ble brukt i denne studien. C57 / BL6 villtype (WT) og IL-15 mangel (Il15 - / -) mus ble kjøpt fra National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan og Taconic Farm, henholdsvis. IL-15-manglende (Il15 - / -) og IL-15-dominant (+/- Il15 og Il15 + / +) viste et 1: 3 forhold i den andre generasjon fra den tverr av Il15 +/- heterozygot. Genotypen til Il15 - / - mus ble bekreftet ved hjelp av PCR-analyse. Mus ble opprettholdt i Specific Patogen Gratis (SPF) anlegg ved Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Alle dyr prosedyrer inkludert bedøvelses materialer og metoder ble utført i samsvar med dyret protokoll godkjent av National Taiwan University College of Medicine og College of Public Health Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (Affidavit av Godkjenning av Animal protokoll 20130225).
<p class = "jove_title"> en. Fremstilling av akupunkturnålerMERK: akupunkturnålene medisinsk utstyr bestående av et håndtak og en nål ende (figur 1A). Diameteren av • akupunktur nål varierte fra 0,2 mm (36 g) til 0,35 mm (28 g). Vi velger den fineste nålspissen slik at eventuelle overdreven celleskader under prikking i huden. Det er 4 forskjellige lengder av 0,2 mm nål hvorav 13 mm (0,5 tommer), 25 mm (1,0 tommer), 40 mm (1,5 tommer) og 50 mm (2,0 tommer) i lengde. En bunt av nåler 10 med 13 mm lengde gitt best behagelig grep ved oscillering av nålen på C57BL / 6 mus hud. Parametrene kan modifiseres dersom fremgangsmåten påført huden av større dyr eller utført av forskere med større hender.
- Fjern akupunktur nåler fra sterilt, ikke-pyrogent pakke. Sett nålene på en steril drapere.
- Bruk klebetape merking for å binde 10 nåler sammen ina bunt (figur 1B).
MERK: 10 nåler er geometrisk anordnet for å danne en sylinderform. For enkelhets skyld bruker et stykke av parafin film for å stabilisere anordningen før påføring av klebebånd. Sørg for at alle nålen peker er på samme plan. Ved hjelp av en bunt i stedet for en enkelt nål letter maksimal DNA-infusjon ved å øke kontaktarealet mellom nålene og huden.
2. Utarbeidelse av en stor mengde og endotoksin-free PlasmidDNA
- Transformere kompetente bakterieceller kjemisk med plasmid-DNA.
- Velg og inokulere en enkelt bakteriekoloni i 3 ml LB-medium inneholdende antibiotika og inkubert ved 37 ° C på en rister over natten.
- Skalere opp kulturen ved fortynning av bakteriekulturen ved 1: 100 i 250 ml LB-medium med antibiotika og risting over natt ved 37 ° C.
- Fremstill en stor mengde av DNA ved anvendelse av en høy kvaly, endotoksin-frie plasmidpreparat sensoren ved å følge produsentens instruksjoner.
MERK: Acufection protokollen krever høy renhetsgrad og en stor mengde av plasmid DNA. Anvendelse av et høy kvalitet, er endotoksin-frie og kolonne-renset plasmid DNA anbefalt. - Eluer DNA i sterilt vann. Oppbevares DNA i små porsjoner ved -20 ° C til de er klare for acufection.
MERK: Unngå gjentatte fryse-og-tine av DNA for å sikre konsekvent plasmid DNA uttrykk. - Fortynn plasmid DNA til 1 mg / ml i steril PBS for acufection.
3. Prosedyre for Acufection
NB: Den optimale mengden av DNA og det område av målet hudoverflaten kan variere for forskjellige gener og trenger å bli ytterligere optimalisert. Stikke-kraft og antall ganger for å løsne hornlaget av huden også kan variere avhengig av hudens tykkelse. Disse betingelser må være nøye bestemt etter vurdering av ekspresjonsnivået av genet acufected transcripts ved QRT-PCR.
- Vei musene og administrere tribromoethanol (400 ug pr gram kroppsvekt) ved peritoneal injeksjon.
MERK: 2,2,2-tribromoethanol er en injeksjon anestesimiddel som ble ofte brukt i mus. Oppløsninger fremstilles ved å oppløse et ikke-farmasøytisk kvalitet 2,2,2-tribromoethanol (2,5 g) i destillert vann (200 ml) inneholdende 2,5% 2-metyl-2-butanol. - Bruk veterinær øyelege salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.
MERK: anestesieffekten vil bli indusert i 1 - 2 min. Kontroller tå klype refleks for å sikre tilstrekkelig anestesidybden før bruk. - Barbere dorsale flanke huden og gjelder hårfjerningskrem for å oppløse proteiner keratin i håret.
MERK: Bruk av riktige krem for å fjerne hår vil lette tilførsel av DNA inn i huden. - Bruk vann gjennomvåt bomull baller til å tørke av Hårfjerningskrem.
MERK: Den riktige fløte er oppløselig i vann. Fullstendig fjerning av kremen will forhindre en fet overflate og sikre et bedre resultat stikking. - Bruk en steril bomullsdott dynket i 70% etanol for å desinfisere hudoverflaten.
- Mark målområdet (1 cm x 1 cm) på den hårfrie huden med en på forhånd målt sjablongen. MERK: Merking målet området vil bidra til å gjelde nålen bunt opp og ned innenfor et definert område. Dette er viktig for å sikre levering av den samme mengde DNA til et spesifikt overflateareal for å minimalisere eksperiment til eksperiment variasjon.
- Plasser en 10 ul dråpe av plasmid-DNA (10 ug) på den markerte huden.
NB: Mengden av DNA for acufection varierer med forskjellige gener og type ekspresjonsvektor. Mengden av DNA som brukes bør titreres nøye før du utfører eksperimentet av interesse. Den 10 ul er en liten dråpe flytende og den sitter godt på barbert og hårfrie huden uten å rulle ned mens stikkende. Omfatte en kontrollgruppe av mus ble behandlet med 10 ul tom vektor-DNA for å sammenligne med en muscufected med studien genet. - Hold akupunktur nål bunten (figur 1B), og stikke den markert overflate med en opp-og-ned-bevegelse til 100 ganger eller inntil fuktighets fra DNA i PBS på huden forsvinner. MERK: Det er rødhet i huden overflaten kan forekomme. Unngå å lage dype kutt som blør. Antallet opp-og-ned stikkende bevegelser på hudoverflaten er operativt bestemmes når fuktigheten fra DNA i PBS (10 pl) forsvinner fra huden. Vi bestemte oss for 100 ganger i 30 s fordi det har gitt de mest konsistente resultatene fra acufection levert gener. Hvis det er aktuelt, kan nålene gjenbrukes for opptil 6 target hud brodden (1 cm x 1 cm hver). Skyll de nåler i 70% etanol og PBS mellom acufection. Skifte til nye nåler når de er matte eller for annet plasmid DNA for å unngå kryssforurensning.
- Plasser acufected mus på en varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen til våken.
- Returner mus til buret når de hargjenvunnet nok bevissthet. Merk: Oppbevar acufected mus i separate bur (mindre enn 5 dyr per bur) fra buret av un-acufected mus.
- Sett vann flasken på plass og gå tilbake i buret til den IVC (individuelt ventilert bur) rack.
4. Postoperativ Care
- For de første 48 timer etter prosedyren, med nøye overvåke mus for en hvilken som helst ubehag herunder adferdsendringer (rastløshet, agitasjon eller spiseforstyrrelser) eller unormalt utseende (grov pels eller krum stilling).
5. Imiquimod (IMQ) Behandling av IL-15ΔE7-acufected Skin
MERK: Transkripsjonen ekspresjon og proteinproduksjon av acufected genet kan påvises på dag 3. Mus acufected med plasmid som er av interesse kan behandles med forskjellige typer av sentralstimulerende 3 dager etter transfeksjon. Vi viser her ved behandling av IL-15ΔE7-acufected musehud med IMQ krem. IMQ er en imidazoquinolin amin godkjent feller behandling av ytre genitale vorter og perinatale 13. Topisk IMQ behandling er vist å indusere humane psoriasis-lignende hudsykdommer hos mus med manifestasjon av flassende hud, epidermal proliferasjon og dermal neutrofil infiltrering 12, 14, 15.
MERK: Plasmidvektoren inneholdt full-lengde muse-IL-15-cDNA, under regulering av forlengelsesfaktor-1 α (PEF), flankert med en IL-2-signalpeptid og et FLAG tag ved den C-terminale ende (pEF-IL- 15, 5859 basepar), som ble konstruert som beskrevet av Bamford et al. 16. Plasmidet blir brukt som et IL-15 mal for å slette de første 16 aminosyrene ved restene 33 til 48 i exon 7 av IL-15-genet for IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 basepar) av SOE (syntese ved overlappforlengelse-) PCR-metoden 17. Bakteriekolonier som var vellykkettransformert med IL-15ΔE7 ble verifisert ved restriksjonsenzymoppslutning og etterfulgt av DNA-sekvensering 12, 18. En stor mengde av endotoksin-fri plasmid-DNA ble fremstilt som beskrevet i fremgangsmåten trinn 2.
- Bedøve acufected mus ved intraperitoneal injeksjon av tribromoethanol (400 ug pr gram kroppsvekt) og anvende veterinær ophthalmologic salve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi. Kontroller tå klype refleks for å sikre tilstrekkelig anestesidybden før starten av de operative prosedyrer. Merk Fordi en 2 cm x 2 cm hud vil bli behandlet for IMQ, er 2 doser av pIL-15ΔE7 plasmid-DNA (10 ug i 10 ul PBS pr dose) acufected på målsetene 2 (1 cm x 1 cm hver).
- Mark flanke hud (2 cm x 2 cm) som dekker acufected området.
- Bruke Q-tip applikatoren til topisk anvendelse IMQ krem på det markerte areal. Merk: trinn 5.1 blir kun utført etter den første dosen (60 mg / dose).De neste påfølgende doser som anvendes på ikke-bedøvede mus.
- Dokumentere endringer av IMQ behandlet rygg huden daglig med et HD-videokamera. Merk: En person holder musen mens en annen tar opp. Stillbilder er skutt og redigert på et senere tidspunkt.
- Avlive mus ved injeksjon av en overdose av tribromoethanol (800 ug pr gram kroppsvekt) fulgt av cervikal dislokasjon på dag 4 eller dag 7 etter IMQ behandling. Huden blir fjernet og behandlet (trinn 4.1 til 4.5).
6. Homogenate av Mouse Skin
- Bruke et par kirurgiske sakser for å lage et horisontalt snitt fra haleroten. Fortsett bilateralt til bunnen av bakben og fortsette å skjære vertikalt langs flanken til bunnen av forbena.
- skrelle forsiktig huden fra underliggende vev fra bakre til fremre. Bruk saks til å klippe av rygghuden. Plasser huden på en steril petriskål.
- Bruk en skalpell til å skjære målhud og fryse den i flytende nitrogen umiddelbart. Merk: Den samme størrelse av acufected huden uten (1 cm x 1 cm) eller med IMQ behandling (2 cm x 2 cm) er festet til hver mus for å minimalisere eksperiment-til-eksperiment variasjoner.
- Plasser den frosne hud vev i sentrum av en på forhånd avkjølt to-kammer-mørtel med håndtak og en støter. Bruke en ledning hammer på mørtelen til å pulverisere vevet.
- Raskt sted det pulveriserte vev til et nytt rør inneholdende 500 ul av cellelyse reagens for RNA-ekstraksjon eller til et rør inneholdende 50 ul av PBS og 1x protease inhibitor cocktail for å oppnå en protein lysat.
7. H & E og immunhistokjemisk farging av hud seksjon
- Plasser huden vev i en kassett og dyppe den i 4% paraformaldehyde natten.
- Embed og § vev, som i vårt tilfelle ble utført av Pathology Laboratory ved LAC, NTU. Merk: seksjon kuttes i en tykkelse på 5 mikrometer. Place vev sections bort på positivt ladede lysbilder.
- Varm lysbildene ved 65 ° C i 15 min.
- Plasser lysbilder i en farging rack. Dyppe stativet til tilsvarende tank inneholdende xylen erstatning i 5 minutter to ganger, etterfulgt av sekvensiell nedsenking i 100%, 95%, 80%, 75%, 60% og 50% etanol (5 min hver) for rehydratisering. Dyppe objektglassene i springvann i 3 minutter før farging.
- Utfør hematoxylin og eosin farging. Merk: H & E flekken ble utført på forespørsel Pathology Laboratory ved LAC, NTU.
- For immunhistokjemisk flekk, blokkere seksjon med blokk-løsning ved romtemperatur i 5 minutter for å redusere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging. Merk: Blokken Løsningen er kommersielt utviklet med farging teknikker. Ingen dyreserum inneholdes i dette produkt.
- Dypp sleiden i PBS for å skylle ut blokken løsningen.
- Fortynn blokken løsning i PBS ved 1:10 og tilsett 2% føtalt bovint serum (FBS) (fortynningsløsning).
- Flekken en serie seksjon i samme løp med den samme oppløsning utelate det primære antistoff for å kontrollere for ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoff.
8. Fotografi og analyse av farget vevsnitt.F.eks
- Visual H & E farget og IHC vevssnitt under et sterkt felt mikroskop. Ta bilder ved hjelp av ladningskoblet anordning (CCD) kamera festet til mikroskopet. for qKVANTITATIV analyse, kan bildebehandling benyttes
- Skanne hele farvede snitt ved hjelp av en scanscope med et 20X objektiv.
- Mål epidermal tykkelse i et 1-mm segment av epidermis og telle antallet Ki67-immunreaktive celler i segmentet.
MERK: Kvantitativ analyse er utført ved hjelp av mikroskopi automatisering og bildeanalyse programvare. Epidermal tykkelse er definert ved avstanden mellom basallaget og det ytterste lag av epidermis. - Tell antall Ly6G-immunreaktive celler i dermal området (230 x 270 mikrometer 2 rektangel) umiddelbart under aktuell IMQ-behandlet hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens noen rødhet var tydelig i løpet av den første timen etter stikk med akupunktur nåler, huden fjernet på dag 2, og ingen negativ hudreaksjon opp til dag 7 ble observert etter stikk (figur 2A). Nålen stikke-indusert meget lavt nivå av epidermal orthokeratosis og minimal dermal infiltrasjon ved H & E-analyse sammenlignet med ubehandlet hud (figur 2B). Epidermal tykkelse (figur 2C) og antallet Ki67 + celler (figur 2D) var sammenlignbare mellom nål-prikket og ubehandlet hud, noe som viser at akupunktur nål-prikket hud ikke forårsake merkbare avbrudd vev eller cellulær proliferasjon i overhuden. Sammenlignet med sprøytespissen (1,067 mm i diameter) 12, prikking med akupunktur nåler induserte reduserte nivåer av uttrykkene av chemokin CXCL-1 og proinflammatorisk cytokin IL-6 på dag 2 som fortsatte å minke på dag 5 (figur 3A). For å bekrefte ekspresjonen av transgenet i acufected musehud, ble et plasmid som uttrykker IL-15-cDNA acufected i huden av IL-15-manglende C57BL / 6 (IL-15 KO) mus. Selv om det ble observert lave nivåer av transkripsjon fra acufected plasmid DNA i hårfrie hud, oscillasjon med akupunktur nåler forbedret nivå av gentranskripsjon (figur 3B). IL-15-produksjon ble detektert på dag 2 og forble stabil opp til dag 7 (figur 3C). Disse resultater viser at acufection syrer effektivt plasmid-DNA og tillater ekspresjon av det kodede protein i huden uten å forårsake overdreven keratinocyte aktivering.
WT mus ble acufected med et plasmid som koder for IL-15ΔE7. Mus som uttrykte IL-15ΔE7 mRNA og protein inntil 3dager etter transfeksjon (figur 4A). Musene ble deretter behandlet topisk med krem IMQ på dag 3. Samtidig IMQ behandling av fremkalt sølvflak i kontroll WT mus, IMQ-induserte sølvfargede flak ble redusert i IL-15ΔE7 acufected WT mus (Figur 4B). Interessant, ekspresjon av IL-acufected 15ΔE7 hemmet signifikant Ly6G + neutrofil infiltrering inn IMQ-behandlede huden sammenlignet med WT unacufected hud (figur 4C) 12. Ved acufection, demonstrerte vi romanen funksjon av IL-15ΔE7 i huden. IL-15ΔE7 modulerer IMQ-induserende nøytrofil infiltrasjon.
Figur 1. Illustrasjon av akupunkturnåler. (A) akupunktur nål (36 G x 0,5" ) består av enhåndtak og en nålende. (B) Ti akupunkturnåler er bundet i en bunt ved hjelp av klebebånd. Lengden av bunten er omtrent 4 cm, målt ved den linjal (nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Pricking av akupunkturnåler ikke forårsaker Merkbar hudskader eller Keratinocytt aktivering. (A) med tre områder som står med grå rutene på barbert og hårfrie hud flanke av musen ble stukket 100 ganger hver ved akupunktur nåler. Bildene ble tatt på den første timen og opp til 7 dager etter stikk å overvåke hudskader. Barbert og hårfrie huden uten nål stikk ble anvendt som kontroll. <strong> (B) H & E-analyse av formalin-fikserte paraffininnstøpte, hud seksjoner fra ubehandlet eller nål-prikket musehud. Skalastolpe: 100 pm. (C) en millimeter-segment av H & E-fargede seksjoner fra ubehandlet eller nål-pricked musehud ble valgt for å måle epidermal tykkelse (avstanden fra basis til det ytterste laget). Hver søyle representerer gjennomsnittet av epidermal tykkelse målt fra 3 hud seksjoner. Feil stolpe representerer standardfeil av middelverdien (SEM). Betydningen av forskjell mellom gruppene ble testet av uparet Student t-test. (D) seriesnitt av de samme prøvene ble farget med anti-Ki67 for immunhistokjemisk analyse. Hver søyle representerer gjennomsnittet av Ki67 + celler lokalisert i hver 150 pm-epidermis i lengde per 1 mm segment. Feil stolpe representerer standardfeil av middelverdien (SEM). Betydningen av forskjell mellom grupper ble testet ved to-veis ANOVA follskylder Bonferroni post hoc test. (ns: ikke signifikant). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Acufection uttrykker effektivt protein av interesse uten å forårsake Merkbar Keratinocytt Aktivering. (A) barbert og hårfrie hud flanke forble ubehandlet (NTC), skrapes med 1,067 mm diameter (19 G) sprøytenål (SYR.) Eller stikk 100 ganger ved akupunktur nåler (ACU.). De transkripsjonsnivåer av CXCL-1 og IL-6 på dag 2 og dag 5 ble målt ved hjelp av QRT-PCR (n = 3). (B) barbert og hårfrie hud av IL-15-manglende mus ble topisk påført med en dråpe av en plasmid-DNA som uttrykker IL-15 uten å måttet (hårfjerning) eller med akupunktur nål stikke-(hårfjerning + stikk). Transkripsjonen av IL-15 i hver gruppe på dag 2 ble målt ved hjelp av TaqMan QRT-PCR. Transkripsjonen av IL-15 kunne påvises i PBS kontroll (NTC) av IL-15-manglende mus. (C) IL-15 produksjonen av IL-15-manglende mus hud som var ubehandlet eller IL-15-acufected for forskjellige dager (en vev for hver dag) ble målt ved hjelp av IL-15 ELISA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Demonstrasjon av IL-15ΔE7 Demper IMQ-indusert Sølv Hudflak og inhiberer nøytrofil infiltrasjon. (A) Den transkripsjonelle nivå og proteinproduksjon av IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6, E7) eller tom vektor-kontroll (WT / pEmpty) hud ble målt ved QRT-PCR og ELISA (n = 2, hvert tidspunkt), henholdsvis. (B) Empty vektor- eller IL-15ΔE7-acufected flanke hud på dag 3 ble topisk behandlet med IMQ krem (60 mg). Fotografier av WT / pEmpty og WT / pIL-15ΔE7 mus flanke på dag 6 etter behandling IMQ. (C) Hud seksjoner fra WT / pEmpty eller WT / Pil-15ΔE7 mus etter IMQ behandling på dagene 3 og 6 ble farget med anti-Ly6G antistoff og nummerert. Hver søyle representerer gjennomsnittet av Ly6G + celler fra 4 IMQ-behandlede mus. Feil stolpe representerer standardfeil av middelverdien (SEM). Betydningen av forskjell mellom grupper ble testet ved to-veis ANOVA, etterfulgt av Bonferroni post hoc test. Paneler A og C er modifisert med tillatelse fra Journal of Investigative Dermatology, lisensnummeret 3901890227597. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske trinn for å sikre ekspresjonen av acufected plasmid-DNA er for jevnt å oscillere og løsne hornlaget av huden. Mens du skyver nålene forsiktig uten å kutte i huden, bør kraften være vanskelig nok å trykke på overflaten. For å lette opptaket av DNA i 10 ul løsning på en 1 cm x 1 cm overflateareal, bør nålene oscillere opp-og-ned til omtrent 100 ganger i 30 sek. Man kan bestemme den kraft som må stikke huden, og ved å notere det antall ganger som er nødvendig for å gi den beste ekspresjonsnivået av den acufected genet.
Modifisering for mengden av plasmid-DNA som anvendes for å oppnå et tilfredsstillende nivå av ekspresjon etter acufection kan være nødvendig, fordi det kan variere for forskjellige gener. Titrering eksperimenter må utføres for å bestemme den optimale mengde av plasmid DNA som skal påføres før forsøket også. Resultater fra kvantitativ RT-PCR-analyse vil bidra til å bestemme optimal mengde av plasmid DNA og den beste forutsetning for å oppnå reproduserbare resultater.
Den nøyaktige mekanisme av den acufection prosessen gjenstår å klarlagt. Mens transkripsjon fra topisk levert plasmid DNA skjedde i barbert og hårfrie hud på et lavt nivå, prikking av akupunktur nåler forbedret transfeksjonseffektiviteten (figur 3B). Ved analogi av microseeding protokoll hvor flere perforeringer med tatoveringen pistolen 11, blir acufection-levert plasmid DNA sannsynlig lettes gjennom skrape av cellemembranen av keratinocytter og hårsekker 19, 20. Stimuleringer av epidermis ved hårfjerning, depilating reagens og nål oscillation kan indusere keratinocytt-aktivering i en viss grad, og ytterligere forbedre DNA opptak av Langerhans og DC 6. En begrensning av denne fremgangsmåte er at mengden av plasmid DNA som taes oppav celler kan ikke kontrolleres nøyaktig. Vi vil ikke foreslå å bruke denne metoden for å behandle et stort hudområde. For å minimere variasjoner i ekspresjonsnivåer av det leverte genet blant eksperimenter, bør volumet av DNA-løsningen og størrelsen på målet hudoverflaten være festet til det samme sett av forsøk. For å generere reproduserbare resultater, er det tilrådelig at replikere eksperimenter skal utføres av samme person.
Med hensyn til den genpistol anordningen og microseeding, til bruk av en bunt av akupunkturnåler levere nakent DNA er billig. Prosedyrene er også grei. Det krever svært lite teknisk erfaring til å følge acufection protokollen. Acufection forårsaker minimal traume til dyr og intet vekttap er funnet etter operasjonen. Graden av smerte er lav, bedømt ved fravær av vesentlige atferdsendring etter acufection operasjon.
I sammendrag, ved hjelp av akupunkturnåler for å løsnehornlaget av huden for DNA-opptak av vertscellene gir et økonomisk alternativ metode for å uttrykke et protein i musehud. Et bredt spektrum av immunrelaterte gener har ennå å være funksjonelt, karakterisert ved huden 21, og dette understreker behovet for en rask undersøkelse av et nytt gen på huden. Ved å anvende denne metoden, kan man lett bestemme hvorvidt et produkt av genet som er av interesse har en hvilken som helst ny funksjon. Denne acufection protokollen gir en praktisk gjennomførbar og verktøy for nye oppdagelser i modulerimmunrespons for å kurere kutan sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av bevilgning fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Vi takker legene. Betty Wu-Hsieh og Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni ved Stanford University og Dr. Peter Hoffmann ved University of Hawaii for å lese manuskriptet, Yun Chien ved NTU for teknisk assistanse, og Dr. Wen-Chi Wei ved Landbruk Bioteknologi Research Center ved Academia Sinica for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
