Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

"Acufection" ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır.

Abstract

Deride bağışıklık yanıtının düzensizliği sayısız insan derisi bozuklukları ile ilişkilidir. deri dokusu, bağışıklık ile ilişkili genlerin doğrudan transferi insan hastalıklarının fare modellerinde deri inflamasyon, immün modülasyonunu araştırmak için ilginç bir yaklaşımdır. Burada fare deri çıplak DNA teslim ve transgen ifadesine yol açan düşük maliyetli bir protokol mevcut. Yöntem, aku delinmez aracılı DNA trans Fection belirten, "acufection" terimini almaktadır. acufection gerçekleştirmek için, fare deri önce fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde DNA ile aşılanmış ve daha sonra hücrelere DNA emme ve transfeksiyon kolaylaştırmak için akupunktur iğneleri bir paket ile hafifçe dürtülmüş. plazmid DNA muhtemelen keratinositler ve deride dentritik hücreler (DC'ler) ile alınır ve protein içine eksprese edilir. Iğneler bizatihi Mekanik prick zarar veya keratinosit aktivasyonunu uyarmadı. İfadetransfekte olmuş genlerin 2 gün acufection aşağıdaki transkripsiyonel ve translasyonel her iki düzeyde de deride tespit edildi ve 7 güne kadar sürmüştür. Bu acufection yöntemin geliştirilmesi için birincil amacı, IL-15, daha önce tanımlanmamış izoformu araştırmaktır. inflamasyonunu indüklemek amacıyla, deride eksprese edilir ve daha sonra bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) agonisti, imikimod (IMQ) ile muamele, bu yöntem, kısmen silinmiş ekson 7 (IL-15ΔE7) bir alternatif olarak eklenmiş, IL-15 izoformunun edildi kullanılması. Acufection teslim deri IL-15ΔE7 IMQ bağlı deri iltihabı, keratinositlerin çoğalmasını, epidermal kalınlığı ve nötrofil bastırılır. Kutanöz enflamasyon düzenleyici mekanizmaların tanımlanması artan ilgi ile, protokol burada tarif edilen in vivo olarak DNA nakli için gen tabancası sistemi ya da mikro-için uygun maliyetli bir ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Bu potansiyel olarak bir yeni fonksiyonunun keşif izin verebilirderide veya kutanöz hastalıklar için yeni tedavi araştırmak için gen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cilt konak savunmasının ilk basamak olduğunu. Keratinositler (KCs), insanlarda ve farelerin derisinde başlıca hücre tipidir. Çevresel uyarılara (örneğin, güneş ışığı, oksijen, kimyasal ve patojenik invazyonu) yanıt olarak, KCs aktif ve IL-8, IL-6, IL-1a, IL-1 p, TNF-a gibi iltihap öncesi sitokinler ve kemokinlerin geniş bir yelpazeye üretirler α ve GM-CSF 1. Birlikte cilde bağışıklık hücrelerinin alınmasını tetikleyebilir. Ağır deri iltihabı sıklıkla akut ektopik kontakt dermatit, kronik bir T hücresi aracılı enflamasyonun (örneğin, alerjik kontak dermatit ve psoriasis) 2 dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalıkları ile bağlantılıdır. KC aktivasyonunu inhibe ederek derideki inflamatuar öncesi yanıtları modüle deri iltihabı tedavi etmek için makul bir yaklaşımdır. Bu protokol geçici bağışıklık res incelemek amacıyla epidermiste bir sitokin gen ifade için yeni bir yaklaşım anlatılmaktadırderide böyle bir muameleye sonuçta ponse.

epidermis cildin en yüzeysel tabakası oluşturur. Bu tür cildin daha derin katmanları girmesini nükleik asitler ve patojenler olarak dış maddeleri tutmak fiziksel bir engel olarak görev yapar. Çeşitli iğnesiz teknikler epidermal DNA transferi, 3, 4 için kurulmuştur. Solüsyon içindeki DNA veya katyonik lipozomlar veya adenovirüs vektörleri ile bağlantılı doğrudan bu stratum corneum'un çıkarılması ya da reaktif tüylerini giderildikten ile muamele gibi teknikleri ile modifiye epidermise tatbik edilmiştir. Kornifiye epitel çıkarılması, DNA bağışıklık tepkilerini 5 indükleme keratinositler, Langerhans hücreleri ile epidermal bariyer ve etkileşim geçen kolaylaştırır. Bir geniş yüzey alanı, DNA transferi için mevcuttur ve bu yaklaşım iğneler dahil etmese de, ihtiyacı da dahil olmak dezavantajları vardırsıyrılmasıyla - (100 ug 10), cilt üzerinde sert tedavi ve DNA verme güçlendirici 6 olmayan bağışıklık kazandırılmış hayvanlarda bağışıklık tepkisini indüklemede tutarsız sonuçlar DNA'nın büyük miktarlarda. Deriye Çıplak DNA mikropartikül aracılı hücre için bağışıklık tepkisi 7, 8 indüklemek için yüksek verimli ve tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Elde tutulan bir gen tabancası basınçlı helyum hava akışı 9 yardımıyla büyüklüğü 2 um çaplı plazmid DNA ile kaplanmış altın partikülleri ile cildin hedef sitesi bombardıman için kullanılmıştır. Plazmit DNA, muhtemelen deri KCsand dendritik hücreler (DC) tarafından alınır ve protein yerel olarak ifade edilir veya DC'ler 10 ile lenf düğümleri taşınır. Gen tabancası sistemi basit ve sınırlı teknik deneyim, "DNA bul, hazırlanması ve teslim için maliyet gerektirse deizin "(yani altın tozlar, helyum gazı) ve gen tabancası için kendisi genel uygulamasını sınırlamıştır. deneyler farklı yerlerde yapılmaktadır Buna ek olarak, bir helyum gaz iletim sistemi için ihtiyaç gen tabancası taşıma kolaylığı sınırlar. mikro- tek bir enjeksiyon ve partikül bombardımanı 11'den daha gen transferinin bir yüksek verim elde etmek için ortaya konmuştur. mikro-parçacık boncuk kullanılmadan deriye DNA verilmesi için bir dövme silah kullanan 11. Salınımlı Bu yaklaşımı kullanarak, tüm cilt üzerine mikroiğneler muhtemeldir şirketinden aynı anda birden fazla hücrelere DNA transferi, böylece, hücre zarını, kazıma ve. Bununla birlikte, 0.254 mm çapında iğne ile enjeksiyon çok sayıda ilişkili ağrı bir dezavantajdır.

Burada in vivo DNA aktarımından için alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. "Acufection" 12 ile gösterilmiştir. acufection kanıtlıyor olsa kolay ve daha az dema olmakin vivo olarak DNA nakli için bir yöntem nding, farklı genler ve cilt dikmek için kez, en uygun DNA miktarı da yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için optimize edilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

8'de Dişi fareler - 12 haftalıkken bu çalışma için kullanıldı. C57 / BL6 sokak türü (WT) ve eksik IL-15 (IL-15'te - / -) fareler sırasıyla Ulusal Laboratuvarı Hayvan Merkezi (NLAC), Tayvan ve Taconic Farm, satın alınmıştır. IL15 +/- heterozigot çaprazlamasından ikinci kuşak: 3 oranında IL eksikliği-15-(IL15 - / -) ve IL-15-baskın (IL15 +/- ve IL15 + / +), 1 gösterdi. IL15 genotipi - / - fareleri, PCR analizi ile teyit edilmiştir. Fareler Laboratuar Hayvanları Merkezi (LAK), Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp (NTU) Üniversite de Spesifik Patojen (SPF) tesis içinde tutulmuştur. anestetik madde ve yöntemlerin dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri Halk Sağlığı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) (Hayvan Protokolü 20130225 Onaylanmasının Yeminli) Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Koleji ve Koleji tarafından onaylanan hayvan protokolüne uygun olarak gerçekleştirildi.

<p class = "jove_title"> 1. Akupunktur iğneleri hazırlanması

Not: akupunktur iğneleri bir sap ve bir iğne ucu (Şekil 1A) oluşan tıbbi cihazlardır. akupunktur iğne çapları 0.35 mm (28 g) 0.2 mm (36 g) arasında değişmektedir. Biz deriyi delmeden sırasında olası aşırı hücre hasarı önlemek için iğnenin en ince noktası seçin. 13 mm (0.5 inç), 25 mm (1.0), 40 mm (1.5 inç) ve uzunluğu 50 mm (2.0) dahil olmak üzere 0.2-mm iğne 4 farklı uzunlukları vardır. 13 mm uzunluğunda 10 iğne bir demet, C57BL / 6 fare deri üzerinde iğne salınım sırasında en iyi rahat bir kavrama sağladı. yöntem daha büyük hayvan derisine uygulanır ya da daha büyük bir eliyle araştırmacılar tarafından gerçekleştirilirse parametreler değiştirilebilir.

  1. Steril olmayan pirojenik paketinden akupunktur iğneleri çıkarın. steril bir örtü üzerine iğne yerleştirin.
  2. i 10 iğneler birbirine bağlamak için yapıştırıcı etiketleme bandı kullanınna demeti (Şekil 1B).
    Not: 10 iğneler geometrik bir silindir şekli oluşturmak üzere düzenlenmiştir. kolaylık sağlamak için, yapışkan bant uygulamadan önce düzenleme stabilize etmek için, parafin bir film parçası kullanılır. Bütün iğne noktaları aynı düzlemde olduğundan emin olun. yerine, tek bir iğne, bir paket kullanılarak iğne ve deri arasındaki temas alanını arttırarak maksimum DNA infüzyon kolaylaştırır.

2. Büyük miktarda hazırlanması ve endotoksin içermeyen plazmid DNA

  1. plazmid DNA'sı ile kimyasal olarak kompetan bakteriyel hücreleri dönüştürmek.
  2. Seçip LB ortamı antibiyotik içeren 3 mL tek bir bakteriyel koloni inoküle ve gece boyunca bir çalkalayıcı içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  3. C antibiyotikler ile LB ortamında 100 250 mL ve 37 ° C'de gece boyunca çalkalama: 1 ile bakteri kültürü seyreltilerek kültürünü Scale
  4. yüksek qualit kullanılarak DNA'nın büyük miktarda hazırlanmasıy, imalatçının talimatlarına uygun endotoksin serbest plazmid hazırlama kiti.
    Not: Acufection protokol, yüksek saflık ve plazmid DNA'nın büyük bir miktarda kullanmak gerekir. yüksek kalitede kullanımı olup, endotoksin serbest ve kolon saflaştırılmış plazmid DNA önerilir.
  5. Steril su içinde DNA elute. acufection için hazır olana kadar -20 ° C'de küçük parçalar halinde saklayın DNA arasında değişir.
    NOT: Tutarlı plazmid DNA ifadesini sağlamak için DNA'nın tekrarlanan donma-ve-çözülme kaçının.
  6. acufection için steril PBS içinde 1 mg / mL ila plazmid DNA seyreltin.

Acufection 3. Prosedürü

Not: DNA optimal miktarı ve hedef deri yüzeyi alanı farklı genler için farklı ve daha fazla optimize edilmesi gerekebilir. iğneleyici gücü ve sayısı deri kalınlığına bağlı olarak değişebilir da derinin boynuzsu tabaka gevşetmek için. Bu şartlar dikkatli bir şekilde acufected gene transcri ekspresyon seviyesini değerlendirmek sonra tespit edilmelidirQRT-PCR ile pn.

  1. fareler tartılır ve peritoneal enjeksiyonu ile tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) yönetmek.
    NOT: 2,2,2-tribromoetanol yaygın farelerde kullanılan bir enjekte edilebilir anestezik maddedir. Çözelti 2-metil-2-butanol% 2.5 ihtiva eden damıtılmış su (200 mL) içinde bir farmasötik olmayan kalite 2,2,2-tribromoetanol (2.5 g) çözülmesiyle yapılmaktadır.
  2. anestezi altında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmolojik merhem kullanın.
    Not: - 2 dakika anestetik etki 1 indüklenebilir olacaktır. Ameliyattan önce anestezi yeterli derinliğinin sağlanması için ayak tutam refleksini kontrol edin.
  3. dorsal yan deriyi Tıraş ve saç gövdesine keratin proteinleri çözmek için tüy dökücü krem ​​uygulayın.
    NOT: saç kaldırmak için tüy dökücü krem ​​kullanımı deriye DNA'nın infüzyon kolaylaştıracaktır.
  4. tüy dökücü krem ​​temizlemek için su ile ıslatılmış pamuk topları kullanın.
    NOT: tüy dökücü krem ​​suda çözünür. krem wil tamamen çıkarılmasıL, bir yağlı yüzey önlenmesi ve daha iyi bir sonuç elde iğneleyici.
  5. Deri yüzeyi dezenfekte etmek için% 70 etanol ile ıslatılmış steril bir pamuk bez kullanın.
  6. Mark önceden ölçülmüş şablon ile tüy dökücü krem ​​uygulanmış deri üzerinde hedef alanı (1 cm x 1 cm) olabilir. NOT: Hedef sitesini İşaretleme yukarı ve aşağı tanımlanmış alanı içinde iğne demetini uygulamak için yardımcı olacaktır. Bu deneme için-deney varyasyonu en aza indirmek için belirli bir yüzey alanına DNA aynı miktarda verilmesini sağlamak için önemlidir.
  7. belirgin deri üzerine plazmid DNA (10 ug) 'in bir 10 uL damla yerleştirin.
    Not: acufection için DNA miktarı farklı genler ve sentezleme vektörünün tipine göre değişir. kullanılan DNA miktarı dikkatlice ilgi deneyini yürütmekte önce titre edilmelidir. 10 uL, küçük bir sıvı madde damlası olup, batıcı ise yuvarlanma olmayan traş ve tüy dökücü krem ​​uygulanmış Cilt üzerinde oturur. Fareler ile karşılaştırmak için 10 uL boş vektör DNA ile tedavi edilen farelerin, bir kontrol grubu olarak dahilÇalışma genle cufected.
  8. Akupunktur iğne demeti (Şekil 1B) tutun ve 100 kat ya da deri ortadan PBS DNA nem kadar bir yukarı-ve-aşağı hareketle işaretlenmiş yüzey delin. NOT: Cilt yüzeyinin bazı kızarıklık oluşabilir. kanamaya derin kesikler yapmaktan kaçının. PBS içinde DNA nem (10 uL) deri üzerinde kaybolur, deri yüzeyinde hareketleri iğneleyici yukarı ve aşağı sayısı işlevsel belirlenir. o acufection-teslim genlerden en tutarlı sonuçlar vermiştir, çünkü Biz 30 s 100 kez verdi. Mevcut ise, iğneler kadar 6 hedef deri dürtmelerin (1 cm x 1 cm) ile yeniden kullanılabilir. acufection arasında,% 70 etanol ve PBS içinde iğneler durulayın. bunlar, mat ya da çapraz kontaminasyonu engellemek için farklı plazmid DNA olduğunda yeni iğne ile değiştirin.
  9. Uyanıncaya kadar vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine acufected fareler yerleştirin.
  10. onlar varken onların kafesine fareler dönünçıktı yeterli bilinç. Not: un acufected farelerin kafes ayrı kafes içinde acufected fareler tutulur (kafes başına en az 5 hayvan).
  11. yerine su şişesi koyun ve IVC (tek tek havalandırılan bir kafes) rafına kafesi döndürür.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. İşlem sonrası ilk 48 saat için, yakın bir davranış değişiklikleri (huzursuzluk, ajitasyon ya da yeme bozukluğu) ya da anormal görünüş (kaba saç ceket veya kambur duruş) dahil olmak üzere herhangi bir rahatsızlık için fareler izler.

IL-15ΔE7-acufected Cilt 5. İmikimod (IMQ) Tedavi

Not: acufected geninin transkripsiyonel ifadesi ve protein üretimi ilgilenilen plazmid Transfeksiyondan 3 gün sonra uyarıcıların farklı tipleri ile tedavi edilebilir olan acufected 3. gün farelere saptanabilir. Biz IMQ krema ile IL-15ΔE7-acufected fare cildi tedavi ederek burada gösterilmektedir. IMQ bir imidazokinolin amin onaylanmış fya da dış genital ve perinatal siğiller 13 muamele edilmesi. Topikal IMQ tedavisi pul pul deri epidermal proliferasyonu ve dermal nötrofil infiltrasyon 12, 14, 15 tezahürü ile farelerde insan sedef gibi cilt bozukluklarının neden olduğu gösterilmiştir.

Not: Plazmit vektörü C-ucuna (pEF-IL-de, bir IL-2 sinyal peptidi ve bir FLAG etiketi ile çevrili uzama faktör-1 alfa düzenlenmesinde (PEF) altında, tam uzunlukta fare IL-15 cDNA, içerdiği Bamford ve arkadaşlarının tarif edildiği gibi inşa edilmiştir 15, 5859 baz çifti). 16. Plazmid kalıntılarında ilk 16 amino asidini silmek için bir IL-15, şablon olarak 33 kullanılır - KİT IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 baz çifti), IL-15 geninin ekson 7 48 (sentezi üstüste binme uzantısı) PCR yöntemi 17 ile. Başarıyla vardı Bakteri kolonileriIL-15ΔE7 ile transforme sınır enzimi sindirimi ile doğrulanmıştır ve DNA dizilimi 12, 18 ile takip edildi. protokolün adım 2'de tarif edildiği gibi, endotoksin içermeyen plazmid DNA'nın büyük bir miktar elde edilmiştir.

  1. tribromoetanol (g vücut ağırlığı başına 400 ug) karın içinden enjeksiyonu ile acufected fareler anestezi ve anestezi altında kuruluk önlemek için göze veteriner oftalmolojik merhem uygulanır. operatif prosedürler başlamadan önce anestezi yeterli derinlikte temin etmek ayak tutam refleksini kontrol edin. Not: 2 cm x 2 cm deri IMQ tedavi olacağından, pIL-15ΔE7 plazmid DNA (doz başına 10 uL PBS içinde 10 ug) 2 doz 2, hedef merkezler üzerinde acufected (1 cm x 1 cm) ekstrakte edildi.
  2. Mark deri (x 2 cm, 2 cm) acufected alanı kapsayan çevrelemektedir.
  3. topikal işaretli yüzey alanı üzerinde IMQ kremi uygulamak için Q-uçlu aplikatör kullanın. Not: adım 5.1 yalnızca ilk dozu (60 mg / doz) için gerçekleştirilir.Bir sonraki ardışık doz olmayan anestezi edilmiş farelerin uygulanır.
  4. yüksek çözünürlüklü kamera ile günlük IMQ ile tedavi edilen dorsal cilt değişiklikleri belgelemek. Not: Bir kişi başka kaydedilirken fare tutar. Hareketsiz resimler vurularak daha sonra düzenlenir.
  5. IMQ tedavi gün sonra 4 ya da 7. günde servikal dislokasyon tribromoetanol aşırı dozda (g vücut ağırlığı başına 800 ug) enjekte fareler öldürülür. Cilt kesilmiş ve işlenir (- 4.5 4.1 Adımları).

Fare Skin 6. Homojenat

  1. Kuyruğun tabanından yatay kesim yapmak için cerrahi bir makas kullanın. arka bacağın tabanının iki taraflı devam ve ön ayakları tabanına yan boyunca dikey olarak kesim devam etmektedir.
  2. Dikkatle ön posterior yatan dokusundan derisini yüzeceğim. dorsal derisini kesmek için makas kullanın. Steril bir Petri tabağına cilt yerleştirin.
  3. Hedefi kesilmesi için bir neşter kullanınderi ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur. Not: Deney-için-deney varyasyonu en aza indirmek için, her bir fare için sabit olan aynı olmayan acufected cilt boyutu (1 cm x 1 cm) veya IMQ tedaviden (2 cm x 2 cm).
  4. kolları ve havan eli ile önceden soğutulmuş bir 2 bölmeli harç merkezinde donmuş deri dokusu yerleştirin. doku toz haline getirmek için harç üzerinde bir kurşun çekiç kullanın.
  5. Hızla RNA ekstraksiyonu için ya da protein lizatı elde etmek için 50 ul PBS ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli içeren bir tüp hücre liziz reaktifi 500 uL içeren yeni bir tüpe toz doku yerleştirin.

Cilt, Bölüm 7. H & E ve immünohistokimyasal boyanması

  1. bir kaset içinde cilt dokusu ve gece boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın.
  2. bizim durumumuzda LAC, NTU'da Patoloji Laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi yerleştir ve bölüm doku. Not: Bölüm 5 um kalınlığında kesilir. Talep doku sectipozitif yüklü slaytlar üzerine ons.
  3. 15 dakika boyunca 65 ° C'de slaytlar ısıtın.
  4. Bir boyama rafa slaytları yerleştirin. iki kez 100,% 95,% 80,% 75,% 60 ve% rehidrasyon için% 50 etanol (her biri 5 dakika) ardışık daldırma izledi 5 dakika için ksilen yerine içeren tank karşılık gelen raf bırakın. boyama öncesi 3 dakika musluk suyunda slaytlar bırakın.
  5. hematoksilen eozin boyama gerçekleştirin. Not: 'H & E boyama LAC, NTU'da Patoloji Laboratuarına talep üzerine uygulandı.
  6. immünohistokimyasal boyama için, spesifik olmayan arka plan boyaması azaltmak için 5 dakika boyunca oda sıcaklığında blok çözeltisi ile bölüm bloke eder. Not: blok çözeltisi, ticari olarak immüno-lekeleme teknikleri ile geliştirilmiştir. Hiç bir hayvan serumu bu üründe yer almaktadır.
  7. blok çözeltisi çalkalamak için PBS içinde slayt batırın.
  8. 1:10 PBS içinde blok çözeltisi ile seyreltilir ve% 2 fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (seyreltici çözeltisi) ekleyin.
  9. Aynı çözelti ikincil antikor, spesifik olmayan bağlanmanın kontrol edilmesi için ilk antikoru ihmal ile aynı vadede bir seri bölüm leke.
  • Yıkama 5 dakika her biri için TBS içinde üç kez artı% 0.1 Tween-20 (TBST çözelti) kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm.
  • her bölüme etiketli polimerlerin bir damla pipet ve 40 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Not: etiketli polimer, ticari olarak bir Fab' fragmanı indirgenir peroksidaz ve sekonder antikor amino asit polimerleri birleştirilerek hazırlanır. Reaktif için kullanıma hazırdırFare doku kesitlerinin immünohistokimyasal boyanması.
  • Yıkama 5 dakika her biri için TBST üç kez kayar. yıkar arasında değiştirme çözüm.
  • Pipet 3,3'-diaminobenzindine doku bölümü üzerine tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi ve kahverengi bir çökelti, parlak alan mikroskopisiyle görülene kadar oda sıcaklığında beklemeye bırakılır. Not: DAB peroksidaz varlığında çökelmesi için süre yaklaşık 30 dakikadır.
  • peroksidaz aktivitesini durdurmak için suda bırakın slaytlar. nükleer boyanma için metil yeşil çözeltide Dip slaytlar. Yıkama 5 dakika her biri için PBS içinde üç kez kayar.
  • Kalıcı montaj ortamına (bölüm başına 8 uL) ile kaplanır lekeli bölümü üzerine bir lamel yerleştirin.
  • 8. Fotoğraf ve Analiz Lekeli doku kesitinin

    1. parlak saha, mikroskop altında, H & E ile boyanmış ve IHC doku bölümleri görselleştirmek. mikroskop bağlı şarj birleştiğinde cihaz (CCD) kamera ile resimler çekin. quantitative analiz, görüntüleme yazılımı kullanılabilir
      1. Bir 20X amacı ile bir scanscope kullanarak bütün lekeli bölümleri tara.
      2. Epidermisin bir 1-mm kesimi içinde epidermal kalınlığı ölçülür ve segment içinde Kİ67-immüno-reaktif hücrelerin sayısı.
        NOT: Kantitatif analiz mikroskopi otomasyonu ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılır. Epidermal kalınlığı taban tabakası ve epidermisin en dış tabakası arasındaki mesafe ile tanımlanır.
      3. Hemen topikal IMQ ile tedavi edilen derinin altında deri alanına (230 x 270 um 2 dikdörtgen) içinde Ly6G-immüno-reaktif hücrelerin sayısı.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Bazı kızarıklık akupunktur iğne ile delmeden sonra ilk saat içinde belirgin iken, cilt 2 gün temizlenir ve 7 gün kadar olumsuz deri reaksiyonu (Şekil 2A) batıcı sonra gözlenmiştir. İğne iğneleyici görmemiş deri (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında, H & E analizi ile epidermal orthokeratosis ve en az deri infiltrasyonu çok düşük seviyede indüklenmiş. Epidermal kalınlık (Şekil 2C) ve Ki 67 + hücrelerinin sayısı (Şekil 2D), akupunktur iğne ile delinir deri epidermiste fark doku bozulması veya hücre çoğalmasına neden olmadı gösteren, iğne ile delinir ve işlem görmemiş deri arasında karşılaştırılabilir olmuştur. Akupunktur iğnelerle kemokin CXCL ifadelerinden kaynaklı düşen seviyeleri iğneleyici şırınga iğnesi ile karşılaştırıldığında (çapı 1.067 mm) 12,1 ve proenflamatuar sitokin IL-6, günde 2 gün 5 (Şekil 3A) üzerinde azalmaya devam etmiştir. Fare deride acufected transgen ekspresyonu doğrulamak için, IL-15, cDNA eksprese eden bir plazmid, IL-15 eksikliği olan C57BL / 6 (IL-15 KO) farelerin derisinde acufected edildi. Acufected plazmid DNA transkripsiyon düşük seviyelerde tüy dökücü krem uygulanmış deri elde edilmesine karşın, akupunktur iğne ile salınım, gen transkripsiyonu seviyesini (Şekil 3B) arttırdı. IL-15, üretimi 2. günde tespit edilen ve 7. günde (Şekil 3C) kadar sabit kalmıştır. Bu sonuçlar, acufection etkili bir plazmid DNA aşılar ve aşırı keratinosit aktivasyonunu neden olmadan deride kodlanan proteinin ifade olanak tanıdığı hususunu göstermektedir.

    WT farelerin bir plazmid kodlayan IL-15ΔE7 ile acufected edildi. Fare IL-15ΔE7 mRNA ve protein 3 kadar ekspresegün transfeksiyonu (Şekil 4A) sonra. Kontrol WT farelerinde IMQ tedavisinin neden olduğu gümüş pullar, IMQ kaynaklı gümüş pullar, IL-15ΔE7 azaltılmış WT fareler (Şekil 4B) acufected iken farenin sonra topikal 3. günde IMQ krem ile muamele edilmiştir. İlginç bir şekilde, acufected, IL-15ΔE7 ekspresyonu anlamlı unacufected WT deri (Şekil 4C), 12 ile karşılaştırıldığında IMQ ile muamele edilmiş deri içine Ly6G + nötrofil infiltrasyonunu da inhibe etti. acufection olarak, derideki IL-15ΔE7 yeni fonksiyon gösterdi. IL-15ΔE7 nötrofil infiltrasyonu IMQ indükleyici modüle eder.

    Şekil 1
    Şekil 1. Akupunktur iğneleri İllüstrasyon. (A), akupunktur iğne (36 g, 0.5" x) bir oluşmaktadırişlemek ve bir iğne ucu. (B) on akupunktur iğneleri yapışkan bantlar kullanılarak bir paket içerisinde bağlanır. Balya uzunluğu cetvel (alt panel) ile ölçüldüğü üzere yaklaşık 4 cm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    şekil 2
    Şekil 2. Akupunktur iğneleri tarafından iğneleyici hissedilir Cilt Hasar veya Keratinosit aktivasyonuna neden olmaması. (A), Paket siteleri akupunktur iğneleri 100 kez her delindi, fare tıraş edilir ve tüy dökücü krem uygulanmış yan cilt üzerinde gri kareler işaretlenir. Fotoğraf cilt hasarı izlemek için iğneleyici sonra 7 gün ilk saatte ve yukarı çekildi. Tıraş ve iğne ile delme olmadan tüy dökücü krem ​​uygulanmış deri kontrol olarak kullanılmıştır. <muamele edilmemiş ya da iğne ile delinir fare derisinden formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş deri kesitlerinin güçlü> (B), H & E ile analizi. Ölçek çizgisi: 100 um. (C), muamele edilmemiş ya da iğne ile delinir fare derisinden H & E ile boyanmış bölümlerin bir milimetre kademeli epidermal kalınlığı (en dış tabakaya bazal olan uzaklık) ölçmek için seçildi. Her bir çubuk 3 deri kesitlerinden ölçülen epidermal kalınlık ortalamasını temsil etmektedir. Buradaki hata çubuğu, ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder. Gruplar arasındaki farkın önemi Student t testi ile test edilmiştir. Aynı örneklerin (D) seri kesitler immünohistokimyasal analiz, anti-Ki67 ile boyanmıştır. Her bir çubuk 1 mm'lik bir segment başına uzunluğu her 150 mikron epidermisin lokalize Kİ67 + hücrelerinin ortalamasını temsil etmektedir. Buradaki hata çubuğu, ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder. grupları arasındaki farkın önemi, iki yönlü ANOVA foll ile test edilmiştirBonferroni post hoc testi borçluydu. (Ns: anlamlı değil). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    Şekil 3,
    Şekil 3. Acufection Etkili hissedilir Keratinosit Aktivasyon neden olmadan İlgi Proteini ifade eder. (A), (19 g), şırınga iğnesinin (Sır.) 1.067 mm çaplı aşındırma veya akupunktur iğnelerle 100 kez iğneleyici, traş ve tüy dökücü krem uygulanmış yan deri (NTC), tedavi edilmeden bırakıldı (Aku.). 2. günde ve 5. günde CXCL-1 ve IL-6 transkripsiyon seviyeleri ölçüldü QRT-PCR ile (n = 3). (B), traş ve IL-15 eksikliği olan fare tüy dökücü krem uygulanmış deri topikal, IL-15 eksprese eden bir plazmid DNA bir damla uygulandı without (depilasyon) veya akupunktur iğne ile delme (depilasyon + iğne) ile yıkanmıştır. 2. günde, her bir grup, IL-15, TaqMan transkripsiyonu QRT-PCR ile ölçülmüştür. IL-15'in transkripsiyonu, IL-15 eksikliği olan farelerin PBS kontrolüne (NTC) tespit edilememiştir. (C), muamele edilmemiş ya da IL-15 eksikliği olan fare derisinden, IL-15 üretimi (her gün için bir doku), IL-15 ELISA ile ölçülmüştür çeşitli gün IL-15-acufected. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

    Şekil 4,
    Şekil 4. IL-15ΔE7 Gösterilmesi IMQ kaynaklı Gümüşsü Kesintili Cilt hafiflettiğini ve nötrofil infiltrasyonu önler. (A) 'transkripsiyonel seviyede ve protein üretimi, IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6 E7) veya boş vektör kontrol (WT / pEmpty) deri sırasıyla qRT-PCR ve ELISA (n = 2, her bir zaman noktası) ile ölçüldü. (B), 3. günde boş vektör-ya da IL-15ΔE7-acufected yan cilt topikal IMQ kremi (60 mg) ile muamele edildi. IMQ tedaviden sonra 6. günde WT / pEmpty ve WT / pIL-15ΔE7 fare yan fotoğrafları. (C), gün 3 ve 6 numaralı IMQ tedaviden sonra ağ / pEmpty veya ağ / pIL-15ΔE7 faresinden alınan deri kesitleri, anti-Ly6G antikoru ile boyanmış ve numaralanmıştır. Her bir çubuk 4 IMQ ile tedavi edilen farelerden alınan Ly6G + hücrelerinin ortalamasını temsil eder. Buradaki hata çubuğu, ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder. Gruplar arasındaki farkın önemi ANOVA Bonferroni post hoc testi takiben iki yönlü test edildi. Paneller A ve C Investigative Dermatology, Lisans Numarası 3901890227597. Dergisi izniyle değiştirilir tıklayınBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    acufected plazmid DNA 'nın ekspresyonunu sağlamak için en önemli nokta, eşit salınım ve derinin boynuzsu tabaka gevşetilmesidir. Cildi kesilmeden hafifçe iğneler iterken, kuvvet yüzeyini bastırmak için yeterince sert olmalıdır. 1 cm x 1 cm yüzey alanı 10 uL çözelti içinde DNA emilmesini kolaylaştırmak için, iğneler 30 s, yaklaşık 100 kez yukarı ve aşağı salınım hareketi. Bir cilt prick gerekiyor kuvveti belirlemek ve acufected genin en iyi ifadesi seviyesini elde etmek için gerekli olan sayıyı işaret ederek yapabilirsiniz.

    Plazmid DNA miktarının değiştirilmesi, farklı genler için farklı olabilir, çünkü acufection gerekli olabilir sonra ifade tatmin edici bir seviyeye ulaşmak için uygulanan. Titrasyon deneyleri plazmid DNA optimum miktar ve ayrıca deneyden önce uygulanacak belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Kantitatif RT-PCR analizi sonuçları o belirlemek için yardımcı olacaktırPlazmid DNA ptimal miktarı ve yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için en uygun koşul.

    acufection işleminin kesin mekanizması henüz tam açıklanamamıştır. Topikal yoldan verilen plasmid DNA transkripsiyon transfeksiyon verimi (Şekil 3B) geliştirilmiş akupunktur iğneler tarafından iğneleyici, düşük bir seviyede tıraş edilir ve tüy dökücü krem uygulanmış deride meydana iken. Dövme gun 11 birden fazla delikler, acufection teslim plazmid DNA muhtemelen keratinosit ve saç köklerinin 19, 20 hücre zarı scrape ile kolaylaştırıldığı mikro-protokolünün Org. Epilasyon, tüylerini giderildikten reaktif ve iğne salınması ile epidermisin Uyarmalar bir ölçüde keratinosit aktivasyonunu uyarmak ve ayrıca Langerhans ve DCler, 6 DNA alımını geliştirebilir. Bu protokolün bir sınırlama plazmid DNA miktarı alınır olmasıdırhücreler tarafından doğru bir şekilde kontrol edilemez. Büyük bir cilt alanı tedavi etmek için bu yöntemi kullanarak önermiyoruz. deneyler arasında teslim edilen gen ekspresyon seviyelerindeki değişimleri en aza indirmek için, DNA çözeltisi hacmi ve hedef deri yüzeyinin boyutu aynı deneyler kümesi için sabit olmalıdır. tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, suret deneyler aynı kişi tarafından yapılması olduğunu tavsiye edilir.

    Gen tabancası cihaz ve mikro-tohumlama ile ilgili olarak, akupunktur iğneleri bir demet kullanımı çıplak DNA ucuz sunmak için. prosedürler de basittir. Bu acufection protokolü takip için çok az teknik deneyim gerektirir. Acufection hayvanlara minimal travma yaratır ve kilo kaybı işleminden sonra bulunmuştur. acufection işleminden sonra belirgin davranış değişikliği yokluğu ile değerlendirildiği gibi ağrı düzeyi düşüktür.

    Özetle, akupunktur iğneleri kullanılarak gevşetmeyekonakçı hücreler tarafından DNA alımı, derinin boynuzsu tabaka fare deri bir proteini ifade etmek üzere ekonomik bir alternatif bir yöntem sağlar. Bağışıklık ile ilgili genlerin bir geniş spektrumlu henüz işlevsel deriye 21'de karakterize edilecek, ve bu cilt üzerinde yeni bir genin bir hızlı çalışma için ihtiyacı ortaya koymaktadır. Bu yöntemi kullanarak, bir kişi, ilgi konusu gen ürünü, herhangi bir yeni fonksiyonu olup olmadığını belirleyebilir. Bu acufection protokol kutanöz hastalığı tedavi etmek immün yanıtın modülasyonunda yeni keşifler için uygun ve uygulanabilir bir araç sağlar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa etmek mali çıkarlarını hiçbir var.

    Acknowledgments

    Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan hibe ile desteklenen (EN 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Biz Dr teşekkür ederim. el yazması okumak için Betty Wu-Hsieh ve Hawaii Üniversitesi'nde Stanford Üniversitesi ve Dr Peter Hoffmann NTU'da Chien-Kuo Lee Leigh Zerboni, Tarım Biyoteknoloji teknik yardım için NTU'da Yun Chien ve Dr Wen-Chi Wei teknik tavsiye için Sinica Akademisi Araştırma Merkezi.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
    2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
    3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
    4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
    5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
    6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
    7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
    8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
    9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
    10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
    11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
    12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
    13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
    14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
    15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
    16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
    17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
    18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
    19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
    20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
    21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
    &quot;Acufection&quot; ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter