Summary
En optimeret protokol til in vitro modning af zebrafisk oocytter anvendes til manipulation af maternelle genprodukter præsenteres her.
Abstract
Cellulære begivenheder, der finder sted i de tidligste stadier af animalsk embryonale udvikling er drevet af maternelle genprodukter deponeret i udviklingslandene oocyt. Fordi disse begivenheder er afhængige af maternale produkter, som typisk virker meget snart efter befrugtningen-at preexist inde i ægget, standardmetoder til ekspression og funktionel reduktion involverer indsprøjtning af reagenser ind i befrugtede æg er typisk ineffektive. I stedet skal sådanne manipulationer udføres under oogenesen før eller under akkumuleringen af maternelle produkter. Denne artikel beskriver i detaljer en protokol til in vitro modning af umodne zebrafisk oocytter og deres efterfølgende in vitro-befrugtning, hvilket gav levedygtige embryoer, der overlever til voksenalderen. Denne fremgangsmåde tillader funktionelle manipulation af maternelle produkter under oogenese, såsom ekspressionen af produkter til fænotypisk redning og mærkede konstruktion visualisering, samt ens reduktion af genfunktion gennem omvendte-genetik midler.
Introduction
Under dyreudvikling, moderen indskud genprodukter (fx RNA'er, proteiner og andre biomolekyler) i ægget; disse produkter er vigtige for tidlige cellulære processer umiddelbart efter befrugtning 1, 2. Manipulation af ekspressionen og funktionen af maternelle produkter er typisk ineffektiv, når anvendelse af en standard fremgangsmåde til indsprøjtning af reagenser i befrugtede æg 3. Dette er fordi de fleste RNA'er og proteiner produceres af oocytten under oogenesen så pre-loaded moderen produkter er allerede til stede i det modne æg. Sådanne allerede eksisterende produkter er uigennemtrængelig for funktionelle knockdown med genmålretning midler, såsom Morpholino-antisense-oligoer (MOS), fordi MOS målrette mRNA'et, ikke det forud eksisterende protein allerede er til stede i ægget ved befrugtningen. Hertil kommer, at mange tidlige embryonale processer ske for hurtigt efter befrugtning skal influenced af proteinprodukter afledt fra RNA injiceres i befrugtede æg, som RNA'et ikke kan fremstilles hurtigt nok til at påvirke de første begivenheder af embryogenese. Af samme grund, mærkede proteinfusioner udtrykt gennem et mRNA injektion i det befrugtede æg kan ikke fremstilles i tide til visualisering under deres aktive rolle i det tidlige embryon. Injektion i ekstruderede modne oocytter før æg aktivering er mulig, men er forbundet med lignende tekniske spørgsmål: sådanne modne æg er allerede præinstalleret med maternel protein, og de vil ikke blive translationelt aktiv (dvs. producere protein fra eksogene udskrifter) indtil efter æg aktivering. Af disse grunde, manipulation af maternelle genprodukter handler i tidlig embryogenese skal typisk udføres under oogenese i modnende oocyt.
Som en metode til at overvinde disse forhindringer, i vitro-modning fremgangsmåder, der muliggør modning af OOCytes fra trin IV til dannelse æg, er blevet etableret i zebrafisk. Tidlige metoder tilladt i vitro-modning, men de resulterende modne æg var ikke kompetent til befrugtning 4. Efterfølgende manipulering af dyrkningsbetingelser fra neutral til pH 9,0, efterligner den alkaliske pH af æggestokkene væske findes i fiskearter 5, 6, fik lov til pålidelig in vitro fertilisering (IVF) efter in vitro-modning 7, 8. Faktisk kan in vitro -matured oocytter opnåelse levedygtige embryoer, der overlever til voksenalderen og som er frugtbar 3, 8. Denne forbedrede fremgangsmåde er blevet yderligere tilpasset til at omfatte den funktionelle manipulation af maternelle gener, ekspressionen af taggede proteiner under zebrafisk oogenese gennem exogen udtryk, og MO-medieret funktionel knock down i måttenuring stadie IV oocytter 3 (figur 1).
Zebrafisk oogenese udviser en række karakteristiske faser fører til dannelse af modne oocytter 9 (se tabel 1 for en hurtig guide til de forskellige stadier i oogenese). Kort fortalt er oocytudvikling initieret af Fase I oocytter og bliver arresteret på diplotene etape af profase I i meiosen. Disse oocytter undergår vækst gennem aktiv transkription (påbegyndt i trin IA og IB), dannelsen af corticale alveoler (også kendt som corticale granuler, indledt i trin II), og vitellogenesis (igangsat under trin III). Oocyt vækst er afsluttet i løbet af trin IV, når meiose jeg genoptager, hvilket resulterer i demonteringen af oocytten kerne, benævnt germinale vesikel (GV). Efterfølgende meiose anholdt igen på metafase II. Færdiggørelsen af oocyt vækst og meiotisk standsning under trin IV fører til en moden fase V f.eksg 9. Fjernelsen af den follikulære membran forekommer under frigivelsen af oocytten i lumen i æggestokken 10 og er afgørende for befrugtning og korrekt æg aktivering. Når æggene er ekstruderet fra moderen under naturlig parring, bliver de aktiveret. I zebrafisk, udsættelse for vand er tilstrækkelig til fuld æggeaktivering, uanset tilstedeværelsen af sædceller 11.
In vitro betingelser tillader i øjeblikket for modningen af oocytter fra tidligt stadium IV-, der kan genkendes ved deres størrelse (690-730 um), tilstedeværelsen af et stort GV i en asymmetrisk position, og et fuldt opakt udseende på grund af ophobning af æggeblomme proteiner (figur 2B) -til den modne stadie V æg, kendetegnet ved en fuldt adskilt GV og et gennemskinneligt udseende på grund af æggeblomme proteinbearbejdning 12 (figur 2C). I denne tilgang, hele æggestokke containing oocytter på forskellige udviklingsstadier fjernes fra hundyr. Oocytterne lov at udvikle i 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-on (DHP), en effektiv modning-inducerende hormon 8. I denne periode, kan modning oocytter manipuleres ved injektion af ekspression (fx capped in vitro -transcribed mRNA'er) eller revers-genetik midler (fx MOS). Den follikulære lag ikke spontant kaste mod slutningen af modningsperioden, så det skal fjernes manuelt. Efter defolliculation, er in vitro-befrugtning opnås ved at udløse æggeaktivering gennem eksponering af æggene til vand (til stede i embryonisk (E3) medium) 13 og en sædcelle opløsning. De resulterende zygoter gennemgå fosterudvikling og give mulighed for vurdering af evnen af behandlinger til at manipulere mødres gen funktion og til visualisering og analyse af mærkede maternelle produkter (
Protocol
Alle zebrafisk blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af de relevante nationale og / eller lokale dyrevelfærd organer, og alle dyr arbejde blev godkendt af den relevante udvalg (University of Wisconsin-Madison forsikring nummer A3368-01). Dyrene blev holdt under standardbetingelser ved 26,5 ° C.
1. Forhåndsudvælgelse af Females
BEMÆRK: Oocyter i voksne hunner typisk spænde over en række udviklingsstadier, fra trin I til V (figur 2). Rensning hunnerne af allerede eksisterende oocytter gennem en vellykket naturlig parring øger synkronisering af oocyt iscenesættelse, som nyligt udvikle oocytter fremstå som en kohorte 3, 14. Inden ca. 8 dage efter skylning fleste oocytter er i tidligt stadium IV, som er optimal for indledningen af in vitro modning. Sådan synkronisering forøger udbyttet af oocytter that kan gå gennem hele processen med in vitro-modning, hvilket letter eksperimentel manipulation. Se tidligere beskrivelser 13 for detaljer om opsætning af fisk i parrede parringer og på fisk vand sammensætning (her 14 g ocean salt og 150 g NaHCO3 pr 1000 I omvendt osmose vand, pH 6,5-8,5 (foretrukket område: 6,8 -7.5) og en ledningsevne på 180-360 uS). Se Brand et al. 13 for yderligere opskrifter.
- Otte til ti dage før in vitro-dyrkningen manipulation, brug en fiskenet at overføre en enkelt han og en enkelt hunfisk af den ønskede stamme til en parring tank. Par flere sæt. Lad dem i parring tanken natten over. Lad dem til at parre sig i løbet af aftenen og gennem eftermiddagen den følgende dag.
- Brug en fisk netto at adskille hunnerne, der giver æg under parring og placere dem i en separat tank. Fodre disse hunner to gange dagligt med en blanding fødevarer containing omtrent samme mængde saltlage rejer og fisk fødevarer flager. Mængden af fødevarer bør være nok til at give ca. 20 min, men ikke mere, af fodring tid.
2. Fremstilling af Modning Medium
BEMÆRK: Forbered modningsmedie på dagen for in vitro modning eksperiment, inden for 1 time til fjernelse oocytterne fra hun (se afsnit 3).
- Der tilsættes 20 ml Leibovitz L-15-medium med L-glutamin, pH 7,0, til en 50 ml konisk rør under sterile betingelser. Bringe det til pH 9,0 med 10 N NaOH.
- Tilføje 9 ml Leibovitz L-15-medium, pH 9,0, til 2 separate 50 ml koniske rør. Label 1 rør "+ DHP" og den anden "-DHP."
- I + DHP rør tilsættes 10 pi 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-on (DHP), 490 pi dH2O, og 500 pi 10% bovint serumalbumin (BSA).
- I -DHP rør, tilsættes 100 pi 10 mg / ml gentamycin, 40081; L dH2O, og 500 pi af 10% BSA.
3. Dissektion af oocyter og Indledning af in vitro-dyrkning
BEMÆRK: in vitro-kultur eksperiment udføres med forudvalgte hunner 8-10 dage, efter at de frigiver æg gennem naturlig parring. Brug modning medium foretaget den samme dag (se afsnit 2). Oocyter modne hensigtsmæssigt hvis dissektion begyndes nær slutningen af fisken døgnets cyklus (bestemt i laboratoriet ved forudindstillede kunstig belysning i fisk faciliteten) 13, eventuelt efterligne processer, der forekommer ved naturlig parring. Dette indebærer, at de fleste trin i protokollen skal udføres om aftenen, hvis fiskene er opstaldet i et anlæg med en standard lys cyklus (f.eks, begyndende trin 3.2 kl 6 i et anlæg med en 8:00 til 22:00 lys periode), selv om andre arbejdsområder tidsperioder er mulige med en hensigtsmæssigt tidsforskudt lyscyklus.
- Forberede en 0,2% tricain stamopløsning i dH2O, pufret til pH 7,0 med 1 M Tris, pH 9,0, og holde denne opløsning ved 4 ° C. Dette kan fremstilles i forvejen.
- Indlede eksperimentet 0-4 timer før afslutningen af den daglige lyscyklus i anlægget. I et 250 ml bæger tilsættes 20 ml 0,2% tricain stamopløsning, pH 7,0, til 80 ml fisk vand og blandes.
- Overfør de foreløbigt udvalgte hunner til tricaine løsning og aflive dem ved overeksponering. Efterlad hunnerne i tricaine opløsningen i 15 minutter efter ophør af Gill bevægelse.
- Ved hjælp af en ske, indsamle de aflives fisk fra tricaine løsning og skyl dem kort i fisk vand. Læg fisken på et stykke køkkenrulle til at absorbere overskydende vand.
- Brug en ren barberblad at halshugge den aflivet fisk på niveau med brystfinnen. Anvendelse dissektionssakse, lave en langsgående incision på den ventrale side af fisken, der strækker sig fra den forreste ende til den anale område.
- Ved hjælp af dissekere pincet, forsigtigt adskille oocytterne fra follikulært masserne. Sortere de tidligt stadium IV oocytter (figur 2B; før GV nedbrydning, ved næsten maksimal størrelse og kendetegnet ved en mørk, opak cytoplasma og en indlysende GV placeret asymmetrisk i oocytten). Kassere oocytter på tidligere stadier (figur 2A) og gennemskinnelige, modne stadie V æg (ligner dem i figur 2C, men til stede i æggestokkene før DHP behandling).
BEMÆRK: Oocytter udvælges til modning i tidlig fase IV, den tidligste fase, der resulterer i moden, scene V oocytes efter in vitro dyrkningsbetingelser (figur 2C og D) 3. Fordi stadium IV oocyter aktivt producerer produkter, manipulation på dette trin giver mulighed for ekspression af exogene produkter gennem RNA injektion eller til reduktion af genfunktion via indførte MOS. - Brug en Pasteur-glaspipette til at overføre de tidlige trin IV-oocytter til en anden 35 x 10 mm plast dyrkningsskål indeholdende 4 ml Leibovitz L-15 medium + DHP. Overfør minimale mængder af -DHP medium til fadet, der indeholder + DHP løsning.
4. oocyt Mikroinjektioner
BEMÆRK: Isoleret stadie IV oocytter undergår in vitro modning kan mikroinjiceres at indføre reagenser til funktionel manipulation eller mærket protein ekspression. Mikroinjektionen af reagenser, såsom mRNA og MOS (se afsnit 4), udføres typisk når oocytterne undergår in vitro maturation i + DHP-medium, før defolliculation. Om ønsket, for at give mere tid til at udføre manipulationer forud for oocytmodning, injektionerne kan også udføres i -DHP medium, før modning, i mindst 2 timer. De kan efterfølgende overføres til + DHP-medium.
- Forberede mRNA'er under anvendelse af en standard ekspressionskittet. Holde dem ved -80 ° C som en 100-500 pg / pl lager til injektion i en slutkoncentration på 50-500 pg / pl (200 pg / pl anbefales) i RNA-grade vand. Forberede MOS ved en koncentration på 4 ng / pl i vand ifølge producentens instruktioner. Injicere dem ved slutkoncentrationer på 2 ng / pi (eller som bestemmes empirisk).
BEMÆRK: Injektioner udføres typisk i + DHP medium før defolliculation (se noten i afsnit 5). - Hvis injicere mRNA, umiddelbart før injektionen fortyndes mRNA under anvendelse af RNA-grade omvendt osmose vand og 0,2 M KCI for at opnå en endelig opløsning på 0,1 M KCI.
- Hvis injicere Mos, umiddelbart før injektionen, fortyndes MOS til den ønskede koncentration ved anvendelse af omvendt-osmose vand og 0,2 M KCI for at opnå en endelig opløsning på 0,1 M KCI.
- Manuelt holde oocytter med fin pincet og injicere ca. 1 nL i vildtype-stadium IV oocytter anvendelse af en nål fremstillet med en løftes-glaskapillar pipette.
- Forbered glasnåle ved at trække opvarmet glaskapillarrør, indlæsning af opløsningen, der skal injiceres, og bryde nålespidsen med pincet, som tidligere beskrevet i protokoller til standard injektion i zebrafisk tidlige embryoner 15.
BEMÆRK: Det er nyttigt, hvis nålen har en gradvis tilspidsning i stedet for en brat on; dette tillader større fleksibilitet med hensyn til placeringen af bruddet i nålespidsen og hjælper også til at forhindre beskadigelse af injicerede embryon. Under anvendelse af samme nål og opløsning for embryoet injektioner, justere injicerede volumen ved på forhånd bestemmemikroinjektor trykindstillinger der producerer det ønskede volumen. Disse indstillinger kan bestemmes ved mock-injektion i en dråbe mineralolie på et mikroskopobjektbord kalibrering glider (0,01 mm) og justere indstillingerne mikroinjektor at opnå den ønskede diameter i bolusen af injiceret opløsning, som tidligere beskrevet 15.
- Forbered glasnåle ved at trække opvarmet glaskapillarrør, indlæsning af opløsningen, der skal injiceres, og bryde nålespidsen med pincet, som tidligere beskrevet i protokoller til standard injektion i zebrafisk tidlige embryoner 15.
5. oocytmodning og Defolliculation
BEMÆRK: Under oocyt modning, vil oocytterne blive gradvist gennemskinnelige, som giver mulighed for at vurdere vellykkede dyrkningsbetingelser.
- Fortsæt inkubation af umodne (og om nødvendigt, injiceret) oocytter in + DHP-medium ved 26,5 ° C og regelmæssigt se (hver 30 min) for at sikre, at oocytterne forblive intakt og undergår korrekt modning ved at blive progressivt gennemskinnelig (se figur 2C) .
- Fjern eventuelle lyserende oocytter med en Pasteur-pipette og kassere demi et laboratorium affald bæger til at opretholde kvaliteten af mediet. Udveksle dyrkningsmediet med omtrent en halv volumen frisk + DHP mediet for at opretholde en klar opløsning, afhængigt af mængden af oocyt lysis.
- Tillade in vitro modning at forløbe, indtil et flertal af oocytterne bliver gennemskinnelig og har en GV, der ikke længere synlige (ca. 2 timer i DHP behandling, se Figur 2C sammenlignet med D). Se dem under et dissektionsmikroskop med transmitteret lys optik.
- Fjern den yderste follikulære membran fra hver moden oocyt. Brug ekstra fine pincet til at gøre en tåre i follikulært membran i en region med øget mellemrum mellem oocyt og membranen. Skrælle en del af membranen og rul oocyt ud af membranen, mens du holder skrællede del.
BEMÆRK: underliggende chorionmembranen vil typisk forblive i tæt samarbejde med ægget under denne proces; efter æg handleivation, udvider at danne et beskyttende lag for embryoet. - Overfør defollikuleret oocytter i et minimalt volumen medium (typisk overføre omkring 5-10 modne oocytter i mindre end 20 uL) til en petriskål med et par dråber kultur (+ DHP) medium og fortsæt til befrugtning.
6. Gødskning i In Vitro Dyrkede Oocyter
BEMÆRK: sperm opløsning på is, fremstillet nedenfor, vil opretholde sin styrke i ca. 2 timer.
- Forberede en sædcelle opløsning nær slutningen af oocytmodning trin og før defolliculation anvender testikler fra fem mænd i 500 pi Hanks opløsning, som tidligere 16, 17 beskrevet.
- Tilføj 10-50 uL af sperm løsning på defollikuleret oocytter i + DHP dyrkningsmedium. Vent 10 s.
- Ved hjælp af en pipette, tilsæt et par dråber embryonale (E3) medium til oocytterne. Vent 1 min og derefter oversvømme plspiste med E3 medium.
BEMÆRK: Sammensætningen af E3-medium er som følger: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, og 1-5% methylenblåt 13. - Gentag trin 5.3, 6.2, og 6.3 for at opnå et større antal befrugtede embryoer.
- Lad de befrugtede embryoner at udvikle sig. Bruge et dissektionsmikroskop med transmitterede lys optik at observere progression gennem stadierne spaltnings at sikre en vellykket befrugtning, som tidligere beskrevet for befrugtning 17 og mellemstationer 18.
Representative Results
At bestemme, om den ovenfor beskrevne procedure er vellykket, kan fostrene skal observeres under stadierne spaltningssteder for at bekræfte forekomsten af den stereotype tidlige embryonale spaltningsmønster 18 samt 24 timer efter befrugtningen (HPF) for at bekræfte den korrekte udvikling af grundlegemet plan. Denne procedure giver mulighed for manipulation af maternelle produkter til funktionelle undersøgelser ved injektion af reagenser, såsom mRNA'er og Mos, under oocytudvikling.
Manipulation af maternelle produkter til funktionelle studier:
mRNA, der koder for vildtype og muterede produkter kan injiceres i in vitro modning oocytter at teste virkningen af manipulation af maternel genfunktion under meiose og de tidlige embryonale stadier. For eksempel kan vildtype embryoer injiceres med wild-typen mRNA for at teste for virkningen af produktet overekspression, eller med mutant-RNA til at teste for potentielle dominante (fx få af funktion og antimorphic) virkninger i disse processer. Oocytter in in vitro-kultur er i stand til at producere protein fra exogent mRNA hele oocytudvikling, som vist ved ekspressionen af GFP fra injiceret mRNA, selv om kun oocytter som initierer dyrkningsbetingelser på stadium IV oogenese kan udvikles til modne stadie V oocytter (figur 2B -2D, se også Nair et al. 3). Ekspressionen af vildtype-produkt gennem injiceret mRNA er også medvirkende til redning af maternel-effekt-mutationer for at bekræfte gen identitet inden positionel kloning 3, 24. I dette tilfælde er vildtype mRNA injiceres i oocyter fra homozygote mutante hunner at teste, om vildtype-produkter kan redde mutantfænotypen. Denne genetiske redning er illustreret i <strong> Figur 3A-3C, hvor injiceret Aurb mRNA er vist at redde de fænotypiske virkninger af en mutation i dets tilsvarende gen, cellulær ø (CEI) (figur 3A-3C). Embryonerne fra en kontrolgruppe er også tilladt at udvikle at vise den tilsvarende mutant fænotype 3. Mutant RNA kan også injiceres i mutante oocytter at teste, om den muterede produkt bibeholder partiel funktion ved sammenligning af omfanget af redning til den fremkaldt af vildtype-produkt.
Proteinekspression fra mRNA indsprøjtes i udviklingslandene oocytter synes at forekomme med ringe eller ingen forsinkelse. Strong GFP-ekspression observeres inden 2 timer af injektionen af den tilsvarende mRNA, uanset udviklingsstadium oocytten 3 (figur 2B-2D, se også Nair et al. 3). Produkter såsom mCherry:Sas6 og Birc5b (Motley): GFP kan observeres umiddelbart efter befrugtningen, og i første embryonisk celle cyklus 3, 25. Injektionen af mRNA under oogenese fører også til fremstilling af protein, at uanset den kondenserede mærkede del, er funktionel umiddelbart efter befrugtningen, som vist i tilfældet med maternelle produkter til cellulær ø / Aurb 3, forgæves cyklus / lrmp 24, og brogede / bir5b 25. Oversættelse-blokerende MOS har også en effekt umiddelbart efter befrugtningen, som vist for forgæves cyklus / Lrmp 3 og på senere stadier af embryogenese, som i tilfældet med mission impossible / dhx16 3. Splejsning-blokerende Mos, når det injiceres i modnende oocytter, kan ikke have en effekt på moderens funktion, sandsynligvis på grund af allerede tilstedeværende modne maternale transkripter i trin IV-oocytter <sup class = "xref"> 3.
Generation af morphants:
Ved brug af en MO svarende til et gen med en allerede identificerede mutation, forventes morphant fænotype at efterligne den mutante fænotype. Morphants sammenlignes med ikke-injicerede embryoner og til dem injiceret med en standard, kontrollerer MO. Indsprøjtningen af en translation-blokerende morpholino kan med held phenocopy den kendte mutantfænotypen 3 som vist ved injektion af Lrmp MO i oocytter, der efterligner mutantfænotype den tilsvarende mutation, forgæves cyklus (figur 3D-F). Specificiteten af MOS kan bestemmes ved de samme fremgangsmåder, der anvendes ved injektion MOS i embryoner (revideret tidligere) 19, 20.
Ekspression af fluorescensmærkede fusionsproteiner:
mRNA, der koder for genprodukter af interesse fusioneret til fluorescerende proteiner (fx GFP og mCherry) kan også injiceres i enten vildtype eller mutante oocytter at visualisere de tilsvarende produkter i det tidlige embryon (dvs. afspejler en subcellulære lokalisering mønster, Figur 3G og 3H). mRNA'er, der koder for lignende fusioner men involverer mutante allel kan også afgivet at teste, om mutationen påvirker eventuelle potentielle subcellulære lokaliseringer.
Figur 1: In vitro oocytmodning. Skematisk diagram, der viser forskellige trin i in vitro-oocytmodning. Voksne hunner er valgt på forhånd til æglægning 8 dage forud for proceduren, at rense dem af æg, der allerede modnet og til promote ny oocyt udvikling. Æggestokkene, indeholdende udviklingslande oocytter, fjernes fra hundyr og overført til et medium indeholdende hormonet DHP at inducere oocytmodning in vitro. Efter fjernelse fra hunner og umiddelbart før eller under oocytmodning, kan oocyter injiceres med RNA-produkter og andre reagenser til den funktionelle manipulation af maternelle faktorer. Modne oocyter manuelt defollikuleret og befrugtet in vitro med en sædcelle opløsning til opnåelse befrugtede og levedygtige embryoer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: In vitro oocytmodning og ekspression af produkter fra indsprøjtet mRNA. (A) Oocytter på stadium I-III, observeret i ovarier frafemales 4 dage efter rensning (dpp). (B) Oocytter på stadium IV, observeret i ovarier fra hundyr 8 DPP. Den germinale vesikel (GV, pilespids) er klart synlig og indtager en excentrisk position. Trin III oocytter i (A) udviser også en indlysende GV, men det er fundet centreret i oocytten. Trin IV-oocytter i (B) har en størrelse, der er næsten maksimal sammenlignet med modne oocytter i (C). (C og D) Oocytter på stadium V (moden oocyter) efter 2 timer i in vitro-modning betingelser initieret ved trin IV, som i (B), og injiceret under modning med GFP-kodende, in vitro-transkriberet mRNA (C, synligt lys kun D, overlejring af synligt lys og GFP-fluorescens). GV er ikke længere synlige i fase V oocytter, som også mindre gennemsigtige end stadie IV oocytter. Injicerede oocyter udtrykker GFP-protein (D). Defolliculation af modne stadie IV oocyter er described i protokollen sektion. Skala bar = 300 um. Alle paneler blev gengivet, med tilladelse fra Nair et al 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Manipulation og Visualisering af Maternal produkter gennem In Vitro oocytmodning. (A - C) Redning af moderens-effekten fænotype skyldes en mutation i cellulær ø / aurora B ved injektion af vildtype Aurb mRNA til trin IV CEI / Aurb oocytter. Flettede billeder, der viser animalske visninger af 65 MPF faste blastodiscs, visualiseret med anti-ß-catenin antistoffer til at fremhæve membraner (grøn), anti-a-tubulin-antistoffer for at indikere mikrotubuli (rød), og DAPI at udpege DNA (blå). (A) β-catenin akkumulering i vildtype-embryoer, der indikerer normal fure modning. (B) En cei / Aurb embryon fra et ikke-injicerede cei / Aurb stadie IV oocyt viser delvise, rudimentære furer, der ikke akkumulerer β-catenin. (C) A reddet cei / Aurb embryo fra en CEI / Aurb oocyt injiceret med vildtype-Aurb mRNA viser robust β-catenin akkumulering ved furerne. (D - F) Phenocopy af moderens-virkning forårsaget af en mutation i forgæves cyklus / lrmp fra injektionen af Lrmp morpholino i trin IV-oocytter. Flettede billeder, der viser animalske visninger af 70 MPF faste blastodiscs, visualiseret med anti-y-tubulin antistoffer for at indikere centrosomer (rød) og DAPI at udpege DNA (blå). (D) I vildtype-embryoer, hver nucleus associerer med γ-tubulin, en markør for centrosomal materiale. (E) Ved maternel-effekt FUE mutanter, pronukleær fusion svigter, hvilket resulterer i to til tre pletter af DNA etiketter svarende til ikke-fusionerede parentale pro-kerner og det polære legeme for meiose II. (F) I Lrmp morphants, hvor moderens Lrmp funktion inhiberes, kernerne tilsvarende undlader at dele sig og desuden ikke associerer med γ-tubulin. (G og H) Visualisering af maternelt produceret produkt i det tidlige embryon. Sass6-mCherry protein fra exogent mRNA injiceres i fase IV oocyter lokaliseres til centriolerne. Flettede billeder, der viser animalske visninger af 40 MPF faste blastodiscs, visualiseret med anti-y-tubulin antistoffer til at fremhæve centrosomer (grøn), mCherry fluorescens at indikere Sass6 (rød), og DAPI at udpege DNA (blå). (G) Udtrykt Sass6-mCherry proteinet lokaliseres til foci mærket ved centrosomreplikation markør γ-tubulin i sites, der flankerer kerne (pile). (H et al 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stadier af oogenesen | Oocyt diameter (um) | Tast vartegn (r) |
| 1A - Prefollicle | 7 til 20 | Initiering af aktiv transkription, akkumulering af nukleoler |
| 1B - Follikelstimulerende | 20-140 | Dekondensering af kromosomer |
| II - Kortikal bicelle | 140-340 | Kortikal alveoler produktion |
| III - Vitellogenesis | 340-690 | Mørkfarvning af ooplasma ved akkumulering af æggeblomme precursor protein og lipider |
| Tidlig IV - oocytmodning | 690-730 (nedre område) | Asymmetrisk lokalisering af kimblære |
| Tidlig IV - oocytmodning | 690-730 (øvre område) | Germinal vesikel forsvinder, anholdelse på metafase II |
| V - Mature oocyt | ~ 750 | Ooplasma / æggeblomme bliver gennemskinnelig |
Tabel 1: Landemærker af oocytudvikling i Zebrafisk.
Discussion
Ovenstående protokol er til manipulation af genprodukter før befrugtning, således tillader studiet af maternelle genprodukter i det tidlige zebrafisk embryo. Tidligere undersøgelser har været i stand til at modne oocytter in vitro 4; denne protokol blev modificeret for at muliggøre efterfølgende befrugtning af in vitro-modnede oocytter 8. Dette tillader igen til indsprøjtning af reagenser til funktionel manipulation og visualisering af maternelt nedarvede produkter i det tidlige embryon 3. Embryoner som følge af denne metode kan være levedygtige og kan overleve at blive frugtbare voksne. I indledende eksperimenter, ca. halvdelen af de befrugtede embryoner fra denne procedure var levedygtige på dag 5 for udvikling, som vurderet ved svømmeblære inflation på dette stadium, hvoraf halvdelen blev raske, frugtbare voksne (ikke offentliggjorte observationer).
Der er en rækkeaf kritiske skridt til at overveje i protokollen. Oocytter på det passende tidspunkt at initiere modning (tidligt stadium IV) kan beriges hvis hunnen er blevet parret nylig, men ikke før 8 dpp. Ved hjælp af fisk, der ikke har parret for nylig kunne resultere i degenererende æg 14, som ikke vil undergå modning. Hunner parret inden for mindre end 8 dage vil have et flertal af æg på stadium III eller mindre, og således vil æggene ikke modne ordentligt in vitro. Æggestokkene hos kvinder, der har parret 8 dage før vil have en optimal del af oocytter i tidligt stadium IV. Disse kan genkendes ved deres opacitet og tilstedeværelsen af GV i en excentrisk position (figur 2B). Oocyt stadium bestemmelse kan også hjælpes ved størrelse måling med oocytterne anbragt på en gradueret mikrometer dias under et mikroskop og i forhold til standard mellemstationer retningslinjer (tabel 1). tidligt stadie IV oocytter har dog næsten maksimal størrelse sammenlignet med modneoocytter (anerkendt af deres relative gennemsigtighed og mangel på en GV, figur 2C) og genkendes let, som beskrevet ovenfor, hvilket generelt undgår behovet for en direkte måling oocyt størrelse.
In vitro modning skal påbegyndes inden for flere timer efter afslutningen af dagslyset cyklus, som de kvindelige oocyt donorer akklimatiseret. Oocytter vil ikke modne ordentligt, hvilket afspejles i dårlige befrugtning satser, hvis dyrkes i løbet af formiddagen periode af lyset cyklus. Årsagen til den cirkadiske afhængighed af in vitro oocytmodning metode er ikke forstået, men afspejler sandsynligvis underliggende cirkadiske skævheder i in vivo ægmodningen involverer cykling genekspression under oogenese 21. En almindelig årsag til oocytter undlader at gennemgå en succes in vitro modning på trods af korrekt oocyt iscenesættelse er, at DHP er udløbet. DHP hormon generelt udløber efter et år, og for at sikre effektive modning, skal arbejdsmiljøet parti udskiftes inden for 9 måneders brug.
Injektion af oocytter er endnu et vigtigt skridt, når formålet med fremgangsmåden er den funktionelle manipulation af maternelle produkter. Denne fremgangsmåde har krav, der adskiller sig fra dem for standard injektioner i det befrugtede æg ved 0-30 mpf. En nøglefaktor i oocyt injektion er behovet for at foretage injektionerne under betingelser, der ikke fører til for tidlig aktivering æg, såsom i Leibovitz L-15-medium 22, 23. Fordi de er indlejret i æggestokke, med udløb oocytter udgør også særlige krav til injektion. Protokollen ovenfor foreslår først at dissociere oocytter fra æggestokkene og derefter holde hver dissocieret oocyt separat med pincet under injektionen. Denne teknik har fungeret godt, og gør det muligt for forsortering oocytter på et passende tidspunkt med minimal håndtering. kan også anvendes alternative metoder, såsomsom: i) anbringelse oocytter i standard injektion agarose render 15, hvor de lodrette vægge af truget støtte oocytten under injektion (i denne alternative fremgangsmåde, behøver oocytterne overføres til injektion plader, mens der holdes in vitro modning medium), og ii ) at give de oocytter at forblive fastgjort til æggestokkene masse, som kan holdes med pincet under injektionen for at undgå kontakt med den injicerede oocyt (i denne fremgangsmåde, bør oocytterne dissocieres efter injektion til både lette DHP eksponering og at tillade deres defolliculation , selv afgørende for IVF). På trods af dette specifikke udfordring, kan trin IV-oocytter let gennemtrænges med en injektionsnål, sandsynligvis fordi chorionmembranen på nuværende tidspunkt ikke er fuldt udviklet 9.
En begrænsning ved det nuværende modning protokol er, at i vitro-modning betingelser, der fremmer ordentlig oocytudviklingkan ikke oprettes når oocytmodning initieres ved trin tidligere end trin IV. Oocyter blive kompetente til at reagere på DHP ved at undergå modning, når de når en diameter på 520 um, der forekommer under trin III (vitellogenesis, svarende til 340-til-690-um) 9. Men kulturen i fase III-oocytter resulterer i oocytter, der ikke er kompetent til befrugtning 3. Kun oocytter hvis in vitro-dyrkning initieres ved trin IV (figur 2B) kan udvikles til modne, trin V oocytter (figur 2C og D). Dette kan være relateret til det faktum, at trin III er afgørende for vitellogenesis og oocyt vækst 9. Således bør in vitro oocytmodning procedure præsenteres i denne artikel kun anvendes med et udgangsmateriale population af trin IV-oocytter (B), og ikke med oocytter på tidligere stadier (stadium I - III; Figur e
En anden begrænsning i den foreliggende fremgangsmåde er, at defolliculation, som er afgørende for de efterfølgende trin, der involverer befrugtning, er i øjeblikket et hastighedsbegrænsende trin i proceduren. Den follikulære membran er en transparent lag, der omgiver den udviklende oocyt, og fjernelse kan være trættende. Hvis denne membran ikke er helt fjernet, vil ægget ikke blive fuldt aktiveret og befrugtede. Dette er gjort tydeligt ved svigt af chorion at udvide og udviklingen af uregelmæssigt placeret, fure-lignende structures (pseudocleavages), karakteristiske for ubefrugtede embryoner 11. Enzymatiske defolliculation metoder såsom kollagenase, som anvendes i Xenopus, har været forsøgt. Men i vore hænder, denne teknik har ikke været en succes, og derfor vi stole på manuel defolliculation. Fordi manuel defolliculation er arbejdskrævende og tidskrævende, er det vanskeligt at opnå store partier af befrugtede æg efter in vitro-oocytmodning. På grund af den tidsmæssige begrænsning ved manuel defolliculation, vi i øjeblikket befrugte et par defollikuleret, modne æg ad gangen, i små partier af 5-10 æg. Inkorporeringen af enzymatisk defolliculation med denne procedure vil sandsynligvis øge dets udbytte og generelle brugervenlighed.
Selvom embryoner efter befrugtning af in vitro -matured oocytter kan blive levedygtige voksne bemærker vi, at efter in vitro-befrugtning, en fraktion af embryoner gøre ikke opdele normalt eller i tide. Vi i øjeblikket selektion for linier, hvis formering omfatter runder af in vitro-oocytmodning, hvilket kan resultere i mere robuste udviklingsmønstre i embryoner gennem denne metode.
Proceduren har muliggjort den klare redning eller visualisering af protein lokalisering for en række mutationer 24, 25. Men for nogle gener, kan reguleringen af produktekspression være afgørende, så produkterne udtrykt af injiceret mRNA kan føre til variable resultater 26. Det er også vigtigt at være opmærksom på alle de kontroller (fx embryoner injiceret med reagenser, som har tilsvarende egenskaber som dem, der anvendes i forsøget endnu forudsiges at ikke frembringe en virkning, såsom kontrol MOS eller RNA'er kun koder for inerte proteiner, såsom som GFP), som underliggende variabilitet kan føre til forkerte konklusioner.
nt "> en metode, hvor in vitro-manipulation efterfulgt af befrugtning er særlig nyttig i tilfælde af maternelt aflejrede produkter, hvor standardmetoden ifølge injicere RNA, MOS, eller protein i det befrugtede æg kan ikke effektivt at reducere produkter, der allerede er akkumuleret i ægget. andre nyligt udviklede metoder, såsom CRISPR-mutant generation, er også effektiv til at generere mutant betingelser for maternelt udtrykte gener 26. Men denne fremgangsmåde kræver vækst af flere generationer af fisk. In vitro oocytmodning teknik tillader hurtig funktionel manipulation for at undersøge funktionen af maternelt udtrykte gener, herunder redning og phenocopy af maternel-effekt mutationer, såvel som ekspressionen af RNA og proteiner i det tidlige embryon.Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Pelegri lab og fisk facilitet ledende medarbejdere, der var medvirkende til at lette dette projekt. Støtte til dette projekt blev leveret af NIH R56 GM065303 og NIH 2 T32 GM007133 til ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 og NIH 2 T32 GM007133 til CCE, og NIH RO1 GM065303 til FP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO2-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO2 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 mL | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 mL (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15 mL | any maker | ||
| Conical tubes 50 mL | any maker | ||
| plastic pipette 10 mL with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 mL with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
References
- Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).
- Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it's in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).
- Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).
- Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement. Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).
- Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho. Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).
- Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker. Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development. Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B.
- Kanagaraj, P., et al. Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis. PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Pelegri, F., Mullins, M. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. J Vis Exp. , (2016).
- Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).
- Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).
- Pelegri, F., Mullins, M. C. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 135, (2016).
- Lindeman, R. E., Pelegri, F. Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote. Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).
- Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo. PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
