Summary
En optimalisert protokoll for in vitro modning av oocytter sebrafisk som benyttes for manipulering av matern genprodukter er presentert her.
Abstract
Cellulære hendelser som finner sted i løpet av de tidligste stadiene av animalsk embryoutvikling drives av maternale genprodukter deponert i den utviklende oocytten. Fordi disse bivirkningene er avhengige av maternale produkter som vanligvis opptrer meget snart etter befruktning-at preexist inne i egget, vanlige metoder for ekspresjon og funksjonell reduksjon involverer injeksjon av reagenser i det befruktede egg er vanligvis ineffektive. I stedet må slike manipulasjoner utføres under oogenesen, før eller under akkumulering av mors produkter. Denne artikkelen beskriver i detalj en protokoll for in vitro modning av umodne sebrafisk oocytter og deres etterfølgende in vitro fertilisering, og man oppnådde levedyktige embryoer som overlever til voksen alder. Denne metoden gir den funksjonelle manipulering av maternelle produkter under oogenesen, slik som uttrykket av produkter for fenotypisk redning og merket konstruksjon visualisering, samt ens reduksjon av genfunksjon ved reverse-genetikk midler.
Introduction
Under dyr utvikling, moder innskudd genprodukter (f.eks RNA'er, proteiner og andre biomolekyler) inn i egg; Disse produktene er viktig for tidlig cellulære prosesser umiddelbart etter befruktning 1, 2. Manipuleringen av ekspresjon og funksjon av maternelle produkter er vanligvis ineffektive når de ved hjelp av en standard metode for injeksjon av reagenser i befruktede egg 3. Dette er fordi de fleste RNA og proteiner blir produsert ved en oocytt under oogenesen, så forhåndslastede maternale produkter er allerede tilstede i den modne egg. Slike forhåndseksisterende produkter er ugjennomtrengelig for funksjonell knockdown med gen-målsøking midler, slik som morfolino antisens oligonukleotidene (MOS), fordi MOS målrette mRNA, ikke den på forhånd eksisterende protein allerede var tilstede i egg ved befruktning. I tillegg har mange tidlige embryonale prosesser skje for tidlig etter befruktning skal influensert ved protein produkter avledet fra RNA injiseres i det befruktede egget, som RNA ikke kan fremstilles hurtig nok til å påvirke de første hendelsene i embryogenesen. Av samme grunn, merket proteinfusjoner uttrykkes gjennom et mRNA-injeksjon i befruktede egg kan ikke fremstilles i tid for visualisering under deres aktiv rolle i den tidlige embryoet. Injeksjon i ekstruderte modne oocytter før egg-aktivering er mulig, men er forbundet med lignende tekniske problemer: slike modne egg allerede er forhåndslastet med mors-protein, og de vil ikke bli translatorisk aktiv (dvs. å produsere proteiner fra eksogene transkripter) før etter egg aktivering. Av disse grunner manipulering av matern genprodukter som opptrer tidlig i embryogenese må vanligvis utføres i løpet av oogenesen i modningen oocytt.
Som en tilnærming for å overkomme disse hindringene, in vitro modning metoder, som gir mulighet for modning av oocytes fra trinn IV til egg dannelse, er blitt etablert i sebrafisk. Tidlige metoder tillatt in vitro modning, men de resulterende modne egg ikke var kompetent for befruktning 4. Deretter manipulering av dyrkningsforhold fra nøytral til pH 9,0, etterligne den alkaliske pH-verdien i eggstokk væsken som finnes i fiskeslag 5, 6, tillatt for pålitelig in vitro fertilisering (IVF) etter in vitro-modning 7, 8. Faktisk kan in vitro -matured oocytter gi levedyktige embryoer som overlever til voksen alder og som er fruktbar 3, 8. Denne fremgangsmåte er ytterligere tilpasset til å inkludere funksjonelle manipulering av maternelle gener, ekspresjonen av merkede proteiner under zebrafisk oogenesen gjennom eksogene uttrykk, og MO-medierte funksjonelle slå ned i mattenuring stadium IV oocytter 3 (figur 1).
Sebrafisk oogenesen oppviser et antall karakteristiske trinn som fører til dannelse av modne oocytter 9 (se tabell 1 for en rask til de forskjellige trinn i oogenesen). Kort fortalt er eggcelle utvikling initiert av stadium I oocytter og arrestert på diplotene stadium av profase jeg av meiose. Disse oocytter gjennomgå vekst gjennom aktiv transkripsjon (initiert under trinn IA og IB), dannelse av kortikale alveoler (også kjent som cortical granuler, som ble initiert i trinn II), og vitellogenesis (initiert under trinn III). Oocytt vekst blir fullført under stadium IV, når meiose I fortsetter, noe som resulterer i den demontering av oocytten kjernen, referert til som germinal vesikkel (GV). Deretter meiose arrestert igjen ved metafase II. Fullføringen av egg vekst og meiotisk arrest i trinn IV fører til en moden fase V f.eksg 9. Fjerningen av den follikulære membranen oppstår under frigjøring av eggcelle i lumen av eggstokken 10 og er essensiell for befruktning og riktig egg aktivering. Når eggene er ekstrudert fra mor under naturlig parring, blir de aktivert. I sebrafisk, eksponering for vann er tilstrekkelig for fullstendig aktivering egg, uavhengig av tilstedeværelsen av sperm 11.
In vitro-betingelser for tiden tillate modning av oocytter fra tidlig stadium IV-, som kan gjenkjennes ved deres størrelse (690-730 um), tilstedeværelse av en stor GV i en asymmetrisk stilling, og en helt ugjennomsiktig utseende på grunn av opphopning av plommeproteiner (figur 2B) -til det modne stadiet V egg, karakterisert ved at en fullstendig demontert GV og en gjennomskinnelig utseende på grunn av eggeplomme protein prosessering 12 (figur 2C). I denne tilnærmingen, hele eggstokkene fortsinnelukker ubefruktede egg på ulike utviklingsstadier er fjernet fra kvinner. Oocyttene får lov til å utvikle seg i 17α-20β-dihydroksy-4-pregnen-3-on (DHP), en effektiv modningsinduserende hormon 8. I løpet av denne perioden, kan modnings oocytter manipuleres ved injeksjon av uttrykket (f.eks, avkortet, in vitro -transcribed mRNA-er) eller revers genetikk-midler (f.eks, Mos). Follikulær lag ikke spontant felle mot slutten av modningsperioden, slik at det må fjernes manuelt. Etter defolliculation, er in vitro fertilisering oppnås ved å utløse egg aktivering gjennom eksponering av eggene til vann (til stede i embryonisk (E3) medium) 13 og en sperm løsning. De resulterende zygoter gjennomgå embryonal utvikling og gi rom for evaluering av evnen til behandlinger for å manipulere maternal genfunksjon og for visualisering og analyse av merket maternelle produkter (
Protocol
Alle sebrafisk ble håndtert i henhold til god dyr praksis, som definert av de relevante nasjonale og / eller lokale dyrevern organer, og alle dyr arbeidet ble godkjent av den aktuelle komité (University of Wisconsin-Madison forsikring nummer A3368-01). Dyrene ble holdt under standard betingelser ved 26,5 ° C.
1. Forhåndsvalg av Kvinner
MERK: Oocytter hos voksne kvinner vanligvis spenner over et spekter av utviklingsstadier, fra scenen jeg til V (figur 2). Spyling av hunner av allerede eksisterende oocytter gjennom en vellykket naturlig parring øker synkronisering av oocyte staging, som nylig utvikle oocytter vises som en kohort 3, 14. I løpet av ca 8 dager etter spylingen, de fleste oocytter er i tidlig stadium IV, som er optimalt for initiering av in vitro-modning. En slik synkronisering øker utbyttet av oocytter that kan gå gjennom hele prosessen med in vitro-modning, noe som letter eksperimentell manipulasjon. Se tidligere beskrivelser 13 for detaljer om å sette opp fisk i parvise parringer og på fisk vann sammensetning (her 14 g havsalt og 150 g NaHCO3 pr 1000 liter omvendt-osmose vann, pH 6,5-8,5 (foretrukket område: 6.8 -7,5) og en ledningsevne på 180-360 uS). Se Brand et al. 13 for ytterligere oppskrifter.
- Åtte til ti dager før in vitro dyrking manipulasjon, bruke et fiskenett for å overføre en enkelt mann og en enkelt hunnfisk av den ønskede belastning til en sammenpassende tank. Pair flere sett. La dem i parings tanken over natten. Tillate dem å parre seg i løpet av kvelden og gjennom ettermiddagen neste dag.
- Bruke et fiskenett for å separere hunnene som gir egg under sammenføring og plassere dem i en egen tank. Mate disse hunnene ganger daglig med mat blanding containing omtrent en like stor mengde av artemia og fiskefor flak. Mengden av mat bør være nok til å gi omtrent 20 minutter, men ikke mer, av foringstiden.
2. Fremstilling av Modning Medium
MERK: Fremstill modning medium på dagen for in vitro modning eksperiment, innen 1 time for fjerning av oocyttene fra hunn (se punkt 3).
- Tilsett 20 ml av Leibovitz L-15 medium med L-glutamin, pH 7,0, til et 50 ml konisk rør under sterile betingelser. Bringe det til pH 9,0 med 10 N NaOH.
- Legg 9 ml Leibovitz L-15 medium, pH 9,0, til 2 separate 50 ml koniske rør. Etikett en tube "+ DHP" og den andre "-DHP".
- I + DHP røret, tilsett 10 ul av 17α-20β-dihydroksy-4-pregnen-3-on (DHP), 490 ul av dH 2 O, og 500 ul 10% bovint serumalbumin (BSA).
- I -DHP rør, tilsett 100 ul 10 mg / ml gentamycin, 40081; l av dH 2 O, og 500 pl av 10% BSA.
3. Disseksjon av egg og Innvielse av In Vitro Kultur
MERK: in vitro dyrking Forsøket gjennomføres med forhåndsvalgte hunner 8-10 dager etter at de slipper igjennom egg naturlig parring. Bruk modning medium gjort samme dag (se punkt 2). Oocytter modne hensiktsmessig dersom disseksjon påbegynnes nær slutten av fisken diurnal syklusen (bestemt i laboratoriet ved å forhåndsinnstilt kunstig belysning i fisken anlegget) 13, eventuelt etterligne prosesser som skjer gjennom naturlig parring. Dette innebærer at de fleste trinn i protokollen må utføres på kvelden hvis fisken er plassert i et anlegg med en standard lys syklus (for eksempel, begynner med trinn 3.2 6 pm i et anlegg med en 8 til 10 pm lys periode), selv om andre arbeidstidsperioder er mulig med et egnet tidsforskjøvet lys syklus.
- Tilbered en 0,2% trikain stamløsning i dH 2 O, bufret til pH 7,0 med 1 M Tris, pH 9,0, og holde denne løsning ved 4 ° C. Dette kan være forberedt på forhånd.
- Initiere forsøket 0-4 h før utløpet av den daglige lys syklus i anlegget. I et 250 ml begerglass, tilsett 20 ml av en 0,2% trikain stamløsning, pH 7,0, til 80 ml av fisk vann og bland.
- Overfør de forhåndsvalgte hunner for å trikain løsning og avlive dem ved overeksponering. La hunnene i trikain løsningen i 15 minutter etter opphør av gjelle bevegelse.
- Ved hjelp av en skje, samle de avlivet fisken fra trikain og skyll kort i fisk vann. Legg fisken på et papirhåndkle til å absorbere overflødig vann.
- Bruke en ren barberblad til fremrykning den avlivet fisk i høyde med brystfinnen. Ved hjelp av disseksjonssakser, lage et langsgående snitt i den ventrale side av fisken, som strekker seg fra den fremre ende til analområdet.
- Bruke dissekere tang, forsiktig distansere oocyttene fra follicular massene. Sorter de tidlige stadium IV oocytter (figur 2B; før GV sammenbrudd, ved nær-maksimal størrelse, og som er kjennetegnet ved et mørkt, ugjennomsiktig cytoplasma og en lett synlig GV plassert asymmetrisk i oocytten). Kast oocytter på tidligere stadier (figur 2A) og gjennomskinnelige, modne stadiet V egg (lik de i figur 2C, men er tilstede i eggstokkene før behandling DHP).
MERK: Oocytter blir valgt for modning i tidlig stadium IV, det tidligste trinn som resulterer i modne, trinn V til oocytes etter in vitro-dyrkningsbetingelser (figur 2C og D) 3. Fordi stadium IV oocytter aktivt produserer produkter, manipulasjon på dette stadium muliggjør for ekspresjon av eksogene produkter gjennom RNA-injeksjon, eller for reduksjon av genfunksjon via innført MOS. - Bruke et glass Pasteur pipette for å overføre de tidlige stadium IV oocytter til en andre 35 x 10 mm plastkulturskål inneholdende 4 ml Leibovitz L-15 medium + DHP. Overfør minimale mengder av -DHP medium til skålen som inneholdt + DHP løsning.
4. eggcelle Microinjections
MERK: Isolert stadium IV oocytter som gjennomgår in vitro modning kan mikroinjisert for å innføre reagenser for funksjonell manipulering eller tagget proteinekspresjon. Den mikroinjeksjon av reagenser, slik som mRNA og MOS (se avsnitt 4), blir typisk utført når oocyttene gjennomgår in vitro MaTurasjon i + DHP medium, før defolliculation. Dersom det er ønskelig, for å tillate mer tid til å utføre manipulasjoner før oocytmodningen, injeksjoner kan også utføres i -DHP medium, før modning i minst 2 timer. De kan senere overføres til + DHP medium.
- Fremstill-mRNA ved hjelp av en standard uttrykk kit. Holde dem ved -80 ° C som en 100 til 500 pg / pl lager for injeksjon ved en sluttkonsentrasjon på 50 til 500 pg / mL (200 pg / pl anbefales) i RNA-grad vann. Forbered MOS ved en konsentrasjon på 4 ng / pl i vann i henhold til produsentens instruksjoner. Injisere dem ved sluttkonsentrasjoner på 2 ng / ul (eller som bestemt empirisk).
MERK: Injeksjoner er vanligvis utført i + DHP medium før defolliculation (se merknaden i kapittel 5). - Ved å injisere mRNA, umiddelbart før injeksjonen, fortynne den mRNA ved hjelp av RNA-grade omvendt osmose-vann og 0,2 M KCl for å oppnå en sluttløsning på 0,1 M KCl.
- Ved å injisere MOS, umiddelbart før injeksjonen, fortynne MOS til den ønskede konsentrasjon ved hjelp av omvendt-osmose vann og 0,2 M KCl for å oppnå en sluttløsning på 0,1 M KCl.
- Hold manuelt oocytter med fin pinsett og injisere omtrent 1 nL inn i villtype-trinns IV oocytter ved hjelp av en nål laget med et trukket glass kapillær pipette.
- Fremstille glass nålene ved å trekke oppvarmet glasskapillærrør, lasting av oppløsningen som skal injiseres, og bryte nålespissen med tang, som tidligere beskrevet i protokollene for standard injeksjon i sebrafisk tidlige embryoer 15.
MERK: Det er nyttig hvis nålen har en gradvis taper snarere enn en brå ett; Dette gir mer fleksibilitet i forhold til plasseringen av brudd i nålespissen og også bidrar til å hindre skade på den injiserte embryo. Ved å bruke den samme nål og løsning som for embryoet injeksjoner, justerer den injiserte volum ved å forhånds bestemmemicroinjector trykkinnstillinger som produserer det ønskede volum. Disse innstillingene kan bestemmes ved mock-injisering inn i en dråpe mineralolje på et objektbord kalibreringsglide (0,01 mm) og justering av microinjector innstillinger for å oppnå den ønskede diameter i bolus av injisert løsning, som tidligere beskrevet 15.
- Fremstille glass nålene ved å trekke oppvarmet glasskapillærrør, lasting av oppløsningen som skal injiseres, og bryte nålespissen med tang, som tidligere beskrevet i protokollene for standard injeksjon i sebrafisk tidlige embryoer 15.
5. oocytmodningen og Defolliculation
MERK: Under oocytmodningen vil ubefruktede egg blir gradvis gjennomsiktig, noe som gjør det mulig for vurdering av vellykkede kulturforhold.
- Fortsett å inkubere det umodne (og, hvis det passer, injiserte) oocytter i + DHP medium ved 26,5 ° C, sjekker periodisk (hvert 30 min) for å sikre at oocyttene forbli intakt, og gjennomgår riktig modning ved å bli progressivt gjennomskinnelig (se Figur 2C) .
- Fjern eventuelle lyser oocytter med en Pasteur pipette og kast demi et laboratorium avfall begerglass for å opprettholde kvaliteten av mediet. Utveksle kulturmediet med omtrent en halv-volum av friskt medium + DHP til å opprettholde en klar oppløsning, avhengig av mengden av egg lyse.
- Tillat den in vitro-modning til å fortsette inntil et flertall av oocyttene blir gjennomskinnelige og har en GV som ikke lenger er åpenbar (ca. 2 timer i DHP behandling, se figur 2C, sammenlignet med D). Vis dem under et dissekere mikroskop med overført lys optikk.
- Fjern det ytterste follikulær membranen fra hver modnet oocytt. Bruk ekstra fine tang for å lage en rift i den follikulære membranen i et område med økt mellomrom mellom eggcelle og membranen. Skrelle av en del av membranen og rulle oocytten ut av membranen ved å holde nede skrelles del.
MERK: liggende chorionic membranen vil typisk forbli i nær tilknytning til egg i løpet av denne prosessen; etter egg handlingivation, ekspanderer denne for å danne et beskyttende lag for embryoet. - Overfør defolliculated oocyttene i et minimalt volum av medium (vanligvis overføre omtrent 5-10 modne oocytter på mindre enn 20 ul) til en petriskål med noen få dråper av kultur (+ DHP) medium og videre til befruktning.
6. Gjødsling av in vitro dyrkede Oocytter
MERK: spermier løsning på is, fremstilt nedenfor, vil opprettholde sin styrke i ca. 2 timer.
- Fremstill en løsning sperm nær slutten av den oocytmodningen trinnet og før defolliculation ved hjelp av testikler fra fem hanner i 500 mL av Hanks oppløsning, som beskrevet tidligere 16, 17.
- Legg 10-50 mL av sperm løsning på defolliculated oocytter i + DHP kulturmedium. Vent 10 s.
- Ved hjelp av en pipette, tilsett noen dråper av embryonisk (E3) medium til oocytter. Vent ett minutt og deretter oversvømme plspiste med E3 medium.
MERK: Sammensetningen av E3 medium er som følger: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, og 1-5% metylenblått-13. - Gjenta trinn 5.3, 6.2, og 6.3 for å oppnå større antall befruktede embryo.
- La de befruktede embryoer å utvikle. Bruke et disseksjonsmikroskop med utsendte lys og optikk for å observere den progresjon gjennom cleavage trinn for å sikre vellykket befruktning, som tidligere beskrevet for befruktning 17 og staging 18.
Representative Results
For å bestemme om den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor er vellykket, kan embryoene bli observert under spaltingen trinn for å bekrefte forekomsten av den stereotype tidlig embryonisk spaltingsmønsteret 18, så vel som ved 24 timer etter befruktning (HPF) for å bekrefte den riktige utvikling av den grunnleggende kroppen plan. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for manipulering av maternelle produkter for funksjonelle studier ved injeksjon av reagenser, slik som mRNAer og MOS, i løpet av oocytt utvikling.
Manipulering av mors produkter for funksjonelle studier:
mRNA som koder for villtype og muterte produkter kan injiseres i in vitro modne oocytter for å teste effekten av manipuleringen av mors genfunksjon i løpet av meiose og de tidlige embryonale stadier. For eksempel, kan villtype-embryoer injiseres med wiLD-typen mRNA for å teste effekten av produktet overekspresjon, eller med mutant RNA for å teste potensielle dominerende (f.eks, få-av-funksjon og antimorphic) effekter i disse prosessene. Oocytter i in vitro kultur er i stand til å produsere proteiner fra eksogene mRNA gjennom oocytt utvikling, slik som vist ved ekspresjon av GFP fra injisert mRNA, selv om bare oocytter som initierer kulturbetingelsene i trinn IV av oogenesen kan utvikle seg til modne stadiet V oocytter (figur 2B -2D, se også Nair et al. 3). Ekspresjon av vill type produkt gjennom injisert mRNA er også medvirkende til redning av mors-effekt mutasjoner for å bekrefte identiteten gen i løpet av posisjon kloning 3, 24. I dette tilfellet er villtype-mRNA injiseres i oocytter fra homozygote mutante hunner for å teste om vill-type produkter kan redde mutant fenotype. Denne genetiske redning er illustrert i <strong> Figur 3A-3C, hvor injisert AurB mRNA vist å redde de fenotypiske effekter av en mutasjon i den tilsvarende gen, cellulær øy (CEI) (Figur 3A-3C). Embryoene fra en kontrollgruppe er også tillatt å utvikle seg for å vise den tilsvarende mutant fenotype 3. Mutant RNA kan også bli injisert i mutant oocytter for å teste hvorvidt den muterte produktet beholder delvis funksjon ved å sammenlikne graden av rednings til den som forårsakes av villtype produkt.
Proteinekspresjon fra mRNA injiseres i oocytter utviklings synes å forekomme med liten eller ingen forsinkelse. Sterk GFP-ekspresjon ble observert innenfor 2 timer av injeksjonen av det tilsvarende mRNA, uavhengig av utviklingsstadiet av oocytten 3 (figur 2B-2D, se også Nair et al. 3). Produkter som mCherry:SAS6 og Birc5b (broket): GFP kan observeres umiddelbart etter befruktning og i løpet av den første embryoniske cellesyklus 3, 25. Injeksjon av mRNA under oogenesen fører også til produksjon av protein som, uavhengig av den kondenserte merkede del, er funksjonell umiddelbart etter befruktning, som vist i tilfelle av maternelle produkter for cellulær øy / aurB 3, nytteløs syklus / lrmp 24, og broket / bir5b 25. Oversettelse blokker MOS har også en effekt umiddelbart etter befruktning, som vist for fåfengt syklus / Lrmp 3 og ved senere stadier av embryogenesen, som i tilfelle av Mission Impossible / dhx16 tre. Spleise-blokkerende MOS, når det injiseres i modne oocytter, ikke kan ha en effekt på mødre funksjon, sannsynligvis på grunn av allerede tilstedeværende modne maternale transkripsjoner i trinn IV oocytter <sup class = "xref"> 3.
Generering av morphants:
Ved bruk av en MO svarende til et gen med en allerede angitte mutasjon, blir morphant fenotype antas å etterligne den mutante fenotype. Morphants blir sammenlignet med uinjiserte embryoer og til de injisert med en standard, kontroll MO. Injeksjonen av en tekst-blokkerende morfolino kan med hell phenocopy den kjente mutant fenotype 3, som vist ved injeksjon av Lrmp MO i oocytter, som etterligner den mutante fenotype av den tilsvarende mutasjonen, nytteløs syklus (figur 3D-F). Spesifisiteten av MOS kan bestemmes ved de samme metoder som ble benyttet ved injisering MOS i embryoer (gjennomgått tidligere) 19, 20.
Ekspresjon av fluorescensmerkede fusjonsproteiner:
mRNA som koder for genprodukter av interesse fusjonert til fluorescerende proteiner (f.eks GFP og mCherry) kan også injiseres inn i enten villtype eller mutante oocytter for å visualisere de tilsvarende produkter innen tidlig embryo (dvs., noe som reflekterer en subcellulær lokalisering mønster, Figur 3G og 3H). mRNAer som koder for tilsvarende fusjoner, men som omfatter mutant allel kan på samme måte uttrykkes for å teste om mutasjonen påvirker eventuelle subcellulære lokalisasjoner.
Figur 1: In Vitro oocytmodningen. Skjematisk diagram som viser de forskjellige trinn som er involvert i in vitro oocytmodningen. Voksne kvinner er forhåndsvalgt for egglegging 8 dager før prosedyren, for å rense dem for egg som allerede har modnet og til prosplinten ny eggcelle utvikling. Eggstokkene, inneholdende u-oocytter, blir fjernet fra hunnene og overføres til et medium som inneholder hormonet DHP å indusere oocytmodningen in vitro. Etter fjerning fra hunner og umiddelbart før eller under oocytmodningen kan oocytter bli injisert med RNA-produkter og andre reagenser for den funksjonelle manipulering av maternale faktorer. Modne oocytter blir manuelt defolliculated og befruktet in vitro med en sperm-løsning for å gi befruktede, levedyktige embryoer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: In vitro oocytmodningen og ekspresjon av produkter fra Injisert mRNA. (A) oocytter ved trinn I-III, som observeres i ovarier frahunner 4 dager etter spyling (DPP). (B) oocytter i trinn IV, sett i ovarier fra hunner 8 DPP. Germinal vesikkel (GV, pilhode) er godt synlig og inntar en eksentrisk stilling. De stadium III Oocyttene i (A) oppviser også en åpenbar GV, men det er funnet sentrert i oocytt. Trinn IV oocytter i (B) har en størrelse som er nær maksimal sammenlignet med modne oocytter i (c). (C og D) oocytter ved trinn V (modne oocytter) etter 2 timer i in vitro-modning betingelser initiert i trinn IV, som i (B), og injisert i løpet av modning med GFP-koding, in vitro-transkribert mRNA (C, synlig lys bare; D, overlagret av synlig lys og fluorescens GFP). GV er ikke lenger er synlig i trinn V til oocytter, som også er mindre gjennomsiktige enn stadium IV oocytter. Injiserte oocytter som uttrykker GFP protein (D). Defolliculation av modne stadiet IV oocytter er desbert i protokollen delen. Skala bar = 300 pm. Alle panelene ble gjengitt med tillatelse fra Nair et al tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Manipulasjon og visualisering av mors produkter gjennom In Vitro oocytmodningen. (A - C) redning av morens-effekt fenotype forårsaket av en mutasjon i celle øy / aurora B ved injeksjon av villtype aurB mRNA til trinn IV CEI / aurB oocytter. Sammenslåtte bilder som viser dyre visninger av 65 MPF faste blastodiscs, visualisert med anti-P-catenin antistoffer for å fremheve membraner (grønn), anti-a-tubulin-antistoffer for å indikere mikrotubuli (red), og DAPI å betegne DNA (blå). (A) β-catenin akkumulering i villtype-embryoer, tyder på normal fure modning. (B) En cei / aurB embryo fra en ikke-injiserte cei / aurB stadium IV oocytt viser partielle, rudimentære furer som ikke akkumulerer β-catenin. (C) En reddet cei / aurB embryo fra et cei / aurB oocytt injisert med villtype aurB mRNA som viser robust β-catenin akkumulering ved furer. (D - F) Phenocopy av morens-effekt forårsaket av en mutasjon i nytteløs syklus / lrmp fra injeksjon av Lrmp morfolino til trinn IV oocytter. Sammenslåtte bilder som viser dyre visninger av 70 MPF faste blastodiscs, visualisert med anti-y-tubulin-antistoffer for å indikere centrosomer (rød) og DAPI å betegne DNA (blå). (D) I villtype-embryoer, hver nucleus forbinder med γ-tubulin, en markør for centrosomal materiale. (E) I maternal-effekt fue mutanter, svikter pronukleær fusjon, noe som resulterer i to til tre flekker av DNA-etiketter som tilsvarer ikke-sammensmeltede foreldre pro-kjerner og det polare legemet for meiose II. (F) I Lrmp morphants, hvor moder Lrmp funksjon inhiberes, kjernene på samme måte mislykkes i å dele seg og, i tillegg, mislykkes i å assosiere med γ-tubulin. (G og H) Visualisering av matern produsert produkt i tidlig embryo. Sass6-mCherry protein fra eksogent mRNA injisert i trinn IV oocytter lokaliseres til de Sentrioler. Sammenslåtte bilder som viser dyre visninger av 40 MPF faste blastodiscs, visualisert med anti-y-tubulin-antistoffer for å fremheve centrosomer (grønn), mCherry fluorescens for å indikere Sass6 (rødt), og DAPI å betegne DNA (blå). (G) Uttrykt Sass6-mCherry protein lokaliserer til brennpunktene merket med markør sentrosomen γ-tubulin ved seter som flankerer kjernen (piler). (H et al tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stadier av oogenesen | Oocytt diameter (um) | Key landemerke (s) |
| 1A - Prefollicle | 7 til 20 | Initiering av transkripsjon aktiv, akkumulering av nucleoli |
| 1B - Follicle | 20-140 | Decondensation av kromosomer |
| II - kortikal alveolus | 140-340 | Kortikal alveolene produksjon |
| III - Vitellogenesis | 340-690 | Mørkere ooplasm ved akkumulering av eggeplomme forløper protein og lipider |
| Tidlig IV - oocytmodningen | 690-730 (nedre område) | Asymmetrisk lokalisering av germinal vesikkel |
| Tidlig IV - oocytmodningen | 690-730 (øvre rekke) | Germinal vesikkel forsvinner, arrest ved metafase II |
| V - Moden eggcelle | ~ 750 | Ooplasm / eggeplomme blir gjennomskinnelig |
Tabell 1: Landemerker av egg Utvikling i Zebrafisk.
Discussion
Den ovennevnte protokoll er for manipulering av genprodukter før befruktning, og dermed gir for studiet av maternale genprodukter i den tidlige sebrafisk embryo. Tidligere studier har vært i stand til å modne oocytter in vitro 4; denne protokoll ble modifisert for å muliggjøre den påfølgende befruktning in vitro modne oocyttene 8. Dette i sin tur gjør det mulig for injeksjon av reagenser for funksjonell manipulering og visualisering av matern arvet produkt i tidlig embryo 3. Embryoer som følge av denne metoden kan være levedyktig og kan overleve å bli frukt voksne. I preliminære eksperimenter, omtrent halvparten av det befruktede embryo som avledes fra denne fremgangsmåte var levedyktige på dag 5 i utvikling, som bedømt ved svømmeblæren inflasjon på det stadiet, hvorav omtrent halvparten ble fertile, friske voksne (upubliserte observasjoner).
Det finnes en rekkeav kritiske tiltak for å vurdere i protokollen. Oocytter ved passende trinn for å initiere modning (tidlig stadium IV) kan anrikes hvis hunn var blitt paret med nylig, men ikke før 8 dpp. Ved hjelp av fisk som ikke har parret sist kan resultere i dårligere egg 14, som ikke vil gjennomgå modning. Hunner parret i løpet av mindre enn 8 dager vil ha et flertall av egg i stadium III eller mindre, og dermed vil eggene ikke modne ordentlig in vitro. Eggstokkene hos hunner som parret 8 dager før vil ha en optimal andel av oocytter i tidlig stadium IV. Disse kan bli gjenkjent ved deres opasitet og tilstedeværelsen av GV i en eksentrisk stilling (figur 2B). Oocytt trinns bestemmelse kan også bli hjulpet av størrelsesmåling, med oocyttene plassert på en gradert mikrometer lysbilde under et mikroskop og sammenlignet med standard stillas retningslinjer (tabell 1). Imidlertid tidlig stadium IV oocytter som har tilnærmet maksimal størrelse i forhold til modenoocytter (gjenkjent ved deres relative gjennomsiktighet og mangel på en GV, figur 2C), og er lett å kjenne igjen, som beskrevet ovenfor, som generelt unngår behovet for en direkte oocyte størrelsesmåling.
In vitro-modning skal påbegynnes innen flere timer etter avslutningen av den dagslyset syklusen til hvilken hunn Oocytt donorer akklimatiseres. Eggceller vil ikke modne ordentlig, gjenspeiles i fattige befruktning priser, hvis dyrket i løpet av formiddagen perioden av lys syklus. Grunnen til circadian avhengighet av in vitro oocytmodningen metoden er ikke forstått, men sannsynlig reflekterer de underliggende cirkadianske skjevheter i in vivo-modning egg som involverer sykling-genekspresjon i løpet av oogenesen 21. En vanlig årsak til oocytter unnlate å gjennomgå vellykket in vitro modning til tross for riktig eggcelle staging er at DHP er utgått. DHP hormon generelt utløper etter et år, og for å sikre effektive modning, bør arbeids batch erstattes innen 9 måneders bruk.
Injeksjonen av oocytter er et kritisk trinn når formålet med denne metode er den funksjonelle manipulering av maternelle produkter. Denne prosedyren har krav som avviker fra dem for standard injeksjoner i det befruktede egget på 0-30 MPF. En viktig faktor i oocytt-injeksjon er det nødvendig å utføre injeksjonene under betingelser som ikke fører til for tidlig aktivering egg, slik som i Leibovitz L-15 medium 22, 23. Fordi de er innebygd i eggstokkene, modning oocytter også byr på spesielle utfordringer for injeksjon. Protokollen over antyder første dissosiering oocytter fra ovariene og deretter holder hver dissosiert oocytt separat med pinsett mens den injiseres. Denne teknikken har fungert godt og tillater forhåndssortering oocytter på det passende trinn med minimal håndtering. Alternative metoder kan også benyttes, for eksempelsom: i) plassering av oocytter til standard sprøyte agarose renner 15, hvor de vertikale vegger av trauet støtte oocytt under injeksjon (i denne alternative fremgangsmåten blir oocyttene må overføres til injeksjons plater mens det holdes i in vitro modning medium) og ii ) slik at oocyttene til å forbli festet til ovarian masse, som kan holdes med pinsetter under injeksjonen for å unngå kontakt med den injiserte oocyte (i denne tilnærmingen, oocyttene skulle være dissosiert etter injeksjonen for å både lette DHP eksponering og for å tillate deres defolliculation , selv avgjørende for IVF). Til tross for denne spesifikke utfordring, kan stadium IV oocytter lett kan gjennomtrenges med en injeksjonsnål, sannsynligvis fordi chorion membranen på dette stadium ikke er fullt utviklet 9.
En begrensning av den aktuelle modningsprotokollen er at in vitro modning betingelser som fremmer riktig oocytt utviklingkan ikke opprettes når oocytmodningen startes ved etapper tidligere enn stadium IV. Oocytter blir i stand til å svare på DHP ved gjennomgår modning når de når en diameter på 520 um, noe som skjer i løpet av fase III (vitellogenesis, svarende til en kapasitet på 340 til-690-pm området) 9. Imidlertid kulturen fra trinn III oocytter resulterer i oocytter som ikke er kompetente for befruktning 3. Oocytter bare hvis in vitro dyrking blir initiert ved trinn IV (figur 2B) kan utvikle seg til modne, trinnet V-oocytter (figur 2C og D). Dette kan henge sammen med det faktum at stadium III er en forutsetning for vitellogenesis og oocyte vekst 9. Således in vitro oocytmodningen fremgangsmåten presentert i denne artikkelen bør bare brukes sammen med en utgangspopulasjon av Stadium IV oocytter (B), og ikke med oocytter på tidligere stadier (stadiene I - III; Figur e
En annen begrensning i den presenterte fremgangsmåten er at defolliculation, noe som er viktig for de etterfølgende trinn som involverer befruktning, er for tiden et hastighetsbegrensende trinn i prosedyren. Follikulær Membranen er et gjennomsiktig lag som omgir den utviklende oocyte, og fjerningen kan være kjedelig. Hvis denne membranen ikke er fullstendig fjernet, vil egg ikke blir fullt aktivert og gjødslet. Dette blir tydeliggjort ved svikt i chorion å ekspandere og utvikling av uregelmessig plassert, fure lignende structures (pseudocleavages), som er karakteristiske for Ledd embryoer 11. Enzymatiske defolliculation metoder, slik som kollagenase, som anvendt i Xenopus, har vært forsøkt. Men i våre hender, denne teknikken ikke har vært vellykket, og vi er avhengige derfor på manuell defolliculation. Fordi manuell defolliculation er arbeidskrevende og tidkrevende, er det vanskelig å få store grupper av befruktede egg etter in vitro oocytmodningen. På grunn av tidsmessige begrensning pålagt av manuell defolliculation som vi gjødsle noen defolliculated, modne egg om gangen, i små grupper på 5-10 egg. Innlemmelsen av enzymatisk defolliculation med denne prosedyren vil trolig øke sin avkastning og generell brukervennlighet.
Selv embryoer produsert etter befruktning av in vitro -matured ubefruktede egg kan bli levedyktig voksne, ser vi at etter in vitro fertilisering, en brøkdel av embryoer gjøre ikke deles på vanlig måte eller i tide. Vi er for tiden å velge for linjer hvis forplantnings omfatter runder med in vitro oocytmodningen, noe som kan resultere i mer robuste mønstre av utvikling i embryoer avledet gjennom denne metoden.
Fremgangsmåten har gjort det mulig for den klare redning eller visualisering av protein lokalisering for en rekke mutasjoner 24, 25. Imidlertid, for noen gener, kan regulering av produktet uttrykk være avgjørende, så produktene uttrykt ved injisert mRNA kan føre til varierende resultater 26. Det er også viktig å være oppmerksom på alle kontrollene (f.eks fostre som er injisert med reagenser som har lignende egenskaper som dem som anvendes i forsøket ennå er anslått å ikke produsere en effekt, slik som kontroll MOS eller RNA som koder for inerte proteiner bare, slik som GFP), som underliggende variabilitet kan føre til feilaktige konklusjoner.
nt "> Et forsøk som omfatter in vitro-manipulasjon, etterfulgt av befruktning er spesielt nyttig når det gjelder moderlig avsatte produkter, hvor den standard metode for å injisere RNA, MOS, eller protein inn i det befruktede egget kan ikke effektivt reduserer produkter som allerede er akkumulert i egget. andre nylig utviklede metoder, slik som CRISPR-mutant generasjon, er også effektive til å generere mutante betingelser for maternale uttrykte gener 26. imidlertid krever denne metoden veksten av flere generasjoner av fisk. in vitro oocytmodningen teknikken gjør det mulig for hurtig funksjonell manipulasjon for å studere funksjonen av matern uttrykte gener, inkludert redning og phenocopy av mors-effekt mutasjoner, så vel som ekspresjon av RNA og proteiner i tidlig embryo.Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke medlemmene av Pelegri lab og fisk anlegget ledelses ansatte, som var instrumental i å tilrettelegge dette prosjektet. Støtte for dette prosjektet ble gitt av NIH R56 GM065303 og NIH 2 T32 GM007133 til ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 og NIH 2 T32 GM007133 til CCE, og NIH RO1 GM065303 til FP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO2-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO2 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 mL | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 mL (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15 mL | any maker | ||
| Conical tubes 50 mL | any maker | ||
| plastic pipette 10 mL with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 mL with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
References
- Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).
- Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it's in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).
- Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).
- Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement. Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).
- Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho. Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).
- Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker. Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development. Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B.
- Kanagaraj, P., et al. Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis. PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Pelegri, F., Mullins, M. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. J Vis Exp. , (2016).
- Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).
- Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).
- Pelegri, F., Mullins, M. C. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 135, (2016).
- Lindeman, R. E., Pelegri, F. Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote. Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).
- Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo. PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
