Introduction
Nukleær faktor 90 (NF90) er et multi-isoform-protein med en rekke funksjoner, inkludert respons på virusinfeksjon, for regulering av interleukin-2 post-transkripsjon og regulering av miRNA biogenese 1-3. RBM3 er en RNA-bindende protein, er involvert i oversettelse og miRNA biogenesis og kan være forårsaket av ulike stressfaktorer inkludert hypotermi og hypoksi 4-6. Nylig fant vi NF90 og RBM3 i et proteinkompleks 7. Samspillet mellom NF90 og RBM3 er viktig å modulere protein kinase RNA-lignende endoplasmatiske retikulum kinase (PERK) aktivitet i utfoldet protein respons 7. Både NF90 og RBM3 ligger hovedsakelig i kjernen, men en liten andel av NF90 og RBM3 transport til cytoplasma og binde det til hverandre for bestemte funksjoner, for eksempel for å regulere PERK aktivitet. Derfor er det viktig å visualisere fordelingen av NF90-RBM3 interaksjoner i den subcellulære rommet, noe som kan indikeresine ulike roller i respektive rom.
For flere tiår siden, ble gjær to hybrid (Y2H) utviklet for å oppdage samspillet mellom to proteiner 8. Men på grunn av kunstig konstruksjon av fusjonerte proteiner, er falske positive resultater begrenset anvendelsen av denne metoden. I lang tid, co-immunutfelling ble de viktigste teknikk for å analysere protein-protein interaksjoner, spesielt i endogene forhold 9. For å analysere den ko-immunopresipitert proteinkompleks, er Western blot det mest hensiktsmessig teknikk, mens massespektrometri er brukt når super følsomhet og nøyaktighet er ønskelig. I de senere år har nærhet ringsanalyse blitt utviklet som en ny metode for å påvise protein-protein interaksjoner i begge celler og vev in situ 10,11.
Her sammenlignet vi det mest populære ko-immunoutfelling fremgangsmåte og en forholdsvis ny nærhet ligering analysemetoden i å fange NF90-RBM3 samhandling i subcellulære fraksjoner. Vi diskuterte også fordeler og begrensninger av begge teknikkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Co-immunoprecipitation
- Seed HEK293-celler på 2 x 10 5 celler per brønn i en 6-brønns plate i 2 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplement med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin-streptomycin (Pen-Strep) .
- Dyrke cellene i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Vask cellene med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) tre ganger. Høste cellene ved sentrifugering ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Forbered atom og cytoplasmatiske fraksjoner ved hjelp av kommersielle kjernekraft og cytoplasmatiske utvinning reagenser. Følg produsentens anvisninger med noen modifikasjoner.
- Bruke 3 x 10 6 celler for en ko-immunutfelling eksperimentet (omtrent med 90% konfluens fra 3 brønner i en 6-brønns plate). Tilsett 300 ul kald cytoplasmiske ekstraksjon oppløsning (CER I) og vortex i 15 sekunder ved den høyeste hastighet.
- Inkuber i 30 min på is. Under inkubasjon, vortex for 5 s hvert 10 min.
- Legg 16,5 mL kald cytoplasma utvinning løsning II (CER II), vortex i 5 sek og inkuberes i 5 min på is.
- Vortex i 5 sek og sentrifuger ved 16 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (cytoplasma ekstrakt) i en ny pre-kjølt tube, og holde på is inntil bruk.
- Vask uoppløselige pellets (som inneholder atomkjerner) tre ganger med 1 ml kald PBS hver gang ved å pipettere opp og ned fem ganger. Fjern PBS etter vask.
- Tilsett 150 ul kald atom utvinning løsning (NER), vortex i 15 sek og inkuber 1 time på is. Under inkubasjon, vortex i 15 sek og pipette 10 ganger med en 200 mL tips hver 10 min.
- Vortex i 15 s og sentrifuger ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (kjerneekstrakt) i en ny pre-kjølt tube, holde på is inntil bruk.
- Ta ut 10% av volumet av kjernefysiske og cytoplasmatiske ekstrakter hvert som innganger.
- ENdd kald PBS til de gjenværende ekstrakter til et sluttvolum på 1 ml. Hold på is inntil bruk.
MERK: Pre-clearing er ikke avgjørende når du bruker Protein G-konjugert magnetiske kuler. Imidlertid, hvis den bakgrunn er høy, utfører forhånds lysning ved å inkubere 40 ul Protein G-konjugerte magnetiske kuler (50% suspensjon) og 1 ml fortynnet lysat fra dette trinnet ved 4 ° C i 30 min på en rotator. Separat supernatant (pre-ryddet lysat) fra perler med magnetstativ. Kast perlene. - For å par primære antistoff med protein G-konjugerte magnetiske kuler, inkubere 40 ul Protein G-konjugerte magnetiske kuler (50% suspensjon) med 4 ug kanin polyklonalt anti-RBM3 antistoff eller kanin IgG (negativ kontroll) i 200 ul PBS pluss-Tween 20 buffer (PBST, 0,02% Tween 20) ved værelsestemperatur (RT) i 40 minutter på en rotator.
- Separat antistoff-koblet perler og supernatanten med en magnetisk rack, og kast supernatanten. Vask kulene en gang med 200 ul PBST (0,02%).
- Legg enml fortynnet lysatene (eller eventuelt forhånds ryddet lysatene) til perlene, og inkuber på rotator ved 4 ° C over natten.
- På neste dag, skille perler og supernatanten ved en magnetisk stativ, og kast supernatanten. Vask 3 x 10 minutter med 0,5 ml PBST (0,02%) for hvert rør ved 4 ° C på en rotator med en fast hastighet på 20 rpm.
- Eluere proteiner fra kulene ved tilsetning av 40 pl prøvebuffer (1 x kommersiell prøvebuffer og 50 mM 1,4-ditiotreitol (DTT)). Oppvarm til 70 ° C i 10 min. Spinn ned og overføre væsker til en ny 1,5 ml tube.
- Fortynn inngangs lysater i prøvebuffer (sluttkonsentrasjon: 1x kommersiell prøvebuffer og 50 mM DTT) og oppvarm til 70 ° C i 10 min. Laste innganger og immunopresipitert proteiner fra det siste trinnet i en precast 4-12% Bis-Tris gel. Lastingen volumet av hver brønn bør ikke overstige 20 pl. Utføre elektroforese i 1x kommersiell rennende buffer på is i 35 min.
MERK: Load kjernekraft og cytoplasma ekstrakts i et forhold på 1: 2 (v / v), noe som gjenspeiler den samme opprinnelige mengde av celler. - Overføring til PVDF-membran-proteiner i 1x kommersiell transport-buffer ved 30 V i 2 timer ved 4 ° C.
- Blokk membran med 5% skummet melk i PBST (0,1% Tween 20) ved RT i 40 min på en rister.
- Inkuber membran med primære antistoffer (både fortynnet i 1: 1000) i PBST (0,1%) ved 4 ° C over natten.
- Vask 3 x 10 minutter med PBST (0,1%) ved RT på en ristemaskin.
- Inkuber membran med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer (både fortynnet i 1: 5000) i PBST (0,1%) ved romtemperatur i 1 time.
- Vask 3 x 10 minutter med PBST (0,1%) ved RT på en ristemaskin.
- Bruk 0,2 ml forsterket kjemiluminescens (ECL) substrat blanding pr cm2 membran, inkuber ved romtemperatur i 5 min. Unngå alt lys fra dette trinnet fremover unntatt røde lys.
- Kast væske og utsettes for en røntgenfilm i en filmkassett. Utvikle film ved hjelp av en automatisk film processing maskin.
2. Immunocytochemistry og Proximity hemorroider Assay
- Seed HEK293 celler ved 1,5 x 10 4 celler pr kammeret i en 8-kammer poly-D-lysin-belagte lysbilde i 0,4 ml DMEM supplementert med 10% FBS og 100 U / ml Pen-Strep.
- Dyrke cellene i 48 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
- Aspirer medium, og feste celler med 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter ved RT.
- Aspirer PFA, og vask 3 x 10 minutter med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Permeabilize og blokk-celler med 0,5% Triton X-100 og 5% normalt geiteserum (NGS) i PBS ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber med primære antistoffer i 0,1% Triton X-100 og 5% NGS i PBS på et risteapparat ved 4 ° C over natten. Fortynnet mus monoklonalt anti-NF90 antistoff og kanin polyklonale anti-RBM3 antistoff 1: 100 i PBS for dobbel-farging. For negativ kontroll, uavhengig utelate en av de to primære antistoffer, og utelater begge antistoffene i en tredje styre.
MERK: Ikke bruk kommersielle blokkering og fortynning reagenser. - Vask 3 x 10 minutter med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Med forbehold om immunocytochemistry eller nærhets ligation analyseprotokoller
- immunocytochemistry
- Inkuber med 1: 500 fortynnet grønt fluorescerende fargestoff-koblet anti-mus og røde fluorescerende fargestoffkoplet anti-kanin sekundære antistoffer ved RT i 1 time. Unngå lys fra dette trinnet og utover.
- Counterstain atomkjerner med 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) fortynnet 1: 5000 i PBS ved romtemperatur i 10 min.
- Vask 3 x 10 minutter med 0,5 ml PBS pr kammer.
- Fjern kamrene fra glass-slide og tørr. Monter med 250 μ, monteringsmedium per lysbilde.
- Nærhet ligation assay
- Forbered nærhets ligation analyse sonder. Bland og fortynne to nærhets ligation analyse sonder (anti-mus og anti-kanin sekundære antistoffer festet med ulike oligonukleotider som kan ligate thgrov tilsetning av to andre oligonukleotider i ligeringsløsning) både 1: 5 i 0,1% Triton X-100 og 5% NGS i PBS, med et totalvolum på 320 ul i en 8-kammer sleiden (ca. 40 ul per cm 2) . Inkuber ved RT i 20 min.
- Fjern kamrene fra glass-slide og legge utvannet sonder. Inkuber i et fuktighetsinkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Forbered ligation løsning. Bland 8 pl ligase, 64 ul 5 x ligation lager og 248 mL H 2 O.
- Slag av væsken fra raset, og vask 2 x 5 min i 1x vaskebuffer A (følger med settet).
- Legg ligering løsning og inkuberes i et fuktighetsinkubator ved 37 ° C i 30 minutter.
- Forbered forsterkning løsning. Bland 4 ul polymerase, 64 mL 5x forsterkning lager og 252 mL H 2 O. Unngå lys fra dette trinnet og utover.
- Slag av væske fra raset, og vask 2 x 2 min i 1x vaskebuffer A.
- Tilsett amplification løsning og inkuberes i en mørk fuktighet inkubator ved 37 ° C i 100 min.
- Slag av væsken fra raset, og vask 2 x 10 min i 1x vaskebuffer B (følger med settet). Vask i 1 min i 0.01x Wash Buffer B.
- Tørk lysbildet og monter med 250 ul av en kommersiell montering medium (med DAPI) per lysbilde.
- immunocytochemistry
- Undersøk fluorescerende signaler under et mikroskop ved hjelp av en 10X okular og 20X objektiv. Hente bilder av en CCD-kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser at NF90 og RBM3 er begge kjerneproteiner og bare en liten del er til stede i cytoplasma. Spesielt er det tre forskjellige band farget positivt for RBM3. Den minste rett under 20 kDa reflekterer den riktige størrelsen RBM3 (den anslåtte molekylvekt RBM3 er 17 kDa). Opprinnelsen til de to andre band gjenstår å bli undersøkt. Co-immunoutfellingsstudier eksperimenter med RBM3 som agn protein avslørte at NF90-RBM3 interaksjoner er hovedsakelig til stede i kjernen og et mindretall i cytoplasma. Co-immunoutfelling data støtter lokalisering av hver enkelt protein.
Som vist i figur 2A, er NF90 og RBM3 hovedsakelig lokalisert i kjernen, men også i cytoplasma in situ. Begge proteiner viser perfekt samlokalisering i begge avdelinger. Nærhet ligation analysen avslørte mønsterav NF90-RBM3 interaksjoner, noe som er svært lik vanlig immunocytokjemi, med de fleste vekselvirkninger i kjernen i mesteparten av cellene. Bare en liten andel av celler som viste overveiende cytoplasmiske fordeling av NF90-RBM3 interaksjoner.
Tatt sammen, co-immunoutfellingsstudier og nærhet Ringsanalyseteknikker reflektere utgangspunktet den samme fordelingen mønster av protein-protein interaksjoner i kjernefysiske og cytoplasmatiske avdelinger.
Figur 1: Western blot analyse av NF90 og RBM3 og deres samspill i Atom og cytoplasmatiske Brøkdeler av HEK293 celler. Nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble lastet på SDS-PAGE-gel i et forhold på 1: 2 (v / v), noe som reflekterer den samme mengde av celler som angitt i utvinning protokollen. Lamin og GAPDH ble brukt som atomog cytoplasmatiske markører, henholdsvis. Co-immunoutfelling ble utført med anti-RBM3 antistoff eller kanin IgG som negativ kontroll. Nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble også inkubert med anti-RBM3 antistoff i et forhold på 1: 2 (v / v), respektivt. Øvre band i NF90 blot viser 110 kDa lang isoform NF110. N: kjerneekstrakt; C: cytoplasma ekstrakt, IP: immunoprecipitation. Protein markører ble merket for RBM3 positive band. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunocytochemistry og Proximity Ligation analysen av HEK293 celler. (A) Dobbelt farging av HEK293 celler med anti-NF90 (grønn) og anti-RBM3 (rød) antistoffer. Pil viser celler med klare cytoplasmatiske samlokalisering av NF90 og RBM3. Kjerner ble kontra med DAPI (blå). (B) Nærhet ligation analysen med anti-NF90 og anti-RBM3 antistoffer i HEK293 celler. Røde fluorescerende flekker indikerer NF90-RBM3 interaksjoner. Pilene viser NF90-RBM3 interaksjoner i cytoplasma. Kjerner ble kontra med DAPI (blå). Negativ kontroll 1 (NC 1): både primære antistoffer ble utelatt. Negativ kontroll 2 (NC 2): RBM3 enkelt primær antistoff bare. Negativ kontroll 3 (NC 3): NF90 enkelt primær bare antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere fordeler så vel som ulemper for begge metodene. Som en relativt ny teknikk, en åpenbar fordel med nærhet ligation analysen er muligheten til å belyse protein-protein interaksjoner på enkeltcellenivå i stedet for en gruppe med heterogene celler. Bilder med høy styrke og oppløsning (for eksempel ved konfokal mikroskop) gi mulighet for kvantifisering ved å telle enkelt fluorescerende flekker. I motsetning til dette, kan den konvensjonelle kombinasjon av ko-immunoutfelling teknikken med Western blot bare halv kvantifisere proteinbånd, hovedsakelig fordi en passende lasting kontroll er vanskelig å bestemme for IP-prøver. I tillegg, når protein-protein interaksjon er svak eller forbigående, en stor mengde biologisk materiale, f.eks, celler eller vev, er nødvendig for ko-immunutfelling eller en kunstig overuttrykker system med smeltet merkelappen påføres for å forbedre muligheten til å detektere interaksjonen . Alternativt deteksjon techniques med høy følsomhet slik som massespektrometri kan forbedre kvaliteten forsøket. Imidlertid, med hensyn til mengden av utgangsmaterialet nærhet ringsanalysemetoden har klare fordeler. Bare noen få celler er nødvendig, forutsatt at en høy kvalitet av antistoffer er gitt. Videre er det i vevsprøver, in situ visualisering av protein-protein interaksjoner i ulike vevstrukturer og celletyper kan bli oppnådd ved ligering nærhet assay i et lignende mønster som normalt immunohistokjemi. I motsetning til dette, er co-immunutfelling av sin natur uegnet til å vise den romlige fordeling av protein-protein interaksjoner.
I celler med store kjerner, men små cytoplasmatiske avdelinger, er nærhet ringsanalysemetoden begrenset i å analysere atom cytoplasma distribusjoner og tradisjonelle co-immunoprecipitation har sin egen overlegenhet. For eksempel, i T-lymfocytt-cellelinjer, f.eks Jurkat-celler, atom-cytoplasma distributions av NF90-RBM3 interaksjon med nærhet ligering analyseteknikk er begrenset, fordi kjernen opptar nesten hele rommet inne i cellen, og det er vanskelig å identifisere grensen av cytoplasmisk rommet. Dette kan være et vanlig problem for immunocytokjemi generelt, når nucleus-cytoplasma-forhold er svært ubalansert. Imidlertid er co-immunoprecipitation i denne situasjonen ikke denne begrensningen.
Én spesiell bekymring angående nærhet ringsanalyse er hvorvidt signalene fra nærhetsrings analysen representere direkte eller indirekte protein-protein-interaksjoner. Både NF90 og RBM3 har RNA-bindende egenskaper og deres samspill er avhengig av RNA, som rapportert i vår tidligere studie 7. Dermed forbehandling av cellelysater med RNase oppløser samspillet mellom NF90 og RBM3 og ingenting er synlig ved co-immunoprecipitation metode 7. Imidlertid er nærhet ringsanalysesignal ikke påvirkesSelv om en RNA-avhengig protein-protein interaksjon mistet RNA-arter, som det frembringes når avstanden mellom to proteiner er mindre enn 40 nm, som vanligvis betraktes som en direkte interaksjon. Denne egenskapen av nærhet ligation analysen kan overvinne tekniske problemer fra co-immunoprecipitation, slik som RNase utgivelse i cellelysat som kan avskaffe samspillet krever RNA mekling. Men på den annen side, nærhet ringsanalysemetoden kan også generere falske positive signaler, hvis RNA-avhengig protein-protein interaksjon faktisk ikke eksisterer på grunn av mangelen på spesifikke RNA i fysiologiske betingelser.
Et annet problem som fortjener spesiell oppmerksomhet, er spesifisiteten av primære antistoffer og muligheten for protein isoformer, forløpere og proteinaggregater. Vi har observert ved Western blot at den lange NF90 isoform, NF110, er mye mindre rikelig i både kjernen og cytoplasmaet i HEK293 celler sammenlignet med NF90 (Fifigur 1). Men co-immunoprecipitation raknet en høyere binding affinitet NF110 å RBM3 spesielt i kjernen. Tre hovedbånd ble oppdaget i RBM3 blotter i kjernen, men bare den 20 kDa normal RBM3 båndet ble hovedsakelig observert i cytoplasma. Enten de to andre 50 kDa og 100 kDa band reflektere RBM3 isoformer, forløpere, protein aggregater med bundet RBM3 eller var på grunn av uspesifikke bakgrunn gjenstår å bli belyst. I stedet, ettersom nærhet ligation analysen er basert på farging, nærhet ligation analysen kan ikke skille forskjellen mellom ulike protein isoformer, forløpere, aggregater eller uspesifikke flekker, mens co-immunoprecipitation kan gi mer informasjon om antistoffspesifisiteten eller protein isoformer og forløpere enn nærhet ligation analysen i å undersøke protein-protein interaksjoner. Angå RBM3, når de vurderer alle tre RBM3 band observert i kjernen, er Western blot resultat i samsvar med en dominerende kjerner localizatipå av RBM3 observert av farging.
I konklusjonen, begge co-immunoutfellingsstudier og nærhet Ringsanalyseteknikker har iboende fordeler og begrensninger. I mange tilfeller fremstille de ensartede resultater, men det er fordelaktig å bruke begge teknikkene ved systematisk å undersøke visse protein-protein-interaksjon. Men i spesielle tilfeller eller med bestemt formål, kunne man vise overlegenhet enn den andre. Nylig har nærhet ringsanalyse blitt brukt til å screene protein-protein interaksjoner for å utvikle nye prognostiske markører 12. Protein-protein interaksjon er ansett som en mer pålitelig biomarkør enn et enkelt protein. I fremtiden kan det nærhet ringsanalysen potensielt bli en rask og pålitelig måte for å analysere protein-protein interaksjoner som diagnostiske og prognostiske biomarkører i klinikker, selv om identifikasjon og karakterisering av slike biomarkører fortsatt krever den konvensjonelle co-immuoprecipication megthod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
