Introduction
Fator nuclear 90 (NF90) é uma proteína multi-isoforma com inúmeras funções, incluindo a resposta à infecção viral, a regulação de interleucina-2 pós-transcrição e regulação do miRNA biogênese 1-3. RBM3 é uma proteína de ligação a ARN, envolvidos na tradução e miARN biogénese e pode ser induzida por vários factores de stress incluindo a hipoxia e hipotermia 4-6. Recentemente, encontramos NF90 e RBM3 em um complexo de proteínas 7. A interacção de NF90 e RBM3 é essencial para modular a actividade de proteína quinase-ARN como retículo endoplasmático quinase (PERK) em resposta proteína desdobrada 7. Ambos NF90 e RBM3 estão localizados predominantemente no núcleo, mas uma pequena proporção de NF90 e de transporte RBM3 para o citoplasma e se ligam uns aos outros para lá para funções específicas, por exemplo, para regular a actividade de vantagem. Portanto, é importante para visualizar a distribuição de interacções NF90-RBM3 no compartimento subcelular, que pode indicarseus vários papéis no respectivo compartimento.
Décadas atrás, dois híbridos de levedura (Y2H) foi desenvolvido para detectar a interacção entre duas proteínas 8. No entanto, devido à construção artificial de proteínas fundidas, falsos resultados positivos têm restringido a aplicação deste método. Durante muito tempo, a co-imunoprecipitação foi a principal técnica para analisar interacções proteína-proteína, especialmente em condições endógenas 9. Para analisar o complexo de proteína de co-imunoprecipitada, Western blot é a técnica mais conveniente, enquanto a espectrometria de massa é usada quando super-sensibilidade e precisão são desejados. Nos últimos anos, ensaio de proximidade de ligação foi desenvolvida como um método novo para a detecção de interacções proteína-proteína em ambas as células e tecidos in situ 10,11.
Aqui, nós comparamos o método de co-imunoprecipitação mais popular e método de ensaio de proximidade de ligação relativamente nova na captura NF9interacção 0-RBM3 em fracções subcelulares. Também discutimos as vantagens e limitações de ambas as técnicas.
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Protocol
1. Co-imunoprecipitação
- Semente HEK293 células a 2 x 10 5 células por cavidade em uma placa de 6 cavidades em 2 ml de modificação Médio suplemento (DMEM) de Eagle da Dulbecco com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
- Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Lavar as células com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) três vezes. Células colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- A preparação das fracções nuclear e citoplasmática usando reagentes de extracção nuclear e citoplasmática comerciais. Siga as instruções do fabricante, com algumas modificações.
- Use 3 X 10 6 células para uma experiência de co-imunoprecipitação (aproximadamente com 90% de confluência de 3 poços de uma placa de 6 poços). Adicionar 300 ul solução fria citoplasmática de extração (CER I) e vortex por 15 segundos na velocidade mais alta.
- Incubar durante 30 min em gelo. Durante a incubação, vorteX 5 s por cada 10 min.
- Adicionar 16,5 ul extracção a frio citoplasmática solução II (CER II), vortex durante 5 segundos e incubar por 5 min em gelo.
- Vortex durante 5 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante (extracto citoplásmico) para um novo tubo de pré-gelada, e manter em gelo até ser utilizada.
- Lavar peletes insolúveis (núcleos) que contêm três vezes com PBS frio 1 ml de cada vez por pipetagem para cima e para baixo cinco vezes. Remover PBS após lavagem.
- Adicionar 150 mL solução de extracção a frio nuclear (NER), vortex durante 15 seg e incubar 1 hora em gelo. Durante a incubação, vortex durante 15 seg e pipeta de 10 vezes com uma ponta de 200 ul a cada 10 min.
- Vortex durante 15 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante (extracto nuclear) para um novo tubo de pré-gelada, manter em gelo até à sua utilização.
- Retire 10% do volume de extractos nucleares e citoplasmáticos como entradas cada.
- UMAdd PBS frio para os restantes extractos para um volume final de 1 ml. Manter em gelo até à sua utilização.
NOTA: Pré-compensação não é essencial quando se utiliza a proteína G conjugada esferas magnéticas. No entanto, se o fundo é alta, realizar pré-limpeza por incubação de 40 ul de esferas de proteína G-conjugados magnéticos (pasta a 50%) e 1 ml de lisado diluído a partir deste passo, a 4 ° C durante 30 min num agitador rotativo. sobrenadante separado (lisado pré-limpo) de grânulos com cremalheira magnética. Descarte as contas. - Para o anticorpo primário par com esferas magnéticas Proteína G-conjugados, incubar 40 ul de proteína esferas magnéticas L-conjugados (pasta a 50%) com o anticorpo 4 ug policlonal de coelho anti-RBM3 ou IgG de coelho (controlo negativo) em 200 ul de PBS mais Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) à temperatura ambiente (TA) durante 40 min num agitador rotativo.
- grânulos e sobrenadante separado anticorpo acoplado com uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavam-se as esferas uma vez com 200 uL de PBST (0,02%).
- Adicione 1ml diluída lisados (ou, se necessário, os lisados pré-limpo) para os grânulos, e incubar num agitador rotativo a 4 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, separar as esferas e o sobrenadante por uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C num agitador rotativo com uma velocidade fixa de 20 rpm.
- Eluir proteínas a partir dos grânulos através da adição de tampão de amostra de 40 ul (tampão de amostra comercial 1x e 1,4 mM de ditiotreitol-50 (DTT)). Aquece-se a 70 ° C durante 10 min. Spin down e líquidos de transferência para um novo tubo de 1,5 ml.
- Dilui-se lisados de entrada em tampão de amostra (concentração final: tampão de amostra comercial 1x e DTT 50 mM) e aquece-se a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga e as proteínas imunoprecipitadas a partir do último passo de um gel pré-moldado de 4-12% Bis-Tris. O volume de carga de cada cavidade não deve exceder 20 ul. Efectuar a electroforese em tampão de corrida 1x comercial em gelo durante 35 min.
NOTA: Carga nuclear e extrato citoplasmáticos numa proporção de 1: 2 (V / V), o que reflecte a mesma quantidade inicial de células. - Transferência de proteínas para uma membrana de PVDF em tampão de transferência comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C.
- Bloco de membrana com 5% de leite desnatado em PBST (0,1% de Tween 20) à temperatura ambiente durante 40 minutos num agitador.
- Incubar membrana com anticorpos primários (ambos diluídos em 1: 1000) em PBST (0,1%) a 4 ° C durante a noite.
- Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador.
- Incubar membrana com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários anti-murganho ou anti-coelho (ambos diluídos em 1: 5000) em PBST (0,1%) à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador.
- Use 0,2 ml quimioluminescência aumentada (ECL) de uma mistura de substrato por membrana cm 2, incubar à TA durante 5 min. Evite toda a luz a partir desta etapa em diante, exceto luzes vermelhas.
- Descartar líquido e expor a um filme de raios-X em uma cassete de película. Desenvolver filme usando uma pr filme automáticamáquina ocessing.
2. Imunocitoqu�ica e proximidade Ligadura Assay
- Semente células HEK293 em 1.5 x 10 4 culas por câmara em uma câmara de 8-poli-D-lisina lâmina revestida em 0,4 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e 100 U / ml de Pen-Strep.
- Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Aspirar o meio, e fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 10 min à TA.
- Aspirar PFA, e lavagem de 3 x 10 min com 0,5 ml de PBS por câmara.
- Permeabilizar as células e de bloco com 0,5% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal (NGS) em PBS à temperatura ambiente durante 1 h.
- Incubar com anticorpos primários em 0,1% de Triton X-100 e 5% em PBS, NGS num agitador a 4 ° C durante a noite. Diluir monoclonal de ratinho anti-NF90 e anticorpo policlonal de coelho anti-anticorpo RBM3 1: 100 em PBS durante dupla coloração. Para controlo negativo, omitir independentemente, qualquer um dos dois anticorpos primários, e omitir ambos os anticorpos em um terceiro controlo.
NOTA: Não utilize o bloqueio comercial e reagentes de diluição. - Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara.
- Sujeito a imunocitoquímica ou de proximidade protocolos de ensaio ligadura
- imunocitoquímica
- Incubar com 1: 500 diluído fluorescente acoplado-corante verde anti-ratinho e de anticorpos acoplados à corantes fluorescentes vermelhas anti-coelho secundário à TA durante 1 h. Evite luz a partir desta etapa em diante.
- contracoloração núcleos com 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluído 1: 5000 em PBS à temperatura ambiente durante 10 min.
- Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara.
- Retirar as câmaras da lâmina de vidro e seco. Monte com 250 μ, médio por lâmina de montagem.
- ensaio de ligação de proximidade
- Prepare proximidade sondas de ensaio de ligação. Misture e diluir sondas de ensaio ligadura dois proximidade (anticorpos secundários anti-ratinho e anti-coelho ligados com diferentes oligonucleotídeos que pode ligar tháspera a adição de dois outros oligonucleótidos em solução de ligação) ambos 1: 5 em 0,1% de Triton X-100 e 5% de NGS em PBS, com um volume total de 320 ul de uma lâmina de 8 câmaras (aproximadamente 40 ul por cm 2) . Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
- Retirar as câmaras da lâmina de vidro e adicionar as sondas diluído. Incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 1 h.
- Preparar a solução de ligação. Misture 8 ul ligase, 64 ul da ligadura 5 x e 248 mL de H 2 O.
- Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 5 minutos em 1x tampão de lavagem A (fornecido com o kit).
- Adicionar a solução de ligação, e incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 30 min.
- Preparar a solução de amplificação. Misture 4 ul polimerase, da ampliação de 5x 64 ul e 252 ul H 2 O. Evite luz a partir desta etapa em diante.
- Toque off líquido a partir do slide, e lave 2 x 2 min em 1x tampão de lavagem A.
- Adicione o amplification solução e incubar numa incubadora de humidade escuro a 37 ° C durante 100 min.
- Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 10 minutos em 1x tampão de lavagem B (fornecido com o kit). Lavar durante 1 min em 0.01x Wash Buffer B.
- Seque o slide e montagem com 250 mL de um meio de montagem comercial (com DAPI) por slide.
- imunocitoquímica
- Examine sinais fluorescentes sob um microscópio utilizando uma lente ocular 10X e 20X lente objetiva. Aquisição de imagens por uma câmera CCD.
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Representative Results
A Figura 1 demonstra que NF90 e RBM3 são ambos proteínas nucleares e apenas uma pequena fracção está presente no citoplasma. Notavelmente, existem três diferentes bandas coradas positivas para RBM3. O menor logo abaixo de 20 kDa reflecte o tamanho correcto de RBM3 (o peso molecular previsto de 17 kDa é RBM3). A origem das duas outras bandas continua a ser investigado. experiências de co-imunoprecipitação com RBM3 como a proteína isca revelou que as interações NF90-RBM3 são predominantemente presente no núcleo e uma minoria no citoplasma. dados dos co-imunoprecipitação suporta a localização de cada única proteína.
Como mostrado na Figura 2A, e NF90 RBM3 estão localizados principalmente no núcleo, mas também no citoplasma in situ. Ambas as proteínas mostram a co-localização perfeita em ambos os compartimentos. ensaio de ligação de proximidade revelou o modelode interacções NF90-RBM3, que é muito semelhante a imunocitoquímica convencional, com a maioria das interacções no núcleo na maioria das células. Apenas uma pequena proporção de células demonstrou distribuição predominantemente citoplasmática de interações NF90-RBM3.
Tomados em conjunto, co-imunoprecipitação e de ligação de proximidade técnicas de ensaio reflectem essencialmente o mesmo padrão de distribuição de interacções proteína-proteína em compartimentos nucleares e citoplasmáticos.
Figura 1: Western Blot Análise do NF90 e RBM3 e suas interações em nuclear e citoplasmática fracções de células HEK293. Os extractos nucleares e citoplasmáticos foram carregadas para SDS-PAGE em gel em uma proporção de 1: 2 (v / v), reflectindo a mesma quantidade de células, como indicado no protocolo de extracção. Lamina e GAPDH foram utilizados como nucleare marcadores citoplasmáticos, respectivamente. Co-imunoprecipitação foi realizada com anticorpo anti-RBM3, ou IgG de coelho como controlo negativo. Os extractos nucleares e citoplasmáticos foram também incubadas com anticorpo anti-RBM3 numa proporção de 1: 2 (v / v), respectivamente. banda superior em blot NF90 indica 110 kDa isoforma longa NF110. N: extracto nuclear; C: extrato citoplasmático, IP: imunoprecipitação. marcadores de proteínas foram marcadas durante bandas positivas RBM3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imunocitoqu�ica e proximidade Ligadura Ensaio de células HEK293. (A) duas vezes coloração de células HEK293 com anticorpos anti-RBM3 (vermelho) anti-NF90 (verde) e. Arrow células show com clara co-localização citoplasmática de NF90 e RBM3. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). (B) Ensaio de Proximidade de ligação com os anticorpos anti-RBM3 em células HEK293 anti-NF90 e. manchas fluorescentes vermelhas indicam interações NF90-RBM3. As setas mostram interações NF90-RBM3 em citoplasma. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). controle negativo 1 (NC 1): ambos os anticorpos primários foram omitidos. controle negativo 2 (NC 2): anticorpo primário RBM3 única. controle negativo 3 (NC 3): somente NF90 único anticorpo primário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há vários benefícios, bem como deficiências para ambos os métodos. Como uma técnica relativamente nova, uma vantagem óbvia de ensaio de proximidade de ligação é a viabilidade para elucidar as interacções proteína-proteína ao nível de uma única célula em vez de um lote de células heterogéneas. Imagens com alta magnitude e resolução (por exemplo, através de microscópio confocal) prever a possibilidade de quantificação contando manchas fluorescentes individuais. Em contraste, a combinação convencional de técnica de co-imunoprecipitação com Western blot pode apenas semi-quantificar as bandas de proteína, principalmente porque um controlo de carga adequado é difícil de determinar, para as amostras IP. Além disso, quando a interacção proteína-proteína é fraco ou transitória, uma grande quantidade de material biológico, por exemplo, células ou tecidos, é necessário para a co-imunoprecipitação ou um sistema de sobre-expressam artificial com tag fundido é aplicado para melhorar a possibilidade para detectar as interacções . Alternativamente, a detecção de techniques com alta sensibilidade, tais como espectrometria de massa pode melhorar a qualidade da experiência. No entanto, no que diz respeito à quantidade de material de partida, o método de ensaio de ligação de proximidade tem vantagens claras. Apenas algumas células são necessários, desde que uma alta qualidade de anticorpos é dada. Além disso, em amostras de tecido, na visualização in situ de interacções proteína-proteína em diferentes estruturas de tecidos e tipos de células pode ser conseguida por ensaio de proximidade de ligação, num padrão semelhante à imunohistoquímica normal. Em contraste, a co-imunoprecipitação é, pela sua natureza, se não para exibir a distribuição espacial das interacções proteína-proteína.
Em células com núcleos grandes, mas pequenos compartimentos citoplasmáticos, o método de ensaio de ligação de proximidade é limitada na análise de distribuições nucleares-citoplasmática e co-imunoprecipitação tradicional tem a sua própria superioridade. Por exemplo, em linhas de células de linfócitos T, de Jurkat, por exemplo, células, DISTRI nuclear-citoplasmáticacontri- de interacção NF90-RBM3 pela técnica de ensaio de ligação de proximidade é restrita, porque o núcleo ocupa praticamente todo o espaço dentro da célula, e é difícil identificar o limite do compartimento citoplasmático. Isto pode ser um problema comum para imunocitoquímica, em geral, quando a proporção de núcleo-citoplasma é extremamente desigual. No entanto, a co-imunoprecipitação, nesta situação não é sujeita a esta limitação.
Uma preocupação especial em relação ensaio de proximidade ligadura é se os sinais do ensaio de proximidade ligadura representam interações proteína-proteína directas ou indirectas. Ambos NF90 e RBM3 têm propriedades de ligação a ARN e a sua interacção é dependente de ARN, como descrito no nosso estudo anterior 7. Assim, o pré-tratamento de lisados de células com RNase dissolve interacção entre NF90 e RBM3 e nada é detectável pelo método de co-imunoprecipitação 7. No entanto, o sinal de ensaio de proximidade de ligação não é afectadamesmo que uma interacção proteína-proteína dependente de ARN perde as espécies de ARN, uma vez que é gerado quando a distância entre as duas proteínas é menos do que 40 nm, o que é geralmente considerado como uma interacção directa. Esta propriedade do ensaio de ligação de proximidade pode superar os problemas técnicos de co-imunoprecipitação, tal como libertação de RNase no ligado celular que pode suprimir as interacções que requerem mediação ARN. No entanto, por outro lado, o método de ensaio de proximidade de ligação pode também gerar sinais de falsos positivos, se a interacção proteína-proteína dependente de ARN, na verdade, não existir, devido à falta de ARN específico em condições fisiológicas.
Outra questão que merece atenção especial é a especificidade dos anticorpos primários ea possibilidade de isoformas da proteína, precursores e agregados de proteínas. Observou-se por Western blot que a isoforma longa NF90, NF110, é muito menos abundante no núcleo e no citoplasma tanto em células HEK293, em comparação com NF90 (Fifigura 1). No entanto, a co-imunoprecipitação desvendados uma afinidade de ligação mais elevada de NF110 para RBM3 particularmente no núcleo. Três bandas principais foram descobertos em borrões RBM3 no núcleo, mas apenas a banda RBM3 normal de 20 kDa foi observada principalmente no citoplasma. Se os outros dois 50 kDa e 100 kDa reflectir isoformas RBM3, precursores, agregados de proteínas com RBM3 ligado ou deveram-se a fundo inespecífica continuam a ser elucidado. Em vez disso, uma vez que o ensaio de proximidade de ligação é baseado em imunocoloração, o ensaio de proximidade de ligação não pode distinguir a diferença entre os diferentes isoformas da proteína, precursores, agregados ou coloração inespecífica, enquanto co-imunoprecipitação pode fornecer mais informações sobre anticorpos de especificidade ou proteína isoformas e precursores do que o ensaio de ligação de proximidade na investigação de interações proteína-proteína. Em relação RBM3, quando se considera todas as faixas de três RBM3 observados no núcleo, o resultado Western blot é consistente com um núcleos predominantes localizatina de RBM3 observado por imunocoloração.
Em conclusão, as técnicas de ensaio de co-imunoprecipitação e de ligação de proximidade tem vantagens intrínsecas e as restrições. Em muitos casos, eles produzem resultados consistentes mas é benéfico usar as duas técnicas quando se investiga sistematicamente determinada interacção proteína-proteína. No entanto, em casos especiais, ou com um determinado fim, pode-se mostrar a superioridade do que o outro. Recentemente, ensaio de proximidade de ligação foi usada para interacções proteína-proteína de tela para desenvolver novos marcadores de prognóstico 12. interacção proteína-proteína é considerada como um biomarcador mais confiável do que uma única proteína. No futuro, o ensaio de proximidade de ligadura pode potencialmente se tornar uma maneira rápida e confiável para analisar as interações proteína-proteína como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico em clínicas, embora a identificação e caracterização desses biomarcadores ainda requer a co-immuoprecipication convencional meTHOD.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
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