Introduction
परमाणु कारक 90 (NF90) इंटरल्यूकिन -2 के बाद प्रतिलेखन और miRNA जीवजनन 1-3 के नियमन के वायरल संक्रमण के जवाब, विनियमन सहित कई कार्यों के साथ एक बहु-isoform प्रोटीन होता है। RBM3 एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, अनुवाद और miRNA जीवजनन में शामिल हैं और हाइपोथर्मिया और हाइपोक्सिया 4-6 सहित विभिन्न तनाव से प्रेरित किया जा सकता है। हाल ही में, हम एक प्रोटीन जटिल 7 में NF90 और RBM3 पाया। NF90 और RBM3 की बातचीत सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया 7 में प्रोटीन काइनेज शाही सेना की तरह जालिका काइनेज (पर्क) गतिविधि मिलाना अनिवार्य है। दोनों NF90 और RBM3 नाभिक लेकिन कोशिका द्रव्य में NF90 के एक छोटे से अनुपात और RBM3 शटल में मुख्य रूप से स्थित है और विशिष्ट कार्यों के लिए एक दूसरे के लिए वहाँ बाँध, जैसे पर्क गतिविधि को विनियमित करने के लिए कर रहे हैं। इसलिए, यह subcellular डिब्बे में NF90-RBM3 बातचीत का वितरण कल्पना करने के लिए है, जो संकेत हो सकता महत्वपूर्ण हैसंबंधित डिब्बे में उनके विभिन्न भूमिकाओं।
दशकों पहले, खमीर दो संकर (Y2H) दो प्रोटीन 8 के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, जुड़े प्रोटीन का कृत्रिम निर्माण की वजह से, झूठी सकारात्मक परिणाम इस विधि के आवेदन प्रतिबंधित कर दिया है। एक लंबे समय के लिए, सह immunoprecipitation, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से endogeneous की स्थिति 9 में मुख्य तकनीक था। सह immunoprecipitated प्रोटीन जटिल विश्लेषण करने के लिए, पश्चिमी धब्बा जबकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री जब सुपर संवेदनशीलता और सटीकता वांछित हैं प्रयोग किया जाता है, सबसे सुविधाजनक तकनीक है। हाल के वर्षों में, निकटता बंधाव परख सीटू 10,11 में दोनों कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए एक उपन्यास विधि के रूप में विकसित किया गया है।
यहाँ, हम सबसे लोकप्रिय सह immunoprecipitation विधि और NF9 पर कब्जा करने में अपेक्षाकृत उपन्यास निकटता बंधाव परख विधि की तुलनाsubcellular भागों में 0-RBM3 बातचीत। हम यह भी फायदे और दोनों तकनीकों की सीमाओं पर चर्चा की।
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Protocol
1. सह immunoprecipitation
- बीज में एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं पर HEK293 कोशिकाओं 2 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और साथ पूरक 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep) ।
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
- ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं।
- वाणिज्यिक परमाणु और cytoplasmic निकासी अभिकर्मकों का उपयोग परमाणु और cytoplasmic अंशों तैयार करें। कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के अनुदेश का पालन करें।
- एक सह immunoprecipitation प्रयोग (एक 6 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं से लगभग 90% confluency) के लिए 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं का प्रयोग करें। उच्चतम गति से 300 μl ठंड cytoplasmic निकासी समाधान (सीईआर मैं) और 15 सेकंड के लिए भंवर जोड़ें।
- बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। ऊष्मायन, vorte के दौरान5 हर 10 मिनट के लिए एक्स।
- 5 सेकंड के लिए 16.5 μl ठंड cytoplasmic निष्कर्षण समाधान द्वितीय (सीईआर द्वितीय), भंवर जोड़ें और बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर 5 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
- एक नया पूर्व ठंडा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (cytoplasmic निकालने) स्थानांतरण, और जब तक इस्तेमाल किया बर्फ पर रहते हैं।
- ऊपर pipetting द्वारा हर बार और पांच बार नीचे 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ अघुलनशील छर्रों (युक्त नाभिक) तीन बार धोएं। धोने के बाद पीबीएस निकालें।
- 15 सेकंड के लिए 150 μl ठंड परमाणु निष्कर्षण समाधान (एनईआर), भंवर जोड़ें और बर्फ पर 1 घंटा सेते हैं। ऊष्मायन के दौरान, 15 सेकंड और पिपेट एक 200 μl टिप के साथ 10 बार हर 10 मिनट के लिए भंवर।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर 15 एस के लिए भंवर और अपकेंद्रित्र।
- एक नया पूर्व ठंडा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (परमाणु निकालने) स्थानांतरण, उपयोग करें जब तक बर्फ पर रहते हैं।
- प्रत्येक सामग्री के रूप में परमाणु और cytoplasmic अर्क की मात्रा का 10% बाहर ले जाओ।
- ए1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए शेष अर्क को ठंड पीबीएस डीडी। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
नोट: जब प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग पूर्व समाशोधन आवश्यक नहीं है। हालांकि, अगर पृष्ठभूमि अधिक है, 40 μl प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोती (50% घोल) और 1 मिलीलीटर एक रोटेटर पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इस कदम से पतला lysate incubating द्वारा पूर्व समाशोधन प्रदर्शन करते हैं। अलग सतह पर तैरनेवाला (पूर्व मंजूरी दे दी lysate) चुंबकीय रैक के साथ मोतियों से। मोती त्यागें। - प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ जोड़ी के प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, 4 माइक्रोग्राम खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी RBM3 एंटीबॉडी या खरगोश आईजीजी (नकारात्मक नियंत्रण) 200 μl पीबीएस में प्लस बीच 20 बफर के साथ प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोती (50% घोल) μl 40 सेते (PBST 0.02% बीच 20) एक रोटेटर पर 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर।
- अलग एंटीबॉडी मिलकर मोती और सतह पर तैरनेवाला एक चुंबकीय रैक के साथ, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 200 μl PBST (0.02%) के साथ एक बार मोती धो लें।
- 1 जोड़ेमिलीलीटर मोती lysates (या यदि आवश्यक हो, तो पूर्व मंजूरी दे दी lysates) पतला, और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर सेते हैं।
- अगले दिन, एक चुंबकीय रैक द्वारा माला और सतह पर तैरनेवाला अलग, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 20 आरपीएम की एक निश्चित गति के साथ एक रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.5 मिलीलीटर PBST (0.02%) के साथ 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
- 40 μl नमूना बफर (1x वाणिज्यिक नमूना बफर और 50 मिमी 1,4-dithiothreitol (डीटीटी)) जोड़कर मोतियों से प्रोटीन Elute। 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी। स्पिन और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण तरल पदार्थ।
- 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर और गर्मी: (1x वाणिज्यिक नमूना बफर और 50 मिमी डीटीटी अंतिम एकाग्रता) नमूना बफर में इनपुट lysates पतला। लोड आदानों और एक मिल में बना हुआ 4-12% बीआईएस Tris जेल के लिए पिछले कदम से immunoprecipitated प्रोटीन। प्रत्येक अच्छी तरह से की लोडिंग मात्रा 20 μl अधिक नहीं होनी चाहिए। 35 मिनट के लिए बर्फ पर 1x वाणिज्यिक चल बफर में वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना।
नोट: लोड परमाणु और cytoplasmic निकालने2 (वी / वी) है, जो कोशिकाओं का एक ही प्रारंभिक राशि को दर्शाता है: 1 के अनुपात में है। - PVDF झिल्ली के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 30 वी में 1x वाणिज्यिक स्थानांतरण बफर में स्थानांतरण प्रोटीन।
- 5% के साथ ब्लॉक झिल्ली एक प्रकार के बरतन पर 40 मिनट के लिए आरटी पर PBST में दूध (0.1% बीच 20) स्किम्ड।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर PBST (0.1%) में: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली (1,000 दोनों 1 में पतला) सेते हैं।
- एक प्रकार के बरतन पर आरटी पर PBST (0.1%) के साथ 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
- हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ झिल्ली सेते विरोधी माउस या विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित (दोनों 1 में पतला: 5,000) 1 घंटे के लिए आरटी पर PBST (0.1%) में।
- एक प्रकार के बरतन पर आरटी पर PBST (0.1%) के साथ 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
- 0.2 मिलीग्राम बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) सब्सट्रेट प्रति सेमी 2 झिल्ली मिश्रण का प्रयोग करें, 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। लाल बत्ती को छोड़कर इस कदम के बाद से सभी प्रकाश से बचें।
- तरल त्यागें और एक फिल्म कैसेट में एक एक्स-रे फिल्म को बेनकाब। एक स्वत: फिल्म पीआर का उपयोग कर फिल्म का विकासocessing मशीन।
2. Immunocytochemistry और निकटता Ligation परख
- बीज 0.4 मिलीलीटर DMEM में एक 8-कक्ष पाली डी lysine लेपित स्लाइड में चैम्बर प्रति 1.5 x 10 4 कोशिकाओं पर HEK293 कोशिकाओं 10% FBS और 100 यू / एमएल कलम strep के साथ पूरक।
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
- महाप्राण मध्यम, और आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक।
- महाप्राण पीएफए, और चैम्बर प्रति 0.5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोने 3 एक्स 10 मिनट।
- Permeabilize और 0.5% ट्राइटन पीबीएस में आरटी पर 1 घंटे के लिए एक्स 100 और 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS) के साथ ब्लॉक कोशिकाओं।
- प्राथमिक रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर 0.1% ट्राइटन X-100 और पीबीएस में 5% NGS में एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। डबल-धुंधला के लिए पीबीएस में 100: पतला माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी NF90 और खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी RBM3 एंटीबॉडी 1। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, स्वतंत्र रूप से दो प्राथमिक एंटीबॉडी की या तो छोड़ देते हैं, और एक तिहाई नियंत्रण में दोनों एंटीबॉडी छोड़ देते हैं।
ध्यान दें: वाणिज्यिक अवरुद्ध और गिराए अभिकर्मकों का प्रयोग न करें। - 0.5 मिलीलीटर पीबीएस चैम्बर प्रति के साथ धो 3 एक्स 10 मिनट।
- Immunocytochemistry या निकटता बंधाव परख प्रोटोकॉल के अधीन
- immunocytochemistry
- 1 घंटे के लिए 500 पतला हरी फ्लोरोसेंट डाई-युग्मित विरोधी माउस और लाल फ्लोरोसेंट डाई-युग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी आरटी पर: 1 के साथ सेते हैं। इस कदम के बाद से प्रकाश से बचें।
- 10 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में 5,000: 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) के साथ Counterstain नाभिक 1 पतला।
- 0.5 मिलीलीटर पीबीएस चैम्बर प्रति के साथ धो 3 एक्स 10 मिनट।
- गिलास स्लाइड और सूखे से कक्षों निकालें। 250 μ के साथ माउंट, बढ़ते स्लाइड प्रति मध्यम।
- निकटता बंधाव परख
- निकटता बंधाव परख जांच को तैयार है। मिक्स और दो निकटता बंधाव परख जांच (विरोधी माउस और विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी अलग ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स जो वें ligate सकते हैं के साथ संलग्न पतलाएक 8 चैम्बर स्लाइड (2 सेमी के अनुसार लगभग 40 μl के लिए पीबीएस में 5 0.1% ट्राइटन X-100 में और 5% NGS, 320 μl की कुल मात्रा के साथ): बंधाव समाधान में दो अन्य ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स) दोनों 1 के किसी न किसी अलावा । 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- कांच स्लाइड से कक्षों निकालें और पतला जांच जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नमी इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- बंधाव समाधान तैयार है। 8 ligase μl मिक्स, 64 μl 5 एक्स बंधाव शेयर और 248 μl एच 2 ओ
- स्लाइड से तरल ठोकर, और 1x धो बफर ए में 2 एक्स 5 मिनट धोने (किट के साथ प्रदान की)।
- बंधाव समाधान जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नमी इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- प्रवर्धन समाधान तैयार है। मिक्स 4 μl पोलीमर्स, 64 μl 5x प्रवर्धन शेयर और 252 μl एच 2 ओ इस कदम के बाद से प्रकाश से बचें।
- स्लाइड से तरल ठोकर, और 1x धो बफर ए में धो 2 एक्स 2 मिनट
- amp जोड़ेlification समाधान और 100 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे आर्द्रता इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- स्लाइड से तरल ठोकर, और 1x धो बफर बी में 2 एक्स 10 मिनट धोने (किट के साथ प्रदान की)। 0.01x धो बफर बी में 1 मिनट के लिए धो
- स्लाइड सूखी और स्लाइड प्रति एक वाणिज्यिक बढ़ते मध्यम (DAPI के साथ) के 250 μl के साथ माउंट।
- immunocytochemistry
- एक खुर्दबीन के एक 10X आईपीस लेंस और 20x उद्देश्य लेंस का उपयोग तहत फ्लोरोसेंट संकेतों जांच करते हैं। एक सीसीडी कैमरा द्वारा छवियों मोल।
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Representative Results
चित्रा 1 दर्शाता है कि NF90 और RBM3 दोनों परमाणु प्रोटीन होते हैं और केवल एक छोटा सा अंश कोशिका द्रव्य में मौजूद है। विशेष रूप से, वहाँ तीन अलग अलग RBM3 के लिए सकारात्मक दाग बैंड हैं। सिर्फ 20 केडीए नीचे छोटी से छोटी RBM3 का सही आकार को दर्शाता है (RBM3 की भविष्यवाणी की आणविक वजन 17 केडीए है)। दो अन्य बैंड के मूल जांच की जानी बाकी है। चारा प्रोटीन के रूप में RBM3 साथ सह immunoprecipitation प्रयोगों से पता चला है कि NF90-RBM3 बातचीत नाभिक और कोशिका द्रव्य में एक अल्पसंख्यक में मुख्य रूप से मौजूद हैं। सह immunoprecipitation डेटा प्रत्येक एकल प्रोटीन के स्थानीयकरण का समर्थन करता है।
जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2A, NF90 और RBM3 मुख्य रूप से नाभिक में भी, लेकिन बगल में कोशिका द्रव्य में स्थित हैं। दोनों प्रोटीन दोनों डिब्बों में सही सह स्थानीयकरण दिखा। निकटता बंधाव परख पैटर्न का पता चलाNF90-RBM3 बातचीत, जो बहुत ही पारंपरिक immunocytochemistry के समान है, कोशिकाओं के बहुमत में नाभिक में सबसे बातचीत के साथ की। केवल कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात NF90-RBM3 बातचीत के मुख्य रूप से cytoplasmic वितरण का प्रदर्शन किया।
साथ में ले ली, सह immunoprecipitation और निकटता बंधाव परख तकनीक मूल रूप से परमाणु और cytoplasmic डिब्बों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का एक ही वितरण पैटर्न दर्शाते हैं।
चित्रा 1: NF90 और RBM3 और HEK293 कोशिकाओं के परमाणु और cytoplasmic भागों में उनकी बातचीत के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। परमाणु और cytoplasmic अर्क के अनुपात में एसडीएस पृष्ठ जेल में भरी हुई थी 1: 2 (वी / वी), के रूप में निकासी प्रोटोकॉल में कहा गया कोशिकाओं का एक ही राशि को दर्शाती है। Lamin और GAPDH परमाणु के रूप में इस्तेमाल किया गयाऔर cytoplasmic मार्कर, क्रमशः। सह immunoprecipitation विरोधी RBM3 एंटीबॉडी, या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में खरगोश आईजीजी के साथ प्रदर्शन किया गया था। (V / v) क्रमश: 2: परमाणु और cytoplasmic अर्क भी 1 के अनुपात में विरोधी RBM3 एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे। NF90 धब्बा में ऊपरी बैंड 110 केडीए लंबे isoform NF110 इंगित करता है। N: परमाणु निकालने; सी: cytoplasmic निकालने, आईपी: immunoprecipitation। प्रोटीन मार्कर RBM3 सकारात्मक बैंड के लिए लेबल रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: Immunocytochemistry और HEK293 कोशिकाओं की निकटता Ligation परख। (ए) विरोधी NF90 (हरा) और विरोधी RBM3 (लाल) एंटीबॉडी के साथ HEK293 कोशिकाओं की डबल-धुंधला हो जाना। NF9 के स्पष्ट cytoplasmic सह स्थानीयकरण के साथ इस शो कोशिकाओं तीर0 और RBM3। नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained थे। (बी) के विरोधी NF90 और HEK293 कोशिकाओं में विरोधी RBM3 एंटीबॉडी के साथ निकटता बंधाव परख। लाल फ्लोरोसेंट स्पॉट NF90-RBM3 बातचीत से संकेत मिलता है। तीर कोशिका द्रव्य में NF90-RBM3 बातचीत दिखा। नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained थे। नकारात्मक नियंत्रण 1 (नेकां 1): दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़े गए थे। नकारात्मक नियंत्रण 2 (नेकां 2): RBM3 एकल प्राथमिक एंटीबॉडी ही। नकारात्मक नियंत्रण 3 (नेकां 3): NF90 एकल प्राथमिक एंटीबॉडी ही। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वहाँ कई लाभ के साथ ही दोनों तरीकों के लिए कमियाँ हैं। एक अपेक्षाकृत उपन्यास तकनीक के रूप में, निकटता बंधाव परख की एक स्पष्ट लाभ व्यवहार्यता एकल कोशिका स्तर के बजाय विषम कोशिकाओं का एक बैच में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को स्पष्ट करने के लिए है। उच्च परिमाण और संकल्प (confocal खुर्दबीन द्वारा जैसे) के साथ छवियों को एक फ्लोरोसेंट धब्बे की गणना के द्वारा मात्रा का ठहराव के लिए संभावना प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, पश्चिमी धब्बा साथ सह immunoprecipitation तकनीक के पारंपरिक संयोजन केवल अर्द्ध यों कर सकते हैं प्रोटीन बैंड, जिसका मुख्य कारण एक उपयुक्त लोडिंग नियंत्रण आईपी नमूने के लिए तय कर पाना मुश्किल है। इसके अलावा, जब प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कमजोर या क्षणिक, जैविक सामग्री, जैसे, कोशिकाओं या ऊतकों, सह immunoprecipitation या इनकार टैग के साथ एक कृत्रिम overexpressing प्रणाली के लिए आवश्यक है की एक बड़ी राशि बातचीत का पता लगाने का मौका बढ़ाने के लिए लागू किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, का पता लगाने टीऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में उच्च संवेदनशीलता के साथ echniques प्रयोग की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं। हालांकि, शुरू सामग्री की राशि के संबंध में निकटता बंधाव परख विधि स्पष्ट फायदे हैं। केवल कुछ कोशिकाओं के लिए आवश्यक हैं, बशर्ते एंटीबॉडी के एक उच्च गुणवत्ता के लिए दिया जाता है। इसके अलावा, ऊतकों के नमूनों में, अलग-अलग ऊतक संरचनाओं और प्रकार की कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के सीटू दृश्य में निकटता बंधाव परख करके, सामान्य immunohistochemistry के रूप में एक समान पैटर्न में प्राप्त किया जा सकता है। इसके विपरीत, सह immunoprecipitation अपनी प्रकृति प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के स्थानिक वितरण प्रदर्शित करने के लिए अनुपयुक्त के द्वारा होता है।
बड़े नाभिक लेकिन छोटे cytoplasmic डिब्बों के साथ कोशिकाओं में, निकटता बंधाव परख विधि परमाणु cytoplasmic वितरण और पारंपरिक सह immunoprecipitation का विश्लेषण करने में सीमित कर अपनी स्वयं की श्रेष्ठता है। उदाहरण के लिए, टी लिम्फोसाइट सेल लाइनों में, जैसे Jurkat कोशिकाओं, परमाणु cytoplasmic वितरितनिकटता बंधाव परख तकनीक द्वारा NF90-RBM3 बातचीत के butions प्रतिबंधित है, क्योंकि नाभिक सेल के अंदर लगभग पूरे अंतरिक्ष में रह रहे हैं, और यह cytoplasmic डिब्बे की सीमा की पहचान करना मुश्किल है। यह सामान्य में immunocytochemistry के लिए एक आम समस्या हो सकती है जब नाभिक-कोशिका द्रव्य अनुपात बेहद असंतुलित है। हालांकि, इस स्थिति में सह immunoprecipitation इस सीमा के अधीन नहीं है।
एक विशेष निकटता बंधाव परख के बारे में चिंता निकटता बंधाव परख से संकेत प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं कि क्या है। दोनों NF90 और RBM3 आरएनए बाध्यकारी गुण है और के रूप में हमारे पिछले अध्ययन 7 में रिपोर्ट उनकी बातचीत, शाही सेना पर निर्भर है। इस प्रकार, RNase के साथ सेल lysates के pretreatment घुल NF90 और RBM3 और कुछ भी नहीं के बीच बातचीत सह immunoprecipitation विधि 7 से detectable है। हालांकि, निकटता बंधाव परख संकेत प्रभावित नहीं हैएक शाही सेना पर निर्भर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत आरएनए प्रजातियों खो देता है, के रूप में यह उत्पन्न होता है जब दो प्रोटीन के बीच की दूरी कम से कम 40 एनएम, जो आमतौर पर एक सीधी बातचीत के रूप में माना जाता है, भले ही। निकटता बंधाव परख की यह संपत्ति इस तरह के सेल lysate में RNase जारी है कि बातचीत आरएनए मध्यस्थता की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं के रूप में सह immunoprecipitation से तकनीकी समस्याओं को दूर कर सकते हैं। हालांकि, दूसरे हाथ पर, निकटता बंधाव परख विधि भी झूठी सकारात्मक संकेतों उत्पन्न कर सकते हैं, तो आरएनए पर निर्भर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत वास्तव में शारीरिक स्थितियों में विशिष्ट आरएनए की कमी के कारण मौजूद नहीं है।
एक और मुद्दा विशेष ध्यान योग्य प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता और प्रोटीन isoforms, व्यापारियों और प्रोटीन समुच्चय की संभावना है। हम पश्चिमी धब्बा द्वारा मनाया है कि लंबे समय NF90 isoform, NF110, बहुत कम दोनों नाभिक और HEK293 कोशिकाओं में कोशिका द्रव्य में प्रचुर मात्रा में NF90 की तुलना में (Fi हैआंकड़ा 1)। हालांकि, सह immunoprecipitation NF110 के एक उच्च बंधन संबंध विशेष रूप से नाभिक में RBM3 को सुलझाया। तीन मुख्य बैंड नाभिक में RBM3 blots में खोज रहे थे, लेकिन केवल 20 केडीए सामान्य RBM3 बैंड मुख्य रूप से कोशिका द्रव्य में मनाया गया। अन्य दो 50 केडीए और 100 केडीए बैंड RBM3 isoforms, व्यापारियों, बाध्य RBM3 के साथ प्रोटीन समुच्चय को प्रतिबिंबित या unspecific पृष्ठभूमि के कारण थे कि क्या elucidated किया जा रह है। इसके बजाय, के बाद से निकटता बंधाव परख immunostaining पर आधारित है, निकटता बंधाव परख विभिन्न प्रोटीन isoforms, व्यापारियों, समुच्चय या unspecific धुंधला के बीच अंतर है, भेद नहीं कर सकते सह immunoprecipitation एंटीबॉडी विशिष्टता या प्रोटीन isoforms और से व्यापारियों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच में निकटता बंधाव परख। RBM3 के बारे में, जब सभी तीन RBM3 नाभिक में मनाया बैंड पर विचार, पश्चिमी धब्बा परिणाम एक प्रमुख नाभिक के साथ संगत है localizatiRBM3 की पर immunostaining द्वारा मनाया।
अंत में, दोनों सह immunoprecipitation और निकटता बंधाव परख तकनीक आंतरिक फायदे और प्रतिबंध है। कई मामलों में, वे लगातार परिणामों का उत्पादन लेकिन यह जब व्यवस्थित खास प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच कर दोनों तकनीकों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद है। हालांकि, विशेष मामलों में या विशेष उद्देश्य के साथ, एक दूसरे से श्रेष्ठता दिखा सकता है। हाल ही में, निकटता बंधाव परख स्क्रीन प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने के लिए इस्तेमाल किया गया है उपन्यास शकुन मार्करों 12 विकसित करने के लिए। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत एक प्रोटीन की तुलना में अधिक विश्वसनीय बायोमार्कर के रूप में माना जाता है। भविष्य में, निकटता बंधाव परख संभावित, क्लीनिक में नैदानिक और शकुन बायोमार्कर के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय तरीका बन सकता है, हालांकि पहचान और इन बायोमार्कर के लक्षण वर्णन अभी भी पारंपरिक सह immuoprecipication मेरे आवश्यकताThod।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
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- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
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- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
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- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
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