Introduction
Fattore nucleare 90 (NF90) è una proteina multi-isoforma con numerose funzioni, tra cui la risposta all'infezione virale, regolazione di interleuchina-2 post-trascrizione e regolazione dei miRNA biogenesi 1-3. RBM3 è una proteina RNA-binding, coinvolto nella traduzione e miRNA biogenesi e può essere indotta da vari fattori di stress, tra cui l'ipotermia e ipossia 4-6. Recentemente, abbiamo trovato NF90 e RBM3 in un complesso proteico 7. L'interazione di NF90 e RBM3 è essenziale per modulare l'attività della proteina chinasi RNA-like chinasi reticolo endoplasmatico (PERK) in risposta proteina spiegato 7. Sia NF90 e RBM3 si trovano prevalentemente nel nucleo, ma una piccola percentuale di NF90 e navetta RBM3 nel citoplasma e si legano lì gli uni agli altri per funzioni specifiche, ad esempio, per regolare l'attività vantaggio. Pertanto, è importante visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel compartimento subcellulare, che può indicareloro diversi ruoli nel rispettivo comparto.
Decenni fa, lievito due ibridi (Y2H) è stato sviluppato per rilevare l'interazione tra due proteine 8. Tuttavia, a causa della costruzione artificiale di proteine fuse, risultati falsi positivi hanno limitato l'applicazione di questo metodo. Per lungo tempo, co-immunoprecipitazione era la tecnica principale per analizzare le interazioni proteina-proteina, specialmente in condizioni endogene 9. Per analizzare il complesso proteico co-immunoprecipitato, Western blot è la tecnica più conveniente, mentre la spettrometria di massa è usato quando eccellente sensibilità e la precisione sono desiderati. Negli ultimi anni, saggio di prossimità legatura è stato sviluppato come un nuovo metodo per rilevare interazioni proteina-proteina in entrambe le cellule e tessuti in situ 10,11.
Qui, abbiamo confrontato il più popolare metodo di co-immunoprecipitazione e relativamente nuovo metodo di analisi di prossimità legatura a catturare NF9Interazione 0-RBM3 in frazioni subcellulari. Abbiamo anche discusso i vantaggi ei limiti di entrambe le tecniche.
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Protocol
1. Co-immunoprecipitazione
- Seed HEK293 cellule a 2 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in 2 ml modificato (DMEM) supplemento di Dulbecco dell'Aquila con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U / mL penicillina-streptomicina (Pen-Strep) .
- Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Lavare le cellule con soluzione salina fredda tampone fosfato (PBS) per tre volte. Celle di raccolta per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Preparazione delle frazioni nucleari e citoplasmatici utilizzando reagenti commerciali estrazione nucleari e citoplasmatici. Seguire le istruzioni del produttore con alcune modifiche.
- Utilizzare 3 x 10 6 cellule per un esperimento di co-immunoprecipitazione (circa il 90% di confluenza da 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Aggiungere 300 ml soluzione fredda citoplasmatica di estrazione (CER I) e vortex per 15 secondi alla massima velocità.
- Incubare per 30 minuti in ghiaccio. Durante l'incubazione, vortex per 5 s ogni 10 min.
- Aggiungere 16,5 ml di estrazione a freddo citoplasmatica soluzione II (CER II), vortex per 5 secondi e incubare per 5 minuti in ghiaccio.
- Vortex per 5 secondi e centrifugare a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante (estratto citoplasmatica) in un nuovo tubo pre-raffreddata, e tenere in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.
- Lavare pellet insolubili (nuclei contenenti) tre volte con 1 ml di PBS freddo ogni volta pipettando su e giù cinque volte. Rimuovere PBS dopo lavaggio.
- Aggiungere 150 ml soluzione di estrazione a freddo nucleare (NER), vortex per 15 secondi e incubare 1 ora su ghiaccio. Durante l'incubazione, vortex per 15 secondi e pipetta 10 volte con una punta di 200 microlitri ogni 10 min.
- Vortex per 15 s e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante (estratto nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddata, tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Estrarre il 10% del volume di estratti nucleari e citoplasmatici ciascuno come ingressi.
- UNdd PBS freddo ai rimanenti estratti ad un volume finale di 1 ml. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
NOTA: Pre-clearing non è essenziale quando si utilizzano proteine sfere magnetiche G-coniugato. Tuttavia, se lo sfondo è elevata, eseguire il pre-clearing incubando 40 microlitri di proteine perline G-coniugati magnetici (50% liquami) e 1 ml diluito lisato da questo passaggio a 4 ° C per 30 minuti su un rotatore. surnatante separato (lisato pre-cancellati) da perline con cremagliera magnetica. Eliminare le perline. - Per anticorpo primario coppia con sfere magnetiche proteine G-coniugati, incubare 40 microlitri di proteine sfere magnetiche G-coniugati (50% slurry) con anticorpi 4 mg policlonale di coniglio anti-RBM3 o IgG di coniglio (controllo negativo) in 200 ml di PBS più Tween 20 tampone (PBST, 0,02% Tween 20) a temperatura ambiente (RT) per 40 minuti su un rotatore.
- perline e surnatante separato anticorpo accoppiato con una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare le perline una volta con 200 microlitri PBST (0,02%).
- Aggiungere 1ml diluito lisati (o, se necessario, lisati pre-autorizzato) ai talloni e incubare su un rotatore a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, separare le perline e il surnatante da una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBST (0,02%) per ciascun tubo a 4 ° C su un rotatore con una velocità fissa di 20 rpm.
- Eluire proteine delle perle con l'aggiunta di tampone campione di 40 microlitri (1x tampone campione commerciale e 50 mm 1,4-ditiotreitolo (DTT)). Riscaldare a 70 ° C per 10 min. Spin giù e travaso di liquidi in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Diluire lisati input in tampone campione (concentrazione finale: tampone campione commerciale 1x e 50 mM DTT) e scaldare a 70 ° C per 10 min. ingressi di carico e proteine immunoprecipitate dal l'ultimo passo di un prefabbricato 4-12% gel bis-Tris. Il volume di carico dei pozzetti non deve superare i 20 microlitri. Eseguire l'elettroforesi in tampone esecuzione commerciale 1x in ghiaccio per 35 min.
NOTA: nucleare di carico ed estratto citoplasmaticas in un rapporto di 1: 2 (V / V), che riflette la stessa quantità iniziale di cellule. - Trasferimento proteine di membrana PVDF in tampone di trasferimento commerciale 1x a 30 V per 2 ore a 4 ° C.
- Block membrana con 5% di latte scremato in PBST (0,1% Tween 20) a temperatura ambiente per 40 minuti su un agitatore.
- Incubare a membrana con anticorpi primari (sia diluito in 1: 1.000) in PBST (0,1%) a 4 ° C durante la notte.
- Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore.
- Incubare a membrana con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo o anti-coniglio anticorpi secondari (sia diluito in 1: 5.000) in PBST (0,1%) a temperatura ambiente per 1 ora.
- Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore.
- Utilizzare 0,2 ml chemiluminescenza (ECL) miscela di substrato per cm 2 di membrana, incubare a temperatura ambiente per 5 min. Evitare di tutta la luce da questo punto in poi, tranne luci rosse.
- Eliminare il liquido ed esporre ad una pellicola a raggi X in una cassetta di pellicola. Sviluppare pellicola utilizzando un pr pellicola automaticamacchina ocessing.
2. Immunocitochimica e di prossimità legatura Assay
- Seme HEK293 cellule a 1.5 x 10 4 cellule per camera in una 8-camera di poli-D-lisina scorrevole rivestito in 0,4 ml DMEM supplementato con 10% FBS e 100 U / ml Pen-Strep.
- Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Aspirare media, e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per 10 minuti a RT.
- Aspirare PFA, e lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per ogni camera.
- Permeabilize e cellule blocco con 0,5% Triton X-100 e 5% di siero normale di capra (NGS) in PBS a temperatura ambiente per 1 ora.
- Incubare con anticorpi primari in 0,1% Triton X-100 e 5% in PBS NGS su agitatore a 4 ° C durante la notte. Diluire topo monoclonale anti-NF90 anticorpi e policlonale di coniglio anti-RBM3 anticorpi 1: 100 in PBS per doppia colorazione. Per il controllo negativo, omettere indipendentemente uno dei due anticorpi primari, e omettere entrambi gli anticorpi in un terzo controllo.
NOTA: non utilizzare il blocco commerciale e reagenti diluizione. - Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera.
- Con riserva di immunocitochimica o di prossimità protocolli di analisi legatura
- immunocitochimica
- Incubare con 1: 500 diluito verde colorante fluorescente accoppiati anti-topo e fluorescenti anti-coniglio anticorpi secondari rossi dye-accoppiato a temperatura ambiente per 1 ora. Evitare la luce da questo punto in poi.
- nuclei di contrasto con 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) diluito 1: 5000 in PBS a temperatura ambiente per 10 min.
- Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera.
- Rimuovere le camere del vetrino e asciutta. Montare con 250 μ, medio per vetrino di montaggio.
- test legatura di prossimità
- Preparare prossimità sonde test legatura. Mescolare e diluire due sonde di prossimità test legatura (anti-topo e anti-coniglio anticorpi secondari allegati con diversi oligonucleotidi che possono legare °ruvida aggiunta di altre due oligonucleotidi in soluzione legatura) sia 1: 5 in 0,1% Triton X-100 e 5% NGS in PBS, con un volume totale di 320 microlitri per una slitta 8-camera (circa 40 microlitri per cm 2) . Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Rimuovere le camere dal vetrino e aggiungere le sonde diluito. Incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 1 ora.
- Preparare la soluzione legatura. Mescolare 8 ml ligasi, 64 ml 5 x legatura magazzino e 248 ml H 2 O.
- Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 5 min in 1x tampone di lavaggio A (fornito con il kit).
- Aggiungere la soluzione legatura e incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 30 min.
- Preparare la soluzione di amplificazione. Mix 4 microlitri polimerasi, 64 ml 5x amplificazione magazzino e 252 ml di H 2 O. Evitare la luce da questo punto in poi.
- Toccare il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 2 min in 1x tampone di lavaggio A.
- Aggiungere l'amplificatoresoluzione lification e incubare in un incubatore umidità buio a 37 ° C per 100 min.
- Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 10 min in 1x tampone di lavaggio B (fornito con il kit). Lavare per 1 min a 0,01X tampone di lavaggio B.
- Asciugare il vetrino e montare con 250 microlitri di un mezzo di montaggio commerciale (con DAPI) per vetrino.
- immunocitochimica
- Esaminare segnali fluorescenti sotto un microscopio utilizzando una lente oculare 10X e 20X lente obiettivo. Acquisire le immagini da una telecamera CCD.
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Representative Results
Figura 1 dimostra che NF90 e RBM3 sono entrambe le proteine nucleari e solo una piccola frazione è presente nel citoplasma. In particolare, ci sono tre diverse bande colorate positivo per RBM3. Il più piccolo appena al di sotto del 20 kDa riflette la dimensione corretta del RBM3 (il peso molecolare previsto di RBM3 è di 17 kDa). L'origine delle altre due bande resta ancora da esplorare. esperimenti di co-immunoprecipitazione con RBM3 come la proteina esca hanno rivelato che le interazioni NF90-RBM3 sono prevalentemente presenti nel nucleo e una minoranza nel citoplasma. Dati Co-immunoprecipitazione supporta la localizzazione di ogni singola proteina.
Come mostrato in Figura 2A, NF90 e RBM3 si trovano principalmente nel nucleo, ma anche nel citoplasma in situ. Entrambe le proteine mostrano perfetto co-localizzazione in entrambi i comparti. test legatura di prossimità ha rivelato il modellodi interazioni NF90-RBM3, che è molto simile a immunocitochimica convenzionale, con la maggior parte interazioni nucleo in maggioranza delle cellule. Solo una piccola percentuale di cellule hanno dimostrato di distribuzione prevalentemente citoplasmatica delle interazioni NF90-RBM3.
Nel loro insieme, co-immunoprecipitazione e la vicinanza di legatura delle tecniche di analisi riflettono sostanzialmente lo stesso modello di distribuzione di interazioni proteina-proteina in compartimenti nucleari e citoplasmatici.
Figura 1: Analisi Western Blot di NF90 e RBM3 e le loro interazioni a nucleare e citoplasmatica frazioni di cellule HEK293. estratti nucleari e citoplasmatici sono stati caricati a gel SDS-PAGE in un rapporto di 1: 2 (V / V), che riflette la stessa quantità di cellule come indicato nel protocollo di estrazione. Lamin e GAPDH sono stati utilizzati come nuclearee marcatori citoplasmatici, rispettivamente. Co-immunoprecipitazione è stata eseguita con anticorpo anti-RBM3, o IgG di coniglio come controllo negativo. estratti nucleari e citoplasmatici sono stati incubati con l'anticorpo anti-RBM3 in un rapporto di 1: 2 (v / v), rispettivamente. banda superiore a NF90 macchia indica 110 kDa lunga isoforma NF110. N: estratto nucleare; C: estratto citoplasmatica, IP: immunoprecipitazione. marcatori proteici sono stati etichettati per bande positive RBM3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunocitochimica e prossimità legatura test di HEK293 cellule. (A) a doppia colorazione delle cellule HEK293 con anti-NF90 (verde) e anti-RBM3 (rosso) anticorpi. Freccia spettacolo cellule con chiaro citoplasmatica co-localizzazione di NF90 e RBM3. I nuclei sono stati di contrasto con DAPI (blu). (B) saggio di prossimità legatura con anti-NF90 e anticorpi anti-RBM3 in cellule HEK293. macchie fluorescenti rossi indicano le interazioni NF90-RBM3. Le frecce indicano le interazioni NF90-RBM3 nel citoplasma. I nuclei sono stati di contrasto con DAPI (blu). Controllo negativo 1 (NC 1): entrambi gli anticorpi primari sono stati omessi. Controllo negativo 2 (NC 2): RBM3 unico anticorpo primario solo. Controllo negativo 3 (NC 3): solo NF90 singolo anticorpo primario. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi vantaggi e carenze per entrambi i metodi. Come relativamente nuova tecnica, un evidente vantaggio di dosaggio vicinanza legatura è la possibilità di chiarire le interazioni proteina-proteina a livello di singola cellula, invece di un lotto di cellule eterogenee. Immagini ad alta intensità e la risoluzione (ad esempio con microscopio confocale) prevedono la possibilità per la quantificazione contando macchie fluorescenti singoli. Al contrario, la combinazione convenzionale di tecnica di co-immunoprecipitazione con Western blot può solo semi-quantificare bande proteiche, soprattutto perché controllo di caricamento adatto è difficile determinare per campioni IP. Inoltre, quando l'interazione proteina-proteina è debole o transitoria, una grande quantità di materiale biologico, ad esempio, cellule o tessuti, è necessario per co-immunoprecipitazione o di un sistema sovraesprimenti artificiale con tag fusa è applicato per aumentare la possibilità di rilevare le interazioni . In alternativa, il rilevamento techniques con elevata sensibilità, come la spettrometria di massa in grado di migliorare la qualità esperimento. Tuttavia, rispetto alla quantità di materiale di partenza del metodo di dosaggio legatura prossimità ha chiari vantaggi. Solo sono richieste poche cellule, a condizione viene dato un alta qualità di anticorpi. Inoltre, in campioni di tessuto, in visualizzazione situ delle interazioni proteina-proteina in diverse strutture tissutali e tipi di cellule può essere realizzato mediante saggio di prossimità legatura, in un modello simile come immunoistochimica normale. Al contrario, co-immunoprecipitazione è per sua natura, non per visualizzare la distribuzione spaziale delle interazioni proteina-proteina.
Nelle cellule con grandi nuclei, ma piccoli scomparti citoplasmatici, il metodo di analisi di legatura di prossimità è limitata ad analizzare le distribuzioni nucleari-citoplasmatica e la tradizionale co-immunoprecipitazione ha la propria superiorità. Ad esempio, nelle linee cellulari di linfociti T, ad esempio Jurkat cellule, distri nucleare citoplasmaticabuti di interazione NF90-RBM3 dalla vicinanza tecnica di saggio legatura è limitata, in quanto il nucleo occupa quasi tutto lo spazio all'interno della cella, ed è difficile identificare il confine del compartimento citoplasmatico. Questo può essere un problema comune per immunocitochimica in generale, quando il rapporto nucleo-citoplasma è estremamente sbilanciato. Tuttavia, co-immunoprecipitazione in questa situazione non è soggetta a questa limitazione.
Una preoccupazione particolare per quanto riguarda test di prossimità legatura è se i segnali provenienti dal saggio di prossimità legatura rappresentano interazioni dirette o indirette proteina-proteina. Sia NF90 e RBM3 hanno proprietà RNA-binding e la loro interazione dipende dalla RNA, come riportato nel nostro precedente studio 7. Così, il pretrattamento dei lisati cellulari con RNase dissolve interazione tra NF90 e RBM3 e nulla è rilevabile con il metodo di co-immunoprecipitazione 7. Tuttavia, il segnale di test vicinanza legatura non è interessatoanche se una interazione proteina-proteina RNA-dipendente perde le specie di RNA, come viene generato quando la distanza tra due proteine è inferiore a 40 nm, che è generalmente considerato come una interazione diretta. La struttura del test legatura di prossimità in grado di superare i problemi tecnici da co-immunoprecipitazione, come ad esempio il rilascio RNase in lisati cellulari che possono abolire le interazioni che richiedono RNA mediazione. Tuttavia, d'altra parte, il metodo di dosaggio vicinanza legatura può anche generare segnali falsi positivi, se l'interazione proteina-proteina RNA-dipendente non esiste effettivamente a causa della mancanza di RNA specifico in condizioni fisiologiche.
Un altro problema che merita particolare attenzione è la specificità degli anticorpi primari e la possibilità di isoforme della proteina, i precursori e aggregati proteici. Abbiamo osservato da Western Blot che l'isoforma lunga NF90, NF110, è molto meno abbondante sia in nucleo e nel citoplasma in cellule HEK293 rispetto al NF90 (Fifigura 1). Tuttavia, co-immunoprecipitazione svelato una maggiore affinità di legame di NF110 per RBM3 particolare nel nucleo. Tre bande principali sono stati scoperti in macchie RBM3 nel nucleo, ma solo la banda normale RBM3 20 kDa è stata principalmente osservata nel citoplasma. Se gli altri due 50 kDa e 100 kDa band riflettono isoforme RBM3, precursori, aggregati proteici con RBM3 legato o erano dovuti al fondo aspecifica restano da chiarire. Al contrario, dal momento che il test di prossimità legatura si basa sulla immunostaining, il saggio di prossimità legatura non può distinguere la differenza tra le diverse isoforme della proteina, i precursori, aggregati o colorazione non specifica, mentre la co-immunoprecipitazione può fornire maggiori informazioni sulle specificità anticorpale o proteine isoforme e precursori rispetto al saggio di legatura di prossimità nelle indagini interazioni proteina-proteina. Per quanto riguarda RBM3, se si considera tutte le bande e tre RBM3 osservati nel nucleo, il risultato Western blot è coerente con un nucleo predominante localizatisu di RBM3 osservato da immunocolorazione.
In conclusione, entrambi co-immunoprecipitazione e la vicinanza di legatura delle tecniche di analisi hanno vantaggi intrinseci e restrizioni. In molti casi, producono risultati coerenti, ma è vantaggioso utilizzare entrambe le tecniche nell'ambito delle indagini sistematicamente certa interazione proteina-proteina. Tuttavia, in casi speciali o con particolare scopo, si potrebbe dimostrare la superiorità rispetto agli altri. Recentemente, saggio di prossimità legatura è stato utilizzato per schermo interazioni proteina-proteina di sviluppare nuovi marcatori prognostici 12. interazione proteina-proteina è considerato come biomarker più affidabile di una singola proteina. In futuro, il saggio di prossimità legatura può potenzialmente diventare un modo rapido e affidabile per analizzare le interazioni proteina-proteina come biomarcatori diagnostici e prognostici in cliniche, anche se l'identificazione e la caratterizzazione di questi biomarcatori richiede ancora il convenzionale co-me immuoprecipicationThOD.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
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