Introduction
Factor nuclear 90 (NF90) es una proteína multi-isoforma con numerosas funciones, incluyendo la respuesta a la infección viral, la regulación de la interleucina-2 post-transcripción y la regulación de los genes miARN la biogénesis 1-3. RBM3 es una proteína de unión al ARN, implicados en la traducción y miARN biogénesis y puede ser inducida por varios factores estresantes incluyendo hipotermia y la hipoxia 4-6. Recientemente, hemos encontrado NF90 y RBM3 en un complejo de proteínas 7. La interacción de NF90 y RBM3 es esencial para modular la actividad de la proteína quinasa ARN-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) en respuesta a proteínas desplegadas 7. Tanto NF90 y RBM3 se encuentran predominantemente en el núcleo, pero una pequeña proporción de NF90 y la lanzadera RBM3 en el citoplasma y se unen allí entre sí para funciones específicas, por ejemplo para regular la actividad PERK. Por lo tanto, es importante para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el compartimiento subcelular, lo que puede indicarsus diversos papeles en el compartimento respectivo.
Hace décadas, los dos híbridos de levadura (Y2H) fue desarrollado para detectar la interacción entre dos proteínas 8. Sin embargo, debido a la construcción artificial de proteínas fusionadas, resultados falsos positivos han restringido la aplicación de este método. Durante mucho tiempo, co-inmunoprecipitación fue la principal técnica para analizar interacciones proteína-proteína, especialmente en condiciones endógenas 9. Para analizar el complejo de proteínas co-inmunoprecipitó, Western blot es la técnica más conveniente, mientras que la espectrometría de masas se utiliza cuando se desean súper sensibilidad y precisión. En los últimos años, el ensayo de ligamiento por proximidad ha sido desarrollado como un nuevo método para detectar interacciones proteína-proteína en ambas células y tejidos in situ 10,11.
A continuación, se comparó el método de co-inmunoprecipitación más popular y relativamente novedoso método de ensayo de ligamiento por proximidad en la captura de NF9interacción 0-RBM3 en fracciones subcelulares. También discutimos las ventajas y limitaciones de ambas técnicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Co-inmunoprecipitación
- Seed HEK293 células a 2 x 10 5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de modificación Medium (DMEM) suplemento de Eagle de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) .
- Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) tres veces. Las células de la cosecha por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Preparación de las dosis nucleares y citoplasmáticos usando reactivos comerciales de extracción nucleares y citoplasmáticos. Siga las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones.
- Utilice 3 x 10 6 células durante un experimento de co-inmunoprecipitación (aproximadamente con un 90% de confluencia de 3 pozos de una placa de 6 pocillos). Añadir 300 l solución fría citoplasmática de extracción (CER I) y agitar durante 15 segundos a la velocidad más alta.
- Incubar durante 30 minutos en hielo. Durante la incubación, vortex para 5 s cada 10 min.
- Añadir 16,5 l fría extracción citoplasmática solución II (CER II) y agitar durante 5 segundos y se incuba durante 5 minutos en hielo.
- Vortex durante 5 segundos y se centrifuga a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante (extracto citoplásmico) en un nuevo tubo de pre-enfriado, y se mantiene en hielo hasta su uso.
- Lavar sedimentos insolubles (núcleos que contienen) tres veces con PBS frío 1 ml cada vez pipeteando arriba y abajo cinco veces. Retirar PBS después de lavado.
- Añadir 150 l solución fría de extracción nuclear (NER) y agitar durante 15 segundos y se incuba 1 hora en hielo. Durante la incubación, vórtice durante 15 segundos y pipeta de 10 veces con una punta de 200 l cada 10 min.
- Vortex durante 15 s y se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante (extracto nuclear) en un nuevo tubo de pre-enfriado, se mantiene en hielo hasta su uso.
- Sacar 10% del volumen de los extractos nucleares y citoplasmáticas cada uno como entradas.
- UNdd PBS frío a los extractos restantes a un volumen final de 1 ml. Mantener en hielo hasta su uso.
NOTA: Pre-limpieza no es esencial cuando se utilizan perlas magnéticas G-conjugado de proteína. Sin embargo, si el fondo es alto, llevar a cabo pre-compensación mediante la incubación de 40 proteínas l perlas de G-conjugados magnéticos (50% de lechada) y 1 ml diluidos lisado de esta etapa a 4 ° C durante 30 min en un rotador. sobrenadante separado (lisado pre-aclarado) a partir de perlas con rejilla magnética. Desechar las cuentas. - Para anticuerpo primario pareja con perlas magnéticas de proteína G-conjugados, incubar 40 l de proteína perlas magnéticas G-conjugados (50% de lechada) con anticuerpo 4 g de conejo policlonal anti-RBM3 o IgG de conejo (control negativo) en 200 l de PBS más tampón Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) a temperatura ambiente (RT) durante 40 min en un rotador.
- cuentas y sobrenadante separado por anticuerpos acoplados con una cremallera magnética, y desechar el sobrenadante. Se lavan las perlas una vez con 200 l de PBST (0,02%).
- Añadir 1ml diluyó lisados (o si es necesario lisados, pre-limpiado) a las perlas, y se incuba en un rotador a 4 ° C durante la noche.
- En el día siguiente, separar las perlas y el sobrenadante por una cremallera magnético, y descartar el sobrenadante. Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C en un rotador con una velocidad fija de 20 rpm.
- Eluir proteínas a partir de las perlas mediante la adición de tampón de muestra de 40 l (tampón de muestra 1x comercial y 50 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT)). Se calienta a 70 ° C durante 10 min. Girar hacia abajo y líquidos para la transferencia a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Diluir lisados de entrada en tampón de muestra (concentración final: tampón de muestra 1x comercial y DTT 50 mM) y se calienta a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga y proteínas inmunoprecipitadas a partir de la última etapa de un prefabricado de gel de bis-Tris al 4-12%. El volumen de carga de cada pocillo no debe exceder de 20 l. Realizar electroforesis en tampón de desarrollo comercial 1x en hielo durante 35 min.
NOTA: La carga nuclear y extracto citoplasmáticos en una relación de 1: 2 (V / V), que refleja la misma cantidad inicial de células. - proteínas de transferencia a una membrana de PVDF en tampón de transferencia comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C.
- Bloquear la membrana con 5% de leche desnatada en PBST (0,1% de Tween 20) a TA durante 40 min en un agitador.
- Incubar la membrana con anticuerpos primarios (tanto diluido en 1: 1000) en PBST (0,1%) a 4 ° C durante la noche.
- Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador.
- Incubar la membrana con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada anti-ratón o anti-conejo secundaria de anticuerpos (tanto diluido en 1: 5000) en PBST (0,1%) a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador.
- Utilizar 0,2 ml aumento de quimioluminiscencia (ECL) mezcla de sustrato por membrana cm 2, incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Evitar toda la luz procedente de esta etapa en adelante, excepto las luces rojas.
- Desechar el líquido y exponer a una película de rayos X en un cartucho de película. Desarrollar la película utilizando un pr automático de la películaocessing máquina.
2. La inmunocitoquímica y Proximidad ligadura Ensayo
- Seed células HEK293 en 1.5 x 10 4 células por cámara en diapositiva estucado por una 8-cámara de poli-D-lisina en 0,4 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 100 U / ml Pen-Strep.
- Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Aspirar medio, y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 10 min a RT.
- Aspirar PFA y lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
- Permeabilizar y las células de bloque con 0,5% Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra (NGS) en PBS a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Incubar con anticuerpos primarios en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS en un agitador a 4 ° C durante la noche. Diluir monoclonal de ratón anti-NF90 anticuerpo y anticuerpo policlonal de conejo anti-RBM3 1: 100 en PBS durante de doble tinción. Para el control negativo, independientemente omitir cualquiera de los dos anticuerpos primarios, y omitir ambos anticuerpos en un tercer control.
NOTA: No utilice el bloqueo comercial y reactivos de dilución. - Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
- Sin perjuicio de protocolos de ensayo de ligación de inmunocitoquímica o de proximidad
- La inmunocitoquímica
- Incubar con 1: 500 diluido fluorescente anti-ratón de colorante acoplado verde y anti-conejo anticuerpos secundarios acoplados a colorantes fluorescentes rojas a RT durante 1 hr. Evitar la luz de este paso adelante.
- núcleos contratinción con 4 ', 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluido 1: 5000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
- Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara.
- Retire las cámaras de la lámina de vidrio y seco. Montar con 250 μ, por diapositiva medio de montaje.
- ensayo de ligamiento por proximidad
- Preparar sondas de ensayo de ligadura de proximidad. Mezclar y diluir dos sondas de ensayo de proximidad ligadura (anti-ratón y anti-conejo secundaria de anticuerpos unidos con diferentes oligonucleótidos que pueden ligar los THáspera la adición de otros dos oligonucleótidos en solución de ligación) ambos 1: 5 en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS, con un volumen total de 320 l para una diapositiva 8-cámara (aproximadamente 40 l por cm 2) . Incubar a TA durante 20 min.
- Retire las cámaras de la lámina de vidrio y añadir las sondas diluidas. Incubar en una incubadora con humedad a 37 ° C durante 1 hr.
- Preparar la solución de ligación. Mezclar 8 l de ligasa, 64 l 5 x ligadura de valores y 248 l de H2O
- Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 5 min en 1x tampón de lavado A (suministrado con el kit).
- Añadir solución de ligación y se incuba en un incubador de humedad a 37 ° C durante 30 min.
- Preparar la solución de amplificación. Mezclar 4 l polimerasa, 64 l de 5x amplificación de valores y 252 l de H2O Evitar la luz de este paso adelante.
- Elimine el líquido de la diapositiva, y lavar 2 x 2 min en 1x tampón de lavado A.
- Añadir el amplificadorlification solución e incubar en una incubadora con humedad oscuridad a 37 ° C durante 100 minutos.
- Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 10 min en 1x tampón de lavado B (suministrado con el kit). Lavar durante 1 min en tampón de lavado 0,01x B.
- Secar el portaobjetos y montar con 250 l de un medio de montaje comercial (con DAPI) por portaobjetos.
- La inmunocitoquímica
- Examine las señales fluorescentes bajo el microscopio utilizando una lente ocular 10X y 20X lente objetivo. Adquirir imágenes mediante una cámara CCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 demuestra que NF90 y RBM3 son ambas proteínas nucleares y sólo una pequeña fracción está presente en el citoplasma. En particular, hay tres bandas distintas marcadas positivo para RBM3. El más pequeño justo debajo de 20 kDa refleja el tamaño correcto de RBM3 (el peso molecular predicho de RBM3 es 17 kDa). El origen de las otras dos bandas que queda por investigar. experimentos de co-inmunoprecipitación con RBM3 como la proteína cebo revelaron que las interacciones NF90-RBM3 son predominantemente presente en el núcleo y una minoría en el citoplasma. datos Co-inmunoprecipitación apoya la localización de cada proteína individual.
Como se muestra en la Figura 2A, NF90 y RBM3 se encuentran principalmente en el núcleo, sino también en el citoplasma in situ. Ambas proteínas muestran perfecta co-localización en los dos compartimentos. ensayo de ligadura de proximidad reveló el patrónde interacciones NF90-RBM3, que es muy similar a la inmunocitoquímica convencional, con la mayoría de las interacciones en el núcleo en la mayoría de las células. Sólo una pequeña proporción de las células demostró distribución predominantemente citoplasmática de interacciones NF90-RBM3.
Tomados en conjunto, co-inmunoprecipitación y la ligadura proximidad técnicas de ensayo reflejan básicamente el mismo patrón de distribución de las interacciones proteína-proteína en compartimientos nucleares y citoplásmicos.
Figura 1: Análisis de Western Blot de NF90 y RBM3 y sus interacciones en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células HEK293. Los extractos nucleares y citoplasmáticos se cargaron a gel SDS-PAGE en una proporción de 1: 2 (V / V), lo que refleja la misma cantidad de células como se indica en el protocolo de extracción. Lamin y GAPDH fueron utilizados como nucleary marcadores citoplásmicos, respectivamente. Co-inmunoprecipitación se realizó con anticuerpo anti-RBM3, o IgG de conejo como control negativo. Los extractos nucleares y citoplasmáticos también se incubaron con anticuerpo anti-RBM3 en una proporción de 1: 2 (v / v), respectivamente. banda superior en blot NF90 indica 110 kDa NF110 isoforma larga. N: extracto nuclear; C: extracto citoplasmático, IP: inmunoprecipitación. marcadores de proteínas se marcaron durante RBM3 bandas positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La inmunocitoquímica y Proximidad ligadura de ensayo de células HEK293. (A) doble tinción de las células HEK293 con anti-NF90 (verde) y anti-RBM3 (rojo) anticuerpos. Flecha muestran células con clara frente al citoplasma de co-localización de NF90 y RBM3. Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). (B) ensayo de proximidad de ligación con anticuerpos anti-RBM3 en células HEK293 anti-NF90 y. puntos fluorescentes rojas indican las interacciones NF90-RBM3. Las flechas muestran las interacciones NF90-RBM3 en el citoplasma. Los núcleos se counterstained con DAPI (azul). 1 control negativo (NC 1): ambos anticuerpos primarios fueron omitidos. Control negativo 2 (NC 2): RBM3 único anticuerpo primario. 3 Control negativo (NC 3): Sólo NF90 único anticuerpo primario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hay varios beneficios, así como las deficiencias de ambos métodos. Como una técnica relativamente nueva, una ventaja obvia de ensayo de ligamiento por proximidad es la viabilidad de dilucidar las interacciones proteína-proteína a nivel de una sola célula en lugar de un lote de células heterogéneas. Las imágenes con alta resolución y magnitud (por ejemplo, mediante microscopio confocal) proporcionan la posibilidad para la cuantificación contando puntos fluorescentes individuales. En contraste, la combinación convencional de la técnica de co-inmunoprecipitación con Western blot puede solamente semi-cuantificar bandas de proteínas, principalmente debido a un control de carga adecuado es difícil de determinar para las muestras de IP. Además, cuando la interacción proteína-proteína es débil o transitoria, una gran cantidad de material biológico, por ejemplo, células o tejidos, se requiere para la co-inmunoprecipitación o un sistema de sobreexpresión artificial con la etiqueta fusionado es aplicado para mejorar la posibilidad de detectar las interacciones . Alternativamente, la detección de techniques con alta sensibilidad como la espectrometría de masas pueden mejorar la calidad experimento. No obstante, respecto a la cantidad de material de partida el método de ensayo de ligadura de proximidad tiene claras ventajas. Sólo se requieren unas pocas células, siempre se le da una alta calidad de los anticuerpos. Además, en muestras de tejido, en la visualización in situ de las interacciones proteína-proteína en diferentes estructuras de tejidos y tipos de células se puede lograr mediante el ensayo de ligamiento por proximidad, en un patrón similar como inmunohistoquímica normal. Por el contrario, co-inmunoprecipitación es, por su naturaleza resultan inadecuadas para mostrar la distribución espacial de las interacciones proteína-proteína.
En las células con núcleos grandes, sino pequeños compartimentos citoplasmáticos, el método de ensayo de ligadura de proximidad está limitado en el análisis de las distribuciones de núcleo-citoplasma y tradicional co-inmunoprecipitación tiene su propia superioridad. Por ejemplo, en las líneas celulares de linfocitos T, por ejemplo, Jurkat células, nuclear-citoplasma distribuciones de interacción NF90-RBM3 por cercanía técnica de ensayo de ligación se limita, ya que el núcleo ocupa casi todo el espacio interior de la célula, y es difícil de identificar el límite del compartimento citoplasmático. Esto puede ser un problema común para inmunocitoquímica en general, cuando la relación núcleo-citoplasma es extremadamente desequilibrada. Sin embargo, co-inmunoprecipitación en esta situación no está sujeto a esta limitación.
Una preocupación especial con respecto ensayo de ligamiento por proximidad es si las señales del ensayo de ligamiento por proximidad representan interacciones directas o indirectas proteína-proteína. Tanto NF90 y RBM3 tienen propiedades de unión a ARN y su interacción es dependiente de ARN, como se informa en nuestro estudio anterior 7. Por lo tanto, el tratamiento previo de los lisados de células con RNasa disuelve interacción entre NF90 y RBM3 y nada es detectable por el método de co-inmunoprecipitación 7. Sin embargo, la señal de ensayo de ligamiento por proximidad no se ve afectadaincluso si una interacción proteína-proteína dependiente de ARN pierde las especies de ARN, ya que se genera cuando la distancia entre dos proteínas es inferior a 40 nm, que generalmente se considera como una interacción directa. Esta propiedad de la ensayo de ligamiento por proximidad puede superar los problemas técnicos de co-inmunoprecipitación, tales como liberación de RNasa en lisado de células que pueden suprimir las interacciones que requieren RNA mediación. Sin embargo, por otro lado, el método de ensayo de ligamiento por proximidad puede también generar señales de falsos positivos, si la interacción proteína-proteína dependiente de ARN no existe realmente debido a la falta de ARN específico en condiciones fisiológicas.
Otra cuestión que merece especial atención es la especificidad de los anticuerpos primarios y la posibilidad de isoformas de proteínas, precursores y agregados de proteínas. Hemos observado por Western blot que la isoforma larga NF90, NF110, es mucho menos abundante en ambos núcleo y el citoplasma en células HEK293, en comparación con NF90 (Figura 1). Sin embargo, co-inmunoprecipitación deshizo una mayor afinidad de unión de NF110 a RBM3 particularmente en el núcleo. Tres bandas principales fueron descubiertos en transferencias RBM3 en el núcleo, pero sólo la banda RBM3 normal de 20 kDa se observó principalmente en el citoplasma. Ya sea que los otros dos de 50 kDa y 100 kDa bandas reflejan isoformas RBM3, precursores, agregados de proteínas con RBM3 unido o se debieron a fondo no específico aún no se han dilucidado. En su lugar, ya que el ensayo de ligamiento por proximidad se basa en la inmunotinción, el ensayo de ligamiento por proximidad no puede distinguir la diferencia entre las diferentes isoformas de la proteína, precursores, agregados o tinción inespecífica, mientras que el co-inmunoprecipitación le puede dar más información sobre la especificidad o de proteínas isoformas y precursores de anticuerpos que la ensayo de ligadura de proximidad en la investigación de las interacciones proteína-proteína. En cuanto a RBM3, al considerar todas las bandas de tres RBM3 observados en el núcleo, el resultado de transferencia de Western es consistente con una núcleos predominantes localizatien de RBM3 observado por inmunotinción.
En conclusión, ambas técnicas de ensayo de co-inmunoprecipitación y la ligadura de proximidad tienen ventajas intrínsecas y restricciones. En muchos casos, producen resultados consistentes pero es beneficioso usar ambas técnicas en la investigación de sistemáticamente cierta interacción proteína-proteína. Sin embargo, en casos especiales o con un fin determinado, se podría demostrar la superioridad que el otro. Recientemente, el ensayo de ligamiento por proximidad se ha utilizado para la pantalla interacciones proteína-proteína para desarrollar nuevos marcadores de pronóstico 12. la interacción proteína-proteína se considera como un biomarcador más fiable que una sola proteína. En el futuro, el ensayo de ligadura de proximidad puede potencialmente convertirse en una forma rápida y fiable para analizar las interacciones proteína-proteína como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en las clínicas, aunque la identificación y caracterización de estos biomarcadores todavía requiere la co-immuoprecipication convencional míDTO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4,500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1,000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1,000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1,000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5,000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5,000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
