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Neuroscience

चूहा आँखों में मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के ट्रांस-scleral रेटिना प्रत्यारोपण के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल का विकास

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55220
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, *1, *1
1Neural Stem Cell Institute
* These authors contributed equally

Summary

उप रेटिना इंजेक्शन व्यापक रूप से उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के लिए स्टेम सेल प्रतिस्थापन थेरेपी के नैदानिक अध्ययन में लागू किया गया है. इस दृश्य लेख में, हम एक कम जोखिम भरा, प्रतिलिपि और ठीक ट्रांस-scleral दृष्टिकोण के माध्यम से संशोधित उप रेटिना इंजेक्शन तकनीक का वर्णन करने के लिए चूहे की आंखों में कोशिकाओं उद्धार ।

Abstract

ऐसे उंर से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के रूप में अपक्षयी रेटिना रोगों (AMD) दुनिया भर में अपरिवर्तनीय दृष्टि हानि का प्रमुख कारण हैं । AMD रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं है, जो कार्यात्मकता कोशिकाओं का समर्थन और तंत्रिका रेटिना के आसपास लपेटन शारीरिक के एक monolayer रहे हैं के अध की विशेषता है. गैर के लिए वर्तमान औषधीय उपचार-neovascular amd (सूखी amd) केवल नीचे रोग प्रगति धीमी लेकिन दृष्टि बहाल नहीं कर सकते, महसूस उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन । स्वस्थ कोशिकाओं के साथ अपक्षयी RPE कोशिकाओं की जगह भविष्य में शुष्क AMD के इलाज के लिए वादा रखती है । स्टेम सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा AMD के लिए के व्यापक नैदानिक अध्ययन स्टेम सेल के पशु मॉडल के रेटिना अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण शामिल है, जिसमें उप रेटिना इंजेक्शन तकनीक लागू किया जाता है । दृष्टिकोण सबसे अक्सर इन नैदानिक पशु अध्ययन में इस्तेमाल किया ट्रांस scleral मार्ग है, जो मुश्किल सुई अंत के प्रत्यक्ष दृश्य की कमी से बना है और अक्सर रेटिना क्षति में परिणाम कर सकते है के माध्यम से है । अवलेह के माध्यम से एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सुई अंत स्थिति के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह अधिक आंख के ऊतकों के रूप में परेशान कर रहे हैं शल्य चिकित्सा आघात के एक उच्च जोखिम वहन करती है । हम एक कम जोखिम भरा और प्रतिलिपि संशोधित ट्रांस-scleral इंजेक्शन विधि है कि परिभाषित सुई कोण और गहराई का उपयोग करता है सफलतापूर्वक और लगातार चूहे रेटिना अंतरिक्ष में RPE कोशिकाओं को देने और अत्यधिक रेटिना क्षति से बचने के लिए विकसित किया है । इस तरीके से वितरित की कोशिकाओं को पहले से कम 2 महीने के लिए सर्जन (आरसी) चूहे के रॉयल कॉलेज में प्रभावोत्पादक होने का प्रदर्शन किया गया है । इस तकनीक का इस्तेमाल न केवल कोशिका प्रत्यारोपण के लिए बल्कि छोटे अणुओं या जीन उपचारों के वितरण के लिए भी किया जा सकता है ।

Introduction

मानव रेटिना एक प्रकाश संवेदी ऊतक के रूप में आंख के कार्यों के पीछे स्थित है और दृष्टि धारणा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । रेटिना कोशिका रोग या कोशिका मृत्यु इसलिए दृष्टि समस्याओं या स्थायी अंधापन का कारण बनता है. पुनर्जनन या रेटिना के विभिन्न परतों में कोशिकाओं की शिथिलता को शामिल विकारों अपक्षयी रेटिना रोगों के रूप में जाना जाता है, जो बीच में AMD सबसे आम प्रकार है और विकसित देशों में बुजुर्ग में अपरिवर्तनीय अंधापन का प्रमुख कारण है 1,2. AMD के रोग प्रक्रिया RPE परत और अंतर्निहित Bruch की झिल्ली के बीच drusen "संचय" के साथ जुड़ा हुआ है, जो बारी में photoreceptor शरीर क्रिया विज्ञान की RPE समर्थन, तंत्रिका रेटिना शोष और दृष्टि हानि के लिए अग्रणी3, 4,5. इस प्रकार अब तक, वहां उंनत सूखी (गैर neovascular) AMD के लिए कोई इलाज नहीं है । reअपक्षय चिकित्सा में एक नए प्रतिमान के रूप में स्टेम सेल थेरेपी के उद्भव स्टेम सेल के साथ बेकार या मृत RPE कोशिकाओं की जगह की आशा लाता है स्वस्थ कोशिकाओं व्युत्पंन । दरअसल, स्टेम सेल के प्रत्यारोपण के व्यापक नैदानिक अध्ययन (जैसे, मानव भ्रूण स्टेम सेल)-RPE-अपक्षयी पशु मॉडल में व्युत्पंन RPE कोशिकाओं प्रदर्शन किया गया है6,7, जिनमें से कुछ के लिए प्रगति की है नैदानिक परीक्षण8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov) । हाल ही में, मानव RPE परत में निवासी स्टेम सेल के एक वैकल्पिक स्रोत, मानव RPE स्टेम सेल (hRPESCs), हमारी प्रयोगशाला द्वारा की पहचान की थी और वर्तमान में hRPESC व्युत्पंन के नैदानिक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा रहा है-RPE सेल (hRPESC-RPE) AMD के लिए प्रत्यारोपण थेरेपी 10 , 11 , 12 , 13.

रेटिना इंजेक्शन तकनीक हमारे समूह सहित कई समूहों द्वारा उपर्युक्त नैदानिक अध्ययन में लागू किया जाता है । वहां दो जानवरों में रेटिना इंजेक्शन के लिए सामांय दृष्टिकोण हैं: ट्रांस vitreal और ट्रांस scleral । ट्रांस-vitreal दृष्टिकोण सर्जन के लाभ के लिए सीधे सुई अंत निरीक्षण के रूप में यह पूर्वकाल आंख में प्रवेश कर रहा है, पूरे vitreal लेंस से सटे गुहा पार, और आंख में वापस रेटिना में प्रवेश के लिए उप रेटिना तक पहुंचने के लिए रिक्ति14,15,16. हालांकि, यह दो स्थानों में रेटिना बाधित की आवश्यकता है (पूर्वकाल और पीछे), लेंस हानिकारक का खतरा वहन करती है, और अवलेह में कोशिकाओं की backflow में परिणाम कर सकते है जब सुई मुकर जाता है । इसके विपरीत, ट्रांस श्वेतपटल दृष्टिकोण, सिद्धांत रूप में, रेटिना और अवलेह की भागीदारी से बचा जाता है, और backflow आंख से बाहर निकालता है । pigmented कुतर में, सर्जन शुरू में श्वेतपटल के प्रवेश निरीक्षण कर सकते हैं, लेकिन pigmented धमनियां में पारित होने के बाद, सुई अंत नहीं दिख रहा है । प्रत्यक्ष अवलोकन के बिना, रेटिना का उल्लंघन आम है और रेटिना विच्छेदन और कोशिकाओं और/अवलेह में या रक्त की डिलीवरी में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, क्योंकि आंख की सतह घुमावदार है, यह पता करने के लिए बहुत मुश्किल है जो सुई कोण और गहराई ट्रांस scleral इंजेक्शन के लिए सबसे प्रभावी रहे हैं ।

इस visualized आलेख में, हम एक ट्रांस-scleral उप रेटिना इंजेक्शन विधि ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), जो इंजेक्शन साइट की एक विस्तृत परीक्षा की अनुमति देता है के साथ पोस्ट सर्जिकल मूल्यांकन के उपयोग द्वारा सूचित परिचय । हमारे ट्रांस-scleral इंजेक्शन तकनीक निर्धारित स्थानों, कोणों का इस्तेमाल करता है, और इंजेक्शन सुई के लिए गहराई बहुत कम शल्य चिकित्सा आघात और उच्च विश्वसनीयता का उत्पादन करने के लिए । यहां, हम विशेष रूप से hRPESC-RPE कोशिकाओं के इंजेक्शन आरसी चूहे, मानव AMD के एक पूर्व नैदानिक मॉडल के उपरेटिना अंतरिक्ष में प्रदर्शित करता है । इस इंजेक्शन विधि के साथ, हम सफलतापूर्वक और लगातार एक बहुत ही उच्च सफलता दर के साथ आरसी चूहे आंखों के उपरेटिना अंतरिक्ष में hRPESC-RPE कोशिकाओं को जंम दिया । कोशिकाओं के इंजेक्शन पहले आरसी photoreceptors के संरक्षण में परिणाम करने के लिए पाया गया था इंजेक्शन13के बाद कम 2 महीने. इस प्रक्रिया को विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है और सीखना आसान है । यह दो लोगों को (एक सर्जन और एक सहायक) की आवश्यकता है इंजेक्शन और प्रत्येक जानवर के लिए इंजेक्शन का औसत समय प्रदर्शन से कम 5 मिनट है । निर्धारित कोण और इंजेक्शन सुई के लिए गहराई यह प्रयोगशालाओं, जहां अक्टूबर उपलब्ध नहीं है के लिए संभव बनाने के लिए सफल उपरेटिना इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए । यह अत्यधिक प्रतिलिपि रेटिना का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है और न केवल सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी दवा वितरण और जीन चिकित्सा के लिए.

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Protocol

सभी पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं Albany में ंयूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. पूर्व इंजेक्शन तैयारी

  1. hRPESC-RPE सेल के निलंबन की तैयारी
    नोट: सभी निंनलिखित कदम बाँझ ऊतक संस्कृति हूड और परिचित बुनियादी बाँझ तकनीक के साथ में प्रदर्शन कर रहे है की आवश्यकता है ।
    1. मानव दाता आंखों से प्राथमिक hRPE कोशिकाओं को अलग 50-90 साल और 24 में संस्कृति कोशिकाओं-अच्छी तरह से प्लेटें12। Cryopreserve 1, गल पर कोशिकाओं के रूप में जरूरत है और संस्कृति 4-5 सप्ताह के लिए 2 (P2) कोशिकाओं (चित्र 1a) इंजेक्शन के लिए.
    2. संस्कृति मध्यम12 निकालें और धीरे कुल्ला कुओं के साथ दो बार ५०० µ एल पूर्व-गरम 1x Dulbecco है फॉस्फेट कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना खारा बफर (1x DPBS-CMF) एक १,००० DPBS l CMF का उपयोग कर कुओं में 1x µ जोड़कर और एक निर्वात का उपयोग कर इसे हटाने ।
    3. Add ३०० µ l trypsin/DNAse प्रत्येक वेल. trypsin/DNAse में hRPESC-RPE कोशिकाओं (4 कू DNAse की 1 मिलीलीटर प्रति ०.२५% trypsin-EDTA) 4 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं अलग ।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जाँच करें अगर वे गोल किया है देखने के लिए. एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए trypsin/DNase में कोशिकाओं की मशीन जारी रखें यदि वे अभी तक गोल नहीं किया है ।
    5. एक बार कोशिकाओं को गोल कर रहे हैं, एक १,००० µ एल पिपेट का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं को triturate और trypsin/DNase युक्त एक 15-एमएल शंकु ट्यूब में पूर्व के बराबर मात्रा के साथ गर्म संस्कृति मध्यम, निष्क्रिय करने के लिए trypsin/DNase ।
    6. पूर्व के साथ कुल्ला कुओं-धीरे pipetting ऊपर और नीचे, विशेष रूप से अच्छी तरह के किनारों के आसपास, द्वारा गर्म 1x DPBS-CMF; फिर इन कोशिकाओं को पिछले शंकु ट्यूब में जोड़ें ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २८६ x g पर शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं गोली ।
    8. supernatant निकालें और 1 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    9. किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २८६ x जी पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली ।
    11. supernatant और reसस्पेंड कोशिकाओं बाँझ में संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) ५०,००० कोशिकाओं/µ l (में ५०,००० कोशिकाओं को देने के लिए 1 µ एल मात्रा के दौरान उपरेटिना इंजेक्शन) ।
    12. एक १.७-एमएल microcentrifuge ट्यूब में अंतिम सेल निलंबन (सीएस) स्थानांतरण और इंजेक्शन का उपयोग जब तक एक बर्फ पानी के मिश्रण में रहते हैं ।
  2. सेल इंजेक्टर की तैयारी
    1. एक बाँझ ३३ गेज इंजेक्शन सिरिंज में बेवलित सुई डालें और इंजेक्टर को इकट्ठा करने के लिए कसकर पेंच.
    2. १००% इथेनॉल 5-6 बार के साथ इंजेक्टर फ्लश ।
    3. ७०% इथेनॉल 5-6 बार के साथ इंजेक्टर फ्लश ।
    4. बीएसएस के साथ इंजेक्टर 5-6 बार फ्लश ।
    5. ६०० µm की एक स्थिति में एक बाँझ काले मार्कर कलम के साथ सुई सुई की नोक से दूर विदारक माइक्रोस्कोप (चित्र 1b) के अंतर्गत चिह्नित करें.
    6. इंजेक्शन के लिए एक micromanipulator पर इंजेक्टर प्लेस ।

2. उपरेटिना इंजेक्शन

  1. सर्जिकल क्षेत्र और पशु तैयारी
    1. एक 4-5 सप्ताह पुराने आरसी चूहा (60-100 ग्राम) वजन और anesthetize यह isoflurane वाष्प वितरण प्रणाली का उपयोग कर ।
      नोट: संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए 5% पर isoflurane प्रवाह की दर रखें । पंजे का उपयोग करके संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें, और फिर सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण रखरखाव के लिए 2-3% करने के लिए प्रवाह की दर को कम ।
    2. एक बाँझ शल्य चिकित्सा कपड़ा प्लेस, नीचे एक हीटिंग पैड के साथ, एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र स्थापित करने के लिए विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर.
    3. चूहे को सर्जिकल क्षेत्र में स्थानांतरित करें और isoflurane प्रणाली से जुड़े एक नाक शंकु में चूहे को संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए जगह है ।
    4. धुंध के साथ चूहे के शरीर को कवर । पूर्ण संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए चूहे के पाँव चुटकी ।
  2. माइक्रोस्कोप के तहत ट्रांस-scleral उप रेटिना इंजेक्शन
    1. चूहे की नजर से संचालित आंख स्नेहक की एक बूंद लागू करें ।
    2. इंजेक्शन के लिए छत का सामना करना पड़ अपनी बाईं आंख के साथ अपनी दाईं ओर पर चूहे की स्थिति, सर्जन के दाहिने हाथ और सर्जन की ओर अपनी पीठ की ओर अपने सिर.
    3. छोटी कैंची के साथ आंख को कवर कि किसी भी मूंछ ट्रिम कर दीजिए ।
    4. बाईं आंख के लौकिक पक्ष से आंख धोने की एक छोटी राशि ड्रिप और आंख कुल्ला करने के लिए एक कपास applicator के साथ नाक के किनारे पर अतिरिक्त इकट्ठा ।
    5. 1% tropicamide और २.५% phenylephrine के साथ पुतली को चौड़ा करना (हौसले से 10% phenylephrine से बना यह बाँझ ०.९% खारा में सर्जरी के दिन पर) एक के बाद एक एक बूंद लागू करने के द्वारा इंजेक्शन OCT परीक्षा के लिए ।
    6. धीरे आंख आसपास के त्वचा खींच 4-6 बार पलक खोलने के लिए इतना है कि आंख थोड़ा limbus के पीछे क्षेत्रों के लिए आसान पहुंच के लिए proptosed है ।
    7. आंख धोने की एक बूंद लागू करें और आंख नम रखें ।
    8. धीरे सीएस triturate (चरण 1.1.12 में तैयार) और १.२ µ एल सीएस के साथ इंजेक्शन लोड । अतिरिक्त ०.२ µ एल इंजेक्शन backflow के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
      नोट: हमारे मापन के आधार पर, के बारे में 5000-8000 कोशिकाओं ५०,००० कोशिकाओं के एक इंजेक्शन के साथ backflow में खो रहे हैं/µ l कि सेल नुकसान के बारे में 10-16% और ०.२ µ के एक अतिरिक्त के बराबर है l सीएस इस सेल नुकसान की भरपाई करने के लिए इंजेक्शन था.
    9. एक micromanipulator पर सीएस से भरा इंजेक्टर प्लेस (या एक सहायक इसे पकड़ है) खड़ी के रूप में RPE कोशिकाओं को निलंबन में आसानी से सिंक करते हैं ।
    10. आंख पर ०.५% proparacaine (स्थानीय सामयिक संवेदनाहारी) की एक बूंद लागू करें और एक कपास applicator के साथ अतिरिक्त निकालें ।
      नोट: इस कदम corneal पलटा दबाने और बाद में कदम के दौरान झपकी से आंख को रोकने चाहिए ।
    11. का प्रयोग करें संदंश पकड़ करने के लिए कंजाक्तिवा पीछे limbus, आंख नाक घुमाएं, और कंजाक्तिवा लिफ्ट करने के लिए एक "तंबू" ।
    12. कंजाक्तिवा में एक छोटा सा खोलने बनाने के लिए बंद "तंबू" के ऊपर कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें और अंतर्निहित श्वेतपटल बेनकाब.
    13. limbus के बगल में बचे हुए कंजाक्तिवा मार्जिन के किनारे ग्रिप करने के लिए संदंश का प्रयोग करें और आंख को नाक से घुमाएं ताकि pupillary अक्ष तालिका शीर्ष (फिगर 1C) के सापेक्ष लगभग 30 डिग्री के कोण पर हो । कंजाक्तिवा मार्जिन के निरंतर मनोरंजक सुई निवेशन के दौरान एक काउंटर बल प्रदान करने के लिए और एक इष्टतम कोण पर नजर बनाए रखने के लिए की जरूरत है ।
    14. सेल इंजेक्शन के लिए एक पायलट छेद करने के लिए, एक बाँझ बेवल के अंत की स्थिति 31 गेज इंसुलिन सुई 1200 पर-1500 µm के पीछे का सामना करना पड़ टिप के उद्घाटन के साथ limbus करने के लिए ।
    15. यह श्वेतपटल (इरादा इंजेक्शन साइट पर एक काल्पनिक विमान को स्पर्श) के ऊपर 10-15 डिग्री है कि इतना इंसुलिन सुई के कोण समायोजित करें । धीरे के बारे में ५०० µm की एक सुई गहराई करने के लिए श्वेतपटल-रंजित परिसर घुसना । pigmented चूहे में, सुई अंत pigmented धमनियां के नीचे ' गायब ' होगा । यहां इस्तेमाल किया इंसुलिन सुई के ब्रांड के लिए, बेवल करने के लिए सुई टिप से दूरी ५०० µm है ।
    16. ध्यान से इंसुलिन की सुई (खून का एक बहुत छोटा बहाव देखा जा सकता है) वापस ले लो ।
    17. यदि अत्यधिक खून बह रहा है, एक आंख भाला छेद स्पष्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है, यदि आवश्यक है । भाला आवेदन के बाद जारी रक्तस्राव को इंगित करता है एक पोत क्षतिग्रस्त हो गया है हो सकता है ।
    18. गाइड RPE सेल-पायलट छेद में सुई लोड, नीचे का सामना करना पड़ खोलने के साथ, और श्वेतपटल की स्थानीय सतह के सापेक्ष के बारे में 10-15 डिग्री के कोण पर ।
    19. धीरे के बारे में ५०० µm की गहराई करने के लिए उपरेटिना अंतरिक्ष का उपयोग करने के लिए पायलट छेद में इंजेक्टर सुई डालें । काले पेन के निशान और बिंदु के किनारे के बीच एक १०० µm मार्जिन के बारे में होना चाहिए जहां सुई pigmented धमनियां (चित्रा 1C और 1 डी) द्वारा कवर किया जाता है ।
    20. सहायक से पूछो करने के लिए धीरे दबाना इंजेक्टर सिरिंज के सवार (के बारे में १.२ µ एल) कोशिकाओं के उचित मात्रा इंजेक्षन करने के लिए. सवार पर सहायक प्रेस के रूप में कुछ काउंटर बल प्रदान करने के लिए तैयार रहें ।
      नोट: सहायक के साथ पूर्व मॉक प्रैक्टिस इस कदम के साथ आवश्यक अनुभव के साथ सर्जन और सहायक दोनों प्रदान कर सकते हैं ।
    21. जबकि नेत्रहीन पेन मार्क एज पर ध्यान केंद्रित, 25-30 एस के लिए जगह में इंजेक्टर पकड़ और फिर धीरे से इंजेक्टर वापस लेना । backflow की एक छोटी राशि सामांयतः मनाया जाता है ।
      नोट: यदि कोई backflow मनाया जाता है, वहां एक intravitreal इंजेक्शन किया गया है हो सकता है । यदि आप सील या श्वेतपटल के नीचे भरने कोशिकाओं के माध्यम से backflow देखते हैं, इंजेक्शन भी उथले था ।
    22. कुल्ला आंख धोने के साथ इंजेक्शन साइट से सेल समाप्ति 3 बार और एक कपास applicator के साथ अतिरिक्त इकट्ठा ।
    23. संचालित आंखों पर नेत्र स्नेहक की एक बूंद लागू करें और अक्टूबर स्टेशन के लिए चूहे हस्तांतरण प्रत्यारोपण कोशिकाओं के स्थान की जांच करने के लिए और उपरेटिना bleb के आकार ।

3. पोस्ट इंजेक्शन उपचार

  1. विरोधी भड़काऊ और दर्द रिलीवर उपचार
    1. buprenorphine में ०.१ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन में खारा में दर्द कम करने के लिए ।
    2. सूजन नियंत्रण के लिए intraperitoneal इंजेक्शन (आईएफसआई) द्वारा खारा में १.६ मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन पर डेक्समेतएसॉनी इंजेक्षन ।
  2. पशु वसूली
    1. एक गर्मी लैंप के तहत वसूली पिंजरे में चूहा वापस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए ।
    2. नकसीर के लक्षण के लिए संचालित आंख का निरीक्षण ।
    3. चूहे का पालन सुनिश्चित करने के लिए यह संज्ञाहरण से बाहर आता है ।
    4. एक ताजा पिंजरे में बरामद पशु लौटें और एक सर्जरी कार्ड के साथ पिंजरे फ्लैग करें, और संकट, आंख नकसीर, या corneal opacities के किसी भी लक्षण के लिए दैनिक निगरानी । अगर कोई चिंता कर रहे है पशुचिकित्सा तुरंत सूचित करें ।

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Representative Results

इस लेख में वर्णित तकनीक का प्रयोग, हम लगातार hRPESC-RPE कोशिकाओं को ठीक स्थान, कोण को नियंत्रित करने से आरसी चूहों के उपरेटिना अंतरिक्ष में दिया, और इंजेक्टर सुई की गहराई ऊतक में डालने (चित्र 1b-D ). तुरंत प्रत्यारोपण के बाद, एक अक्टूबर परीक्षा इंजेक्शन साइट और bleb प्रत्यारोपण कोशिकाओं के द्वारा बनाई गई उपरेटिना का पालन करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । सर्जिकल अक्टूबर मूल्यांकन के बाद इंजेक्शन की गुणवत्ता और रेटिना क्षति या नकसीर के लिए निगरानी के मूल्यांकन के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में कार्य करता है । दोनों उपरेटिना bleb (चित्रा 2a, सी और डी) और इंजेक्शन साइट (चित्रा 2a और बी) अक्टूबर स्कैनिंग के तहत स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है. रेटिना bleb आमतौर पर इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में हल करता है । हालांकि blebs के आकार की माप मुश्किल OCT का उपयोग कर रहा है, हम bleb यह कोशिका ट्रांसप्लांटेशन द्वारा photoreceptor संरक्षण क्षेत्र के बराबर है संभालने के क्षेत्र का अनुमान कर सकते हैं । हम पहले से प्रदर्शित किया है कि ५०,००० कोशिकाओं के एक 1 µ एल इंजेक्शन इंजेक्शन साइट13के आसपास आरसी रेटिना के बारे में 6-7% क्षेत्र को बचाने में परिणाम सकता है । के रूप में चित्रा 2a, सी और डीमें दिखाया गया है, रेटिना परतों इंजेक्शन साइट पर बरकरार थे, कोई रक्त bleb में पाया गया था, और कोई कोशिकाओं अवलेह में मनाया गया, इंजेक्शन की वजह से न्यूनतम आघात का प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, असफल इंजेक्शन के प्रतिनिधि OCT छवियां भी संदर्भ (चित्रा 2E और एफ) के लिए शामिल थे ।

एक प्रतिक्रिया उपकरण के रूप में OCT के उपयोग के साथ, हम कोण और ऊतक में इंजेक्टर सुई प्रविष्टि के गहराई अनुकूलित । एक बार अनुकूलित, इस विधि हमें केवल ५.७% शल्य चिकित्सा विफल रहता है के साथ ९०.८% उपरेटिना का उपयोग की सफलता दर प्राप्त करने की अनुमति दी, ३०० से अधिक पिछले उपरेटिना इंजेक्शन के परिणामों के आधार पर हमारे अन्य अध्ययनों में प्रदर्शन13 (तालिका 1). शेष ३.५% में, OCTs कई कारणों के लिए प्रदर्शन नहीं किया गया, isoflurane संज्ञाहरण के कारण एक पर्याप्त स्थिति में नहीं आंखों सहित-संबद्ध आंख रोलिंग17।

प्रत्यारोपण के बाद 7 दिनों में, संचालित चूहे आंखें enucleated थे, स्थिर और immunohistological विश्लेषण के लिए खोदी । एक मानव कोशिका परमाणु मार्कर (हुँनु)18 और एक RPE सेल मार्कर (OTX2)19 प्रत्यारोपण कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 3 उपरेटिना अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित RPE कोशिकाओं की एक मोटी परत दिखाया है कि, इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह, सकारात्मक दोनों मार्करों के साथ दाग था, पहचान और प्रत्यारोपण के सफल वितरण की पुष्टि. इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह में, कोशिकाओं की बड़ी संख्या है, के रूप में चित्रा 3सी में दिखाया गया है, तेजी से एक छोटे से बाद में भी immunosuppressed आरसी चूहों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी की वजह से संख्या को अस्वीकार कर सकते हैं20. फिर भी, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, आरसी चूहे आंखों के पतित photoreceptor परत hRPESC-RPE13के साथ रोपाई के बाद कम से 2 महीने के लिए बचाया जा पाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : 4 सप्ताह पुराने P2 hRPESC-RPE कोशिकाओं और कोण और गहराई का एक प्रदर्शन है कि इंजेक्शन सुई के दौरान का उपयोग करता है की एक छवि । (क) इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया 4 सप्ताह पुराने P2 hRPESC-RPE कोशिकाओं की एक चरण विपरीत छवि । स्केल बार = १०० µm. (ख) मार्कर के किनारे के बीच ६०० µm दूरी दिखा एक योजनाबद्ध और इंजेक्टर सुई की नोक एक अतिसूक्ष्म द्वारा मापा. अतिसूक्ष्म के न्यूनतम स्नातक १०० µm है । (ग) एक कार्टून एक चूहे की आंख की संरचनात्मक संरचना की धारा पार दिखा और कोण और गहराई के एक पक्ष को देखने कि इंजेक्टर सुई आंख की दीवार में आवेषण । चूहे की आंख की pupillary अक्ष मेज के ऊपर के सापेक्ष 30 डिग्री है और इंजेक्टर सुई गोलक की स्थानीय सतह के सापेक्ष 15 डिग्री है । (घ) एक कार्टून इंजेक्टर सुई पर मार्कर के प्रारंभिक बिंदु और इंजेक्शन साइट के शीर्ष दृश्य जहां इंजेक्टर सुई के ५०० µm ऊतक में डाला जाता है और एक १०० µm अंतरिक्ष इंजेक्शन छेद के उद्घाटन और निशान के किनारे के बीच छोड़ दिया जाता है दिखा रहा है r. छेद के स्थान 1200-limbus के लिए 1500 µm पीछे है । सुई टिप अपनी तरफ दिखाया गया है, लेकिन इंजेक्शन के दौरान चेहरे नीचे होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : अक्टूबर इंजेक्शन के तुरंत बाद संचालित चूहे आंख के चित्र । (क) एक अक्टूबर बी एक संचालित आंख के स्कैन छवि एक रेटिना bleb और इंजेक्शन साइट दिखा रहा है, intravitreal नकसीर के बिना । (ख) एक अक्टूबर मात्रा तीव्रता प्रक्षेपण (वीआईपी) एक बी स्कैन श्रृंखला के इंजेक्शन क्षेत्र के enface fundus छवि का प्रतिनिधित्व करने की छवि । छोटे इंजेक्शन साइट वीआईपी छवि कम आघात दिखा में दिखाई दे रहा है । (ग) के एक बढ़े हुए अक्टूबर छवि (क) के रूप में चिह्नित सभी रेटिना परतों के साथ रेटिना अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित कोशिकाओं दिखा. इस छवि का प्रदर्शन किया है कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं उपरेटिना अंतरिक्ष में स्थित थे । (घ) एक अक्टूबर बी स्कैन एक औसत आकार bleb रेटिना दिखा छवि । (ङ) एक अक्टूबर बी स्कैन intravitreal अंतरिक्ष में स्थित सीएस के साथ एक असफल उप रेटिना इंजेक्शन दिखा छवि । (च) एक अक्टूबर बी स्कैन इंजेक्शन साइट पर के माध्यम से पूरे रेटिना poking के साथ एक असफल उप रेटिना इंजेक्शन दिखा छवि । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : hRPESC-RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद रेटिना जमे हुए वर्गों के दाग Immunohistological. (A) मानव कोशिका नाभिकीय मार्कर (हुँनु) प्रत्यारोपित मानव RPE कोशिकाओं का पता लगाने का संकेत दाग । (B, E) सेल परमाणु काउंटर धुंधला (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) रेटिना परतों, प्रत्यारोपण, और RPE परत दिखा । (ग) हुँनु और DAPI की एक मर्ज की गई छवि यह दर्शाती है कि प्रत्यारोपित hRPE कोशिकाएं उपरेटिना अंतरिक्ष में स्थित होती हैं । प्रत्यारोपण और RPE परत के बीच जुदाई एक प्रसंस्करण क्रायो के साथ जुड़े विरूपण साक्ष्य जमे हुए वर्गों के लिए आरसीएस आंखों की रक्षा है । (घ) RPE कोशिका मार्कर (OTX2) प्रत्यारोपित मानव RPE कोशिकाओं का दाग. (च) OTX2 और DAPI की एक मर्ज की गई छवि । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कुल इंजेक्शन आरसी चूहे की आंखें अच्छा उपblebs के तहत अक्टूबर छोटी सी रेटिना blebs के तहत OCT OCT के तहत कुल गैर जटिल blebs रेटिना Complicatd blebs OCT के तहत (यानी हवा में बुलबुला या रेटिना नकसीर) न झालेले मध्यरात्री सर्जिकल विफल रहता है (कोई रेटिना bleb OCT के तहत)
गिनती ३१४ २६० 25 २८५ 5 6 18
कुल इंजेक्शन आंखों का% ------ ८२.८०% ७.९६% ९०.७६% १.५९% १.९१% ५.७३%
(इन आंकड़ों आरसीएस चूहों में उपरेटिना इंजेक्शन के दस साथियों से संक्षेप हैं)

तालिका 1: आरसी चूहों में दस प्रयोगात्मक साथियों से रेटिना इंजेक्शन का एक सारांश ।

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Discussion

इस लेख में चित्रित उपरेटिना इंजेक्शन तकनीक ट्रांस scleral मार्ग है, जहां इंजेक्टर सुई तंत्रिका रेटिना को नुकसान पहुँचाए या अवलेह गुहा परेशान बिना आंख की दीवार के बाहरी परतों (श्वेतपटल-रंजित-RPE परिसर) प्रवेश के माध्यम से है । एक वैकल्पिक ट्रांस-vitreal दृष्टिकोण मोतियाबिंद के लिए अग्रणी लेंस क्षति के एक संभावित जोखिम है, के बाद से ' कुतर लेंस अवलेह गुहा के बहुमत में रह रहे हैं । इस विधि की तुलना में, हमारी तकनीक कम जोखिम भरा है और इंजेक्शन सुई पूरे अवलेह गुहा भर में जाने की जरूरत नहीं है के रूप में ंयूनतम आघात का कारण बनता है उपरेटिना अंतरिक्ष तक पहुंचने के लिए । दरअसल, हमारे अध्ययन में अक्टूबर परीक्षाओं बहुत दुर्लभ रेटिना प्रवेश की घटनाओं से पता चला है और, जानवरों में अनुवर्ती परीक्षा में, कोई लगातार रेटिना टुकड़ी हैं. इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन साइट बहुत छोटी है (< २०० µm व्यास में) एक ३३ गेज इंजेक्टर सुई का उपयोग करते हुए तो श्वेतपटल-रंजित-RPE परिसर की संरचनात्मक अशांति बहुत सीमित है । सुई कर्षण के बाद, इंजेक्शन छेद स्वयं जवानों स्वचालित रूप से तो कोई सिलाई या ऊतक गोंद की जरूरत है ।

सर्जरी के साथ जटिलताओं इंजेक्शन क्षेत्र के आसपास या पायलट छेद के भीतर से अत्यधिक रक्तस्राव शामिल हैं । limbus पर कंजाक्तिवा मार्जिन पकड़ करने के लिए संदंश का उपयोग करते समय, केवल कोमल बल चुटकी रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए और संभव रक्तस्राव कम करने की जरूरत है । पायलट छेद बनाने से पहले, इरादा इंजेक्शन साइट की जांच करने के लिए सतही रक्त वाहिकाओं के प्रवेश से बचने के । एक भाला का उपयोग करके, पायलट छेद सेल इंजेक्शन सुई की प्रविष्टि से पहले खून की मंजूरी दे दी जा सकती है । यदि पायलट छेद से खून बह रहा है भाला के कुछ अनुप्रयोगों के बाद बनी हुई है, एक पोत टूट गया है हो सकता है । एक और जटिलता हम मनाया आरसीएस के एक छोटे प्रतिशत corneal opacities पोस्ट के विकास चूहों ऑपरेटिव है । कुछ मामलों में, opacities पुराने थे और दूसरों क्षणिक थे । लगातार opacities वाले जानवरों को स्टडी ग्रुप से निकाला गया । Corneal opacities आंख सूखापन के कारण विकसित कर सकते हैं, शारीरिक क्षति, सूजन, दवाओं या रासायनिक जलन21। उनके गठन को कम करने के लिए, आंख पर्याप्त नेत्र स्नेहन बनाए रखने के द्वारा नम रखा जाना चाहिए, और आपरेशन के दौरान एक कपास applicator या अन्य उपकरणों के साथ कॉर्निया को छूने से बचें ।

यहां उल्लिखित इंजेक्शन प्रोटोकॉल नेत्र स्थलों के सापेक्ष परिभाषित दृष्टिकोण कोण और सुई गहराई का उपयोग करता है, और हमारे सेट-अप में शल्य तालिका के सापेक्ष नेत्र कोण । पोस्ट इंजेक्शन अक्टूबर स्कैन के उपयोग के लिए इन इंजेक्शन मानकों को परिष्कृत में महत्वपूर्ण था RPE कोशिका प्रत्यारोपण के प्रतिलिपि नियंत्रण प्रदान करने के लिए उच्च सटीकता के साथ चूहों में रेटिना अंतरिक्ष. दोहराया अभ्यास द्वारा महारत हासिल एक बार, विधि प्रदर्शन करने के लिए सरल है । यह विशेष रूप से प्रशिक्षण में सिफारिश की है, कि बाद शल्य चिकित्सा नेत्र परीक्षा के लिए परिणामों का निर्धारण किया जाता है । कोण और इंजेक्शन सुई की गहराई की संभावना शल्य सेट अप, पशु की उम्र के आधार पर इस प्रतिक्रिया के अनुसार समायोजन की आवश्यकता होगी, और/या यदि अन्य पशु प्रजातियों (उदा., माउस) का उपयोग किया जाता है ।

इंजेक्शन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने और शामिल किए जाने या एक अध्ययन से अपवर्जन निर्धारित करने के लिए, अक्टूबर अवलोकन से रेटिना लहूलुहान की उपस्थिति महत्वपूर्ण है । प्रयोगशालाओं में, जहां OCT अनुपलब्ध है, नीचे वर्णित मानदंड सर्जन द्वारा एक त्वरित स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संदिग्ध इंजेक्शन को बाहर करने के लिए विफल रहता है: (1) इंजेक्शन से पहले: (एक) पायलट छेद भी गहरी (यानीबनाया है, महत्वपूर्ण गहराई > ५०० µm; यहां इस्तेमाल किया इंसुलिन सुई के ब्रांड, बेवल के बीच करने के लिए सुई टिप से दूरी ५०० µm है). (ख) पायलट छेद जरूरत से ज्यादा खून (यानी, खून बह रहा है आंख भाले के साथ छेद पर बल लगाने से रोका नहीं जा सकता) । (ग) इंजेक्शन सुई भी गहरी (यानी, महत्वपूर्ण गहराई चला जाता है > ५०० µm या इंजेक्शन सुई पर मार्कर श्वेतपटल/रंजित/RPE जटिल ऊतक में चला जाता है) । (2) इंजेक्शन के दौरान: (क) इंजेक्शन के दौरान पायलट छेद में इंजेक्शन सुई बनाए रखने में असमर्थ । (ख) इंजेक्शन के दौरान इंजेक्शन सुई के आसपास तुरंत लीकेज हो जाए. (ग) इंजेक्शन सुई बहुत गहरा धक्का दिया है (यानी, इंजेक्शन सुई पर मार्कर इंजेक्शन के दौरान सर्जन द्वारा देखा के रूप में श्वेतपटल/धमनियां/RPE जटिल ऊतक) में चला जाता है । (घ) इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन सुई की स्थिति में अधिक से अधिक 5 सेकंड के लिए बनाए रखने में असमर्थ । (ङ) इंजेक्शन सुई से मुकर जाने पर अत्यधिक रक्त. (च) कोई backflow/समाप्ति इंजेक्शन सुई के कर्षण के बाद देखा जब चरण 2 के साथ संयुक्त ।

एक साथ ले लिया, सुई स्थान, कोण, और गहराई के सावधान प्रबंधन के साथ, ट्रांस scleral उप रेटिना इंजेक्शन तकनीक अत्यधिक विश्वसनीय है, सटीक, और न्यूनतम शल्य चिकित्सा आघात ले जा सकते हैं । इन सभी लाभों के साथ, इस तकनीक का उपयोग न केवल RPE कोशिकाओं के वितरण के लिए किया जा सकता है, बल्कि अन्य कोशिका प्रकार, यौगिकों या जीन उपचारों के लिए भी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम RPE सेल तैयारी के लिए सर्जरी और सुसान बोर्डेन पर उसकी सहायता के लिए पैटी Lederman शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी इस परियोजना के लिए धन के लिए NYSTEM C028504 स्वीकार करते हैं । जस्टिन डी. मिलर को NIH ग्रांट F32EY025931 द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-072
DNAse I Sigma DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) Corning Cellgro 431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS) Alcon 00065079550
Sterile eye wash Moore Medical 75519
Sterile 0.9% saline Hospira 488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) Akorn 17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) Bausch & Lomb 24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock Bausch & Lomb 42702010305 This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex Patterson 433502
Dexamethasone APP Pharmaceuticals 63323051610
100% Ethanol Thermo Scientific 615090040
70% Ethanol Ricca Chemical Company 2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel Novartis 78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops Alcon 00065143105
hRPESC-RPE cells Not available commercially Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates Corning 3526
Conical tubes (15 ml) Sarstedt 62554002
Microcentrifuge cap with o-ring LPS inc L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) LPS inc L233041
Centrifuge Eppendorf 5804R
Sterile alcohol wipe McKesson 58-204
Sterile cotton tip applicators McKesson 24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears Beaver-Visitec International  0008680
Sterile surgical drapes  McKesson 25-515
Gauze McKesson 16-4242
Nanofil syringe (10 ul) World Precision Instruments Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle World Precision Instruments NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge Becton Dickinson 328418
Rat toothed forceps World Precision Instruments 555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5602
Circulating water T pump  Stryker TP700
Heating pad Kent Scientific TPZ-814
Animal anesthesia system World Precision Instruments EZ-7000
Balance Ohaus PA1502
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000
Microscope light source Schott ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System Bioptigen R2210
Sterile black marker pen Viscot Industries 1416S-100
Miniature measuring scale Ted Pella Inc 13623
Infrared Basking Spot Lamp  EXO-TERRA PT2144 This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२६ उप रेटिना इंजेक्शन ट्रांस श्वेतपटल मार्ग कोशिका प्रत्यारोपण रेटिना वर्णक उपकला के रॉयल कॉलेज सर्जनों चूहे उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन स्टेम सेल थेरेपी
चूहा आँखों में मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के ट्रांस-scleral रेटिना प्रत्यारोपण के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल का विकास
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Zhao, C., Boles, N. C., Miller, J. D., Kawola, S., Temple, S., Davis, R. J., Stern, J. H. Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes. J. Vis. Exp. (126), e55220, doi:10.3791/55220 (2017).

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