Summary
Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.
Abstract
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi dejeneratif retinal hastalıkları geri döndürülemez görme kaybı dünya çapında önde gelen nedenidir. AMD bir monolayer işlevsel olarak destekleyen ve anatomik olarak sinirsel retina kaydırma hücre vardır retina pigment epitel (RPE) hücresi dejenerasyonu ile karakterizedir. Sigara neovasküler AMD (kuru AMD) için mevcut farmakolojik tedaviler yalnızca hastalık ilerleme yavaş ama vizyon, roman tedavi stratejileri belirleme amaçlı çalışmalar gerektiren geri yükleyemezsiniz. Dejeneratif RPE hücrelerinin sağlıklı hücreleri tutar söz ile kuru AMD gelecekte tedavi etmek için eski yerine koymak. Kök hücre kaynaklı RPE hücrelerinin nakli subretinal enjeksiyon tekniği uygulanacağı hayvan modellerin subretinal boşluğa dahil AMD için kök hücre yerine tedavilerin geniş preklinik çalışmaları. En sık preklinik bu hayvan çalışmalarda kullanılan iğne ucunun doğrudan görselleştirme eksikliği nedeniyle zor yapılan ve kez retina zarar görmesine neden trans-scleral rota üzerinden yaklaşımdır. Vitre alternatif bir yaklaşımla iğne Bitiş pozisyonu doğrudan gözlem için sağlar, ancak daha fazla göz doku rahatsız gibi cerrahi travma yüksek risk taşır. Biz başarıyla ve tutarlı bir şekilde RPE hücrelerinin sıçan subretinal boşluğa teslim ve aşırı retina zarar görmemesi için tanımlanmış iğne açılardan ve derinliklerden kullanan bir daha az riskli ve tekrarlanabilir değiştirilmiş trans-scleral enjeksiyon yöntemi geliştirdik. Bu şekilde teslim hücreleri daha önce en az 2 ay süreyle Cerrahlar Kraliyet Koleji (RCS) köstebeğiyle etkili olmak gösterilmiştir. Bu teknik sadece hücre transplantasyonu için aynı zamanda küçük moleküller veya gen tedavileri teslim etmek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan retina göz fonksiyonları arka ışık duyusal mendil bulunan ve vizyon algı kritik bir rol oynamaktadır. Retina hücre fonksiyon bozukluğu veya hücre ölümü bu nedenle görme sorunları veya kalıcı körlüğe neden olur. Dejenerasyon veya disfonksiyon farklı katmanları retina hücreleri içeren bozukluklar arasında AMD en yaygın türü ve gelişmiş ülkelerde Yaşlılarda geri dönüşü olmayan körlük önde gelen nedenidir olan dejeneratif retina hastalıkları olarak bilinir 1,2. AMD patolojik süreç RPE katman ve sırayla RPE destek photoreceptor fizyoloji, sinirsel retinal atrofi ve vizyon kaybı3yol bozar temel Bruch'ın membran arasında "drusen" birikmesi ile ilişkili. 4,5. Şimdiye kadar tedavisi yok mu için Gelişmiş (neovasküler olmayan) AMD kuru. Kök hücre tedavisi rejeneratif tıp yeni bir paradigma olarak ortaya çıkması işlevsel olmayan ölü ya da diri RPE hücrelerinin sağlıklı hücrelere kök hücre kaynaklı yerine umut getiriyor. Nitekim, dikim geniş preklinik çalışmaları kök hücre (örneğin, insan embriyonik kök hücre)-türetilmiş RPE hücrelerinin RPE dejeneratif hayvan modelleri içine-si olmak be gerçekleştirilen6,7bazıları için ilerledi, klinik çalışmalarda8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Son zamanlarda, kök hücre insan RPE katmanda insan RPE kök hücreleri (hRPESCs), ikamet alternatif kaynağı bizim lab tarafından tespit edildi ve hRPESC türetilen-RPE hücre (hRPESC-RPE) ekimi tedavisi preklinik çalışmalarda AMD için kullanılmakta olan 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal enjeksiyon tekniği grubumuza dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından yukarıda belirtilen preklinik çalışmalarda uygulanır. Hayvanlarda subretinal enjeksiyon için iki genel yaklaşım vardır: trans-vitreal ve trans-scleral. Trans-vitreal yaklaşım ön göz nüfuz eder, tüm vitreal kavite lens bitişik haçlar ve geri dön subretinal ulaşmak için göz retina nüfuz olarak doğrudan iğne sonuna gözlemlemek için güçlü olmak cerrah avantajı vardır alan14,15,16. Ancak, bu iki konum (anterior ve posteiror), retinada engellemeden objektifin zarar riski taşımaktadır ve iğne geri çektiği zaman içinde hücrelerin geri Vitre neden olabilir gerektirir. Buna ek olarak, trans-sklera yaklaşım, prensip olarak, retina ve camsı katılımı önler ve geri tepme göz çıkar. Pigmentli Rodents, cerrah başlangıçta sklera penetrasyonu gözlemleyebilirsiniz, ancak Pigmentli koroid içine geçiş sonra iğne sonunda artık görünmez. Olmadan doğrudan gözlem, retina ihlal yaygındır ve retina diseksiyon ve hücre ve/veya kan teslim Vitre içine neden olabilir. Ayrıca, göz yüzeyi kavisli çünkü hangi iğne açılardan ve derinliklerden trans-scleral enjeksiyonu için en etkili olduğunu bilmek çok zor.
Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz bir trans-scleral subretinal enjeksiyon yöntemi ile optik Koherens ayrıntılı bir inceleme enjeksiyon yeri, sağlayan tomografi (OCT), ameliyat sonrası değerlendirme kullanımı haberdar tanıtmak. Bizim trans-scleral enjeksiyon tekniği tanımlanmış yerlere, açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler çok düşük cerrahi travma ve yüksek güvenilirlik üretmek için kullanır. Burada, özellikle hRPESC-RPE hücrelerinin enjeksiyon RCS sıçan, önceden klinik manken insan AMD subretinal boşluğa göstermektedir. Bu enjeksiyon yöntemi ile biz başarılı bir şekilde ve sürekli olarak hRPESC-RPE hücrelerinin RCS sıçan gözleri çok yüksek başarı oranı ile subretinal boşluğa teslim. Enjeksiyon hücrelerinin daha önce RCS photoreceptors korunması en az 2 ay sonra enjeksiyon13sonuç bulundu. Bu yordam diseksiyon mikroskop altında gerçekleştirilir ve öğrenmesi kolay. İki kişi (bir cerrah ve asistan) enjeksiyon gerçekleştirmesini gerektirir ve her hayvan için enjeksiyon zamanı ortalama 5 dakikadan daha az. Tanımlanmış açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler için OCT başarılı subretinal enjeksiyon ulaşmak kullanılamaz nerede laboratuarlar için mümkün kılar. Bu son derece tekrarlanabilir subretinal erişim sağlar ve sadece hücre transplantasyonu için ama aynı zamanda uyuşturucu teslim ve gen tedavileri için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), State University of New York Albany adlı tarafından onaylanmıştır.
1. ön enjeksiyon hazırlık
-
HRPESC-RPE hücre süspansiyon hazırlanması
Not: Aşağıdaki adımların tümünü steril doku kültürü mahallede gerçekleştirilen ve temel steril tekniği ile aşinalık gereklidir.- Birincil hRPE hücreleri izole insan donör gözleri 50-90 yıl ve kültür hücreleri 24-şey tabak12yaşında. Hücreleri geçiş 1, cryopreserve, gerektiği gibi tezcan ve kültür 2 (P2) hücreleri için 4-5 hafta (şekil 1A) enjeksiyon için geçiş.
- Kültür orta12 kaldır ve yavaşça durulama wells 500 µL ile iki kez 1 X Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısınmış (1 x DPBS-CMF) 1 ekleyerek X DPBS-CMF 1.000 µL pipet kullanarak ve bir vakum kullanarak kaldırma kuyu içine.
- 300 µL tripsin/Dnaz her şey için ekleyin. HRPESC-RPE hücrelerinde tripsin/Dnaz (4 kU Dnaz başına 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA) 37 ° C'de hücreler ayırmak için 4 dk için kuluçkaya.
- Onlar yuvarlak olmadığını görmek için mikroskop altında hücreleri denetleyin. Eğer onlar henüz kadar yuvarlak değil tripsin/Dnaz bir ek 2 min için hücrelerde kuluçkaya devam'i tıklatın.
- Sonra hücreleri yuvarlanır, 1.000 µL pipet kuyu müstakil hücrelerden triturate ve Önceden ısıtılmış kültür tripsin/Dnaz devre dışı bırakabilirsiniz için orta, eşit hacmi ile 15 mL konik tüp içine müstakil hücreleri içeren tripsin/Dnaz aktarmak için kullanabilirsiniz.
- Wells Önceden ısıtılmış 1 ile durulayın X DPBS-CMF yavaşça yukarı ve aşağı, özellikle de; nesnelerin çevresinde pipetting tarafından daha sonra bu hücreler için önceki konik tüp ekleyin.
- 286 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de konik tüp santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant çıkarın ve 1 mL kültür orta hücrelerle resuspend.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 286 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve hücre içinde steril dengeli tuz çözüm ((1 µL birimindeki 50.000 hücreleri subretinal enjeksiyon sırasında teslim etmek) BSS) 50. 000 hücre/µL adlı resuspend.
- Son hücre süspansiyon (CS) bir 1.7-mL microcentrifuge tüp ve tutmak bir buz-su karışımı içine enjeksiyon kullanım kadar transfer.
-
Hücre enjektör hazırlanması
- Steril bir 33'lik eğimli iğne iğne şırınga ve sıkıca enjektör montajı vida yerleştirin.
- Enjektörü % 100 etanol ile 5 - 6 kez yıkayın.
- Enjektörü % 70 etanol ile 5 - 6 kez yıkayın.
- Enjektör BSS ile 5 - 6 kez yıkayın.
- Enjektör iğne 600 µm (şekil 1B) diseksiyon mikroskop altında iğne ucu uzak bir konumda steril siyah marker kalemle işaretlemek.
- Enjektör micromanipulator enjeksiyon için yerleştirin.
2. subretinal enjeksiyon
-
Cerrahi alan ve hayvan hazırlık
- 4-5 hafta eski RCS ispiyoncu (60-100 g) tartmak ve isoflurane buharı teslim sistemi kullanarak anestezi.
Not: Anestezi tutmak isoflurane akış hızı % 5 ikna etmek için. Anestezi derinliği pençeleri basarak onaylayın ve sonra akış oranını azaltmak için anestezi bakım için % 2-3 ameliyat sırasında. - Sahne Alanı'ndaki bir steril cerrahi alanını ayarlamak diseksiyon mikroskop altında bir Isıtma yastığı ile steril ameliyat örtüsü yerleştirin.
- Fareyi cerrahi alan transfer ve anestezi korumak için isoflurane sisteme bağlı bir burun konisi fare yer.
- Gazlı bez ile sıçan vücudunu örtecek. Sıçan ayak tam anestezi onaylamak için çimdik.
- 4-5 hafta eski RCS ispiyoncu (60-100 g) tartmak ve isoflurane buharı teslim sistemi kullanarak anestezi.
-
Mikroskop altında Trans-scleral subretinal enjeksiyon
- Bir damla göz kayganlaßtırıcı sıçan unoperated göz kulak uygulama.
- Enjeksiyon, onun kafasına doğru cerrah'ın sağ kolu ve cerrah doğru sırt için tavan karşı karşıya onun sol gözü ile sağ yan üzerine fareyi getirin.
- Küçük makasla gözünü kapat herhangi bir bıyık kırpın.
- Göz yıkama sol gözü geçici tarafındaki küçük bir miktar damla ve burun kenarındaki aşırı göz durulama için pamuklu aplikatör ile toplamak.
- Öğrenci %1 tropicamide ve % 2.5 phenylephrine (taze % 10 phenylephrine yapılan ameliyat günü steril % 0,9 salin sulandrarak) ile her bir damlası uygulayarak bir sonrası enjeksiyon OCT sınavı için genişletmek.
- 4 - 6 kez göz çevresindeki deri yavaşça çekin göz biraz proptosed daha kolay erişim için bölgeler için limbus arka olacağı göz kapağı açmak için.
- Bir damla göz yıkama uygulamak ve gözün nemli tutmak.
- Yavaşça CS (1.1.12 adımda hazırlanan) triturate ve enjektör 1.2 µL CS ile yükleyin. Ekstra 0.2 µL enjeksiyon geri tepme için telafi etmek için kullanılır.
Not: Hakkında bizim ölçümleri dayalı 5.000-8.000 hücreleri hücre kaybı yaklaşık % 10-16 eşittir 50.000 hücre/µL enjeksiyonu ile geri tepme içinde kaybolur ve bu hücre kaybı telafi etmek için fazladan 0.2 µL CS enjekte ettiler. - CS ile bir micromanipulator dolu enjektör yerleştirin (veya tutmak bir yardımcınız olabilir) dikey RPE hücreleri kolayca süspansiyon lavabo eğilimindedir.
- %0,5 proparacaine (yerel topikal anestezi) bir damla göz kulak uygulamak ve aşırı bir pamuklu aplikatör ile kaldırmak.
Not: Bu adım Korneal refleks bastırmak ve göz sonraki adımları sırasında yanıp sönmesini önlemek. - Forseps limbus için posterior konjonktiva kavrama göz nasally döndürmek ve bir "çadır" to make konjonktiva kaldırmak için kullanın.
- Konjonktiva içinde küçük bir açılış yapmak ve alttaki sklera maruz "çadır" üst kesilmiş makas kullanın.
- Forseps limbus yanındaki kalan konjonktiva kenar boşluğunu kenarına kavrama ve masa üstü (şekil 1 c) göre yaklaşık 30 derece açılı gözbebeği eksendir göz nasally döndürme için kullanın. Devam eden konjonktiva marjı sürükleyici iğne ekleme sırasında karşı bir güç sağlamak ve en uygun açılı göz korumak için gereklidir.
- Hücre enjeksiyon için bir pilot delik yapmak, 1,200-1,500 µm yukarı dönük olacak şekilde ipucu açılmasıyla limbus posterior, steril eğimli 31'lik insülin iğne sonuna yerleştirin.
- Böylece 10-15 derecenin üzerinde sklera (bir hayali uçak için amaçlanan enjeksiyon yerinde teğet) insülin iğne açısını ayarlayın. Yavaş yavaş sklera-koroid tesisin yaklaşık 500 µm iğne derinliği için nüfuz. Pigmentli köstebeğiyle iğne sonuna 'Pigmentli koroid altında kaybolur'. Burada kullanılan insülin iğne marka için iğne ucu konik 500 µm mesafedir.
- Dikkatli bir şekilde (çok küçük efüzyonu kan görülebilir) insülin iğne geri alıyorum.
- Eğer aşırı kanama kaydetti, bir göz mızrak delik temizlemek için gerekirse uygulanabilir. Bir gemi mızrak uygulama gösterir sonra devam eden kanama zarar görmüş olabilir.
- RPE hücre dolu enjektör iğne pilot delik aşağı ve sklera, yerel yüzey göre yaklaşık 10-15 derecelik bir açıyla bakacak şekilde açılması ile rehberlik.
- Yavaşça enjektör iğne subretinal alanına erişmeye yaklaşık 500 µm derinliğe pilot deliğe yerleştirin. Orada-meli var olmak a 100 µm sınır siyah kalem işareti kenarı iğne Pigmentli koroid tarafından (şekil 1 c ve 1 D) yöneticiliğini noktası arasındaki hakkında.
- Yavaşça uygun cilt hücrelerinin (yaklaşık 1.2 µL) enjekte pistonu enjektör şırınganın bunalıma girmek için yardımcı'yı sor. Asistan olarak karşı bir güç pistonu üzerinde presler sağlamak hazır olun.
Not: Önceki sahte uygulama ile yardımcı cerrah ve Yardımcısı ile bu adım gerekli deneyimi sağlar. - Görsel olarak kalem üzerinde odaklanan sırasında kenar işaretlemek, enjektör yerde 25-30 s için basılı tutun ve sonra yavaş yavaş enjektör geri çek. Geri tepme az miktarda yaygın olarak görülmektedir.
Not: Hiçbir geri tepme gözlem yapılırsa bir intravitreal enjeksiyon olabilir. Geri tepme mühür veya altında sklera doldurma hücreleri aracılığıyla görürseniz, enjeksiyon çok sığ. - Hücre sızma steril göz yıkama ile enjeksiyon sitesinden 3 kez durulama ve aşırı bir pamuklu aplikatör ile toplamak.
- Bir damla göz kayganlaßtırıcı çalışan göz kulak uygulama ve fare transplante hücrelerin konumunu ve subretinal bleb boyutunu incelemek için OCT istasyona aktarın.
3. sonrası enjeksiyon tedavisi
-
Ateş düşürücü ve ağrı kesici tedavi
- Buprenorfin 0.1 mg/kg vücut ağırlığı subkutan ağrıyı azaltmak için serum fizyolojik içinde adlı enjekte.
- Deksametazon 1.6 mg/kg vücut ağırlığı serum fizyolojik içinde iltihap denetimi için mayi enjeksiyonla (IP) enjekte et.
-
Hayvan Kurtarma
- Fare kurtarma kafes vücut ısısını korumak için a ısı lamba altında dönün.
- Kanaması belirtileri için işletilen göz gözlemlemek.
- Anesteziden gelir sağlamak için fareyi gözlemlemek.
- Kurtarılan hayvan için taze bir kafes dönmek ve kafes bir ameliyat kartı ile bayrak ve günlük sıkıntı, oküler kanama veya kornea opaklıklar belirtisi izlemek. Endişeleri varsa veteriner hemen bildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan yöntemi kullanarak, biz sürekli olarak hRPESC-RPE hücrelerinin RCS fareler subretinal uzaya tam konumunu, açı ve enjektör iğne dokusuna (şekil 1B-D ekleme derinliği kontrol ederek teslim ). Hemen aşağıdaki nakli, OCT sınava enjeksiyon yeri ve Transplante hücreleri tarafından oluşturulan subretinal bleb gözlemlemek için gerçekleştirildi. Ameliyat sonrası OCT değerlendirme enjeksiyonları ve retina hasar ya da kanama için izleme kalitesini değerlendirmek için bir tarama aracı olarak hizmet vermektedir. Her iki subretinal bleb (şekil 2A, C ve D) ve (şekil 2A ve B) enjeksiyon izi tarama OKT altında açıkça görülebiliyordu. Subretinal bleb genellikle enjeksiyon sonra 24 saat içinde giderir. Blebs boyutunu ölçümü OCT kullanarak zor olsa da, photoreceptor koruma alanı hücre transplantasyonu tarafından eşit olduğunu varsayarak bleb alan tahmin edebilirsiniz. Biz daha önce 1 µL enjeksiyon 50.000 hücre yaklaşık 6-%7 tasarruf neden olabilir gösterdi alan RCS retina çevresinde enjeksiyon sitesi13. Şekil 2A, C ve D, retina katmanları enjeksiyon yerinde sağlam idi gösterildiği gibi kan içinde bleb algılandı ve hiçbir hücre minimal travma enjeksiyonu ile neden gösteren Vitre gözlendi. Buna ek olarak, başarısız enjeksiyonları temsilcisi OCT görüntülerini de başvuru (şekil 2E ve F) dahil edildi.
Ekim geribildirim alet olarak kullanılmasıyla, açı ve doku içine enjektör iğne ekleme derinliği optimize. Bir kez en iyi duruma getirilmiş, bu yöntem bir başarı oranı sadece % 5.7 cerrahi ile %90.8 subretinal erişim elde etmek izin verdi, ' 300'den fazla önceki subretinal enjeksiyonları bizim diğer çalışmalar13 ' te (Tablo 1) gerçekleştirilen sonuçlarına dayanarak başarısız olur. Geri kalan %3.5 OCTs gözleri değil yeterli bir konumu nedeniyle17haddeleme isoflurane anestezi ilişkili göz de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle yapıldı değil.
Nakli sonra 7 gün işletilen sıçan gözler, sabit ve immunohistological analiz için kesitli enucleated. Bir insan hücre nükleer işaretleyici (Hunu)18 ve bir RPE hücre işaretçisi (OTX2)19 transplante hücreleri tespit etmek için kullanılmıştır. Şekil 3 transplante RPE hücrelerinin kalın bir tabaka, bir hafta sonra enjeksiyon, olumlu ile her iki işaretleyiciyi de, lekeli subretinal alanı kimliğini ve başarılı teslim nakli teyit gösterdi. Bir hafta sonra enjeksiyon, hücreleri, çok sayıda şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi hızla küçük bir numaraya daha sonra ana bilgisayar bağışıklık yanıtı baskılanmış RCS fareler20içinde bile nedeniyle düşebilir. Yine de, yukarıda belirtildiği gibi RCS sıçan gözleri yozlaşmış photoreceptor tabakası en az 2 ay sonra hRPESC-RPE13ile ekimi kurtarılmayı bulunabilir.
Resim 1 : Bir görüntü 4 - hafta eski P2 hRPESC-RPE hücrelerinin ve açı ve enjektör iğnesi enjeksiyon sırasında kullandığı derinlik gösteri. (A) bir faz kontrast görüntü 4 - hafta eski P2 hRPESC-RPE hücrelerinin enjeksiyon için kullanılır. Ölçek çubuğu 100 µm 600 µm mesafe işaretçiyi kenar ve enjektör iğne ucu arasında gösterilen bir şematik bir microscale tarafından ölçülen. (B) =. En az microscale bir sıçan gözün anatomik yapısı ve bir yan görünüm açısı ve enjektör iğne göz duvara ekler derinlik kesit gösterilen 100 µm. (C) A çizgi film bitiyor. Sıçan gözün gözbebeği eksen masa üstü göre 30 derece ve enjektör iğne göz küresi yerel yüzey göre 15 derece. (D) bir karikatür enjektör iğne ve enjektör iğne 500 µm doku ve 100 µm boşluk yerleştirildiği enjeksiyon sitenizin üst görünümünde işaretçiyi başlangıç noktasını gösteren püskürtme deliği açılması ve marke kenarı arasında kaldı r. 1,200-1,500 µm limbus için arka delik konumudur. İğne ucu yan tarafında gösterilir, ancak aşağı doğru olması gereken enjeksiyon sırasında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Hemen sonra enjeksiyon işletilen sıçan göz görüntülerini OCT. (A) subretinal bir bleb ve enjeksiyon sitesi, intravitreal kanama olmadan gösterilen işletilen göz bir Ekim B-tarama görüntü. (B) bir OCT birim yoğunluk projeksiyon (VIP) yansıması enjekte çevrenin enface fundus resmi temsil eden bir B-scan serisi. Küçük enjeksiyon yeri minimal travma gösterilen VIP görüntüde görünür. (C) (A) nakledilen hücreler tüm retina katmanları ile subretinal alanda gösterilen bir genişletilmiş OCT görüntü olarak işaretlenmiş. Bu görüntü transplante hücreleri subretinal boşluğa yerleşmişti gösterdi. (D) Ekim B-tarama görüntü bir ortalama boyutu subretinal bleb gösterilen. (E) Ekim B-tarama görüntü başarısız subretinal enjeksiyon intravitreal uzayda bulunan CS ile gösterilen. (F) Ekim B-tarama görüntü başarısız subretinal enjeksiyon yoluyla enjeksiyon yerinde alay tüm retina ile gösterilen. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Immunohistological bölümler hRPESC-RPE hücrelerinin nakli sonra dondurulmuş retina, boyama. (A) transplante insan RPE hücrelerinin algılama gösteren boyama insan hücre nükleer işaretleyici (Hunu). (B, E) Hücre nükleer sayaç boyama (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) retina katmanları, organ nakli ve RPE katmanı gösteren. (C) A Birleştirilen görüntüyü Hunu ve Transplante hRPE hücreleri subretinal uzayda bulunan gösteren DAPI. Organ nakli ile RPE katman arasındaki mesafeyi cryo-koruma RCS gözleri donmuş bölümleri için ilişkili işleme bir eserdir. (D) RPE transplante insan RPE hücrelerinin işaretleyici (OTX2) hücre boyama. (F) bir birleştirilmiş görüntü OTX2 ve DAPI. Ölçek çubuğu 20μm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Toplam eklenen RCS sıçan gözler | OCT altında iyi subretinal blebs | OCT altında küçük subretinal blebs | Karmaşık-toplam subretinal blebs OCT altında | Complicatd subretinal blebs OCT (yani o ya da retinal kanama hava kabarcığı) altında | Hiçbir OCT gerçekleştirilen | Cerrahi başarısız (OCT altında hiçbir subretinal bleb) | |
| Count | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % Toplam enjekte göz | ------ | %82.80 | %7,96 | %90.76 | %1.59 | %1.91 | %5,73 |
| (Bu veri RCS Sıçanlarda subretinal enjeksiyonları 10 tabur özetlenmiştir) | |||||||
Tablo 1: On deneysel tabur RCS Sıçanlarda düşük subretinal enjeksiyonları özetini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede tasvir subretinal enjeksiyon tekniği nerede enjektör iğne sinirsel retina zarar veya vitreus kavite rahatsız olmadan göz duvar dış katmanlarını (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz trans-scleral yolu üzerinden gerçekleştirilir. Bir alternatif trans-vitreal yaklaşım objektif hasar kemirgenler objektif kaplayan vitreus kavite çoğunluğu bu yana katarakt için önde gelen bir potansiyel riski vardır. Bu yönteme göre bizim teknik daha az riskli ve enjektör iğne subretinal uzay ulaşmak için tüm Vitrifiye boşluğu gitmek gerekmez gibi minimal travma neden olur. Nitekim, OCT muayene bizim çalışmalarda çok nadir retina penetrasyon olaylar gösterdi ve hayvanlar takip sınavlarda hiçbir kalıcı retina dekolmanı vardır. Ayrıca, enjeksiyon yeri çok küçüktür (< 200 µm çapı) otelde 33'lik enjektör kullanarak iğne sklera-koroid-RPE kompleks yapısal bozukluğu çok sınırlıdır bu yüzden. İğne geri çekilmesi sonra kendi kendini otomatik olarak yok dikiş püskürtme deliği mühürler veya doku yapıştırıcı gereklidir.
Ameliyat komplikasyonları dahil enjeksiyon alanı çevresinde veya içinden aşırı kanama pilot delik. Forseps limbus konjonktiva marjı kavrama için kullanırken, yalnızca yumuşak kuvvet kan damarları pinching önlemek ve olası kanama azaltmak için gereklidir. Pilot delik oluşturmadan önce yüzeysel damarlar penetrasyonu önlemek için amaçlanan enjeksiyon yeri inceleyin. Bir mızrak kullanarak, pilot delik kan hücre enjeksiyon iğne ekleme önce temizlenebilir. Eğer pilot delik kanama mızrak bir kaç uygulama sonra devam ederse, bir gemi bozulmuş. Başka bir komplikasyon biz gözlenen kornea opaklıklar post-operatively geliştirme RCS fareler küçük bir yüzdesidir. Bazı durumlarda opaklıklar kronik ve diğerleri geçici. Kalıcı opaklıklar hayvanlarla çalışma grubundan kaldırılmadı. Kornea opaklıklar göz kuruluğu, fiziksel hasar, iltihap, ilaç veya kimyasal tahriş21nedeniyle gelişebilir. Düzenlerini azaltmak için göz geniş göz yağlama tutarak nemli tutulmalıdır ve işlem sırasında bir pamuklu aplikatör veya diğer araçları ile kornea dokunmaktan kaçının.
Enjeksiyon protokolü kullanır tanımlanmış yaklaşım açıları ve oküler simge yapılara göre iğne derinlikleri ve göz açıları göre yapımız cerrahi tablo burada özetlenen. Sonrası enjeksiyon OCT taramaları kullanımı yüksek doğrulukta RPE hücre transplantasyonu rats'subretinal uzaya reproducible denetimini sağlamak için bu ekleme parametreleri rafine önemli oldu. Tekrarlanan uygulama tarafından hakim sonra gerçekleştirmek basit bir yöntemdir. Bu, özellikle eğitim, ameliyat sonrası oküler sınav sonuçları belirlemek için gerçekleştirilmesini tavsiye edilir. Buna göre yaş cerrahi set-up bağlı olarak bu geribildirim için açı ve enjeksiyon iğne olacak büyük olasılıkla gerek ayarlama derinliği hayvan, ve/veya diğer hayvan türlerinin kullandıysanız (örneğin, fare).
Enjeksiyon kalitesini değerlendirmek ve içerme veya dışlama bir çalışma belirlemek için OCT gözlem bled subretinal varlığı önemlidir. Nerede OCT kullanılamıyorsa, laboratuvarlarda, aşağıda açıklanan kriterleri bir hızlı tarama için cerrahlar tarafından şüpheli enjeksiyon başarısız dışlamak için kullanılabilir: (1) önceden enjeksiyon için: (a) Pilot delik çok derin yapılır (örneğin, önemli derinliği > 500 µm; için Burada, iğne ucu konik orta mesafe kullanılan insülin iğne 500 µm markadır). (b) pilot delik kanamaları aşırı (Yani, kanama durdurulamaz delik göz spears ile kuvvet uygulayarak). (c) enjeksiyon iğne çok derin gider (Yani, önemli derinliği > 500 µm veya işaretçiyi enjeksiyon iğne üzerinde gider sklera/koroid/RPE karmaşık dokusu içine). (2) sırasında enjeksiyon: pilot delik enjeksiyon iğneyi enjeksiyon sırasında korumak için (a) yapamaz. (b) hemen enjeksiyon iğneyi enjeksiyon sırasında çevresinde kaçak. (c) enjeksiyon iğne çok derin itilir (Yani, işaretçiyi enjeksiyon iğne üzerinde gider sklera/koroid/RPE karmaşık dokusu içine) enjeksiyon sırasında cerrah tarafından fark gibi. (d) den fazla 5 saniye sonra enjeksiyon enjeksiyon iğne pozisyonda korumak için yapamaz. (e) aşırı kan ne zaman iğne iğne geri çeker. (f) hiçbir geri tepme/sızma geri adım 2 ile birleştirildiğinde enjeksiyon iğne çekme sonra gördüm.
Birlikte, iğne konumu, açılardan ve derinliklerden, dikkatli yönetimi ile ele alındığında trans-scleral subretinal enjeksiyon tekniği son derece güvenilir, doğru ve minimal cerrahi travma taşıyabilir. Tüm bu avantajlar ile bu teknik sadece'dır RPE hücrelerinin, ama aynı zamanda diğer hücre tipleri, bileşikleri veya gen tedavileri için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Patty Lederman RPE hücre hazırlık için cerrahi ve Susan Borden onu yardım için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca NYSTEM C028504 bu proje için finansman için kabul. D. Miller NIH tarafından desteklenen Justine F32EY025931 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
