Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Das Ziel dieser Methode ist das Rückenmark sowie zu identifizieren und zu isolieren DRGs 1, 2 zu isolieren. Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, dh durch die Wirbelsäule eine nach brechen, und dieses Verfahren verringert das Risiko von Gewebe durch die Dissektion Prozess verursachten Schaden 3, 4 . DRGs kann schwierig sein, zu identifizieren. Die korrekte Identifizierung ist für Gewebeanalyse sehr wichtig, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden.
Gewebe durch die hier gezeigt , isoliert Techniken können auf eine Vielzahl von Analysen , einschließlich Western – Blotting 5 aufgebracht werden,6, qPCR 7 und immunhistochemischen Färbung 8.
Wenn DRGs identifizieren, ist es wichtig zu berücksichtigen , daß die Anzahl der Rückenmarkssegmente bekannt ist mit Tiertyp und Dehnungs 9, 10, 11 zu variieren. Die Vorteile bei der Durchführung dieses Verfahrens bei Mäusen sind die hohe Anzahl von gentechnisch veränderten Varianten und den relativ niedrigen Wohnkosten. Die Vorteile bei der Verwendung von Ratten sind die relativ hohen Gewebeausbeute und wenn Nervenverletzungen beteiligt, wird das Verfahren mit der Größe erleichtert werden.
Wenn die Wirbelsäule gestört wird, beispielsweise durch zervikale Dislokation, wird das Rückenmark bei der Extrusion aufgespalten. Wenn das Rückenmark nicht extrudiert werden kann, kann die Wirbelsäule leicht an beiden Enden abgeschnitten werden und die Extrusionsversuch wiederholt werden kann. Falls das gesamte Rückenmark für eine weitere Analyse erforderlich, dh der Halsanschwellung bestehend sowie der Lenden- Erweiterung sollte die Wirbelsäule nur geringfügig beschnitten werden. Wenn nur die Lendenanschwellung für die weitere Analyse erforderlich ist, sollte das Rückenmark nach der vorliegenden Protokoll getrimmt werden. Die Wirbelsäule sollte mit den Fingerspitzen gerade gerichtet werden Extrusion zu erleichtern.
Das Protokoll ist für Nagetiere aller Altersgruppen und hier wird von einer erwachsenen Maus (8 Wochen), eine Maus pup (5 Tage) und einer erwachsenen Ratte (10 Wochen) veranschaulicht. Je nach Tierart und Stamm, die Anzahl der thorakalen und lumbalen Abschnitte variieren 9, </sup> 10, 11. In Abhängigkeit von den Proteinen zu analysiere erwachsenen Nagetieren können mit enzymhemmende Lösungen vor der Euthanasie perfundiert werden. Wenn ein Experiment durchführen einseitige Nervenschaden, kann das Rückenmark in ipsilateralen und kontralateralen Seiten aufgeteilt werden unter Verwendung von ultrafeinen Pinzette sofort nach der Extrusion. Ferner kann jede Seite in dorsalen und ventralen Seiten aufgeteilt werden. Das Gewebe kann dann für weitere Analysen, wie zB Western – Blot verarbeitet werden.
Transkardialer Perfusionsfixierung mit PFA vor dem Rückenmark Extrusion sollte vermieden werden, da dies das Rückenmark nicht flexibel macht und verhindert, dass das Rückenmark hydraulischen Extrusion. Hydraulische Rückenmark Extrusion werden die dorsalen Wurzeln abreißen. Für Experimente, wo angebracht Dorsalwurzeln notwendig sind, wird laminectomy empfohlen. Darüber hinaus werden durch hydraulische Rückenmarkshäuten Extrusion verloren, die durch Standard laminectomy vermieden werden können <sup class = "xref"> 3.
Hydraulik Extrusion des Rückenmarks und DRG Isolierung auch könnte unter Verwendung oxygenierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) anstelle von eiskaltem PBS durchgeführt. Die Verwendung von ACSF ermöglicht die Erhaltung des isolierten Gewebes in einer besseren physiologischen Umgebung, die bei der anschließenden elektrophysiologischen Ableitungen 12 besonders wichtig ist, 13. Eine Alternative zu ACSF könnte PBS , enthaltend 1 g / l Glucose zur Erzeugung von Primär DRG – Kulturen 14.
Hydraulik Extrusion des Rückenmarks ist ein wesentlich schnelleres Verfahren als die traditionelle Art des Rückenmarks Isolierung durch Laminektomie, wodurch Gewebebehandlungszeit und damit die Gefahr von Proteinschädigung vermindert wird. Perfusion mit einem Fixiermittel vor das Rückenmark durch Laminektomie zu isolieren, das Risiko von Gewebeschäden bei der Präparation und bei der endgültigen Entfernung des verringern kannRückenmark von der Wirbelsäule. Allerdings schließt Gewebefixierung seine Anwendbarkeit auf Analysen wie Western Blotting. Hydraulische Extrusions Ausbeuten strukturell unbeschädigte Gewebe 3 geeignet für ein breiteres Spektrum von Analysen.
Konsistente Erkennung von DRGs kann schwierig sein. Dies ist jedoch für die Gewebeanalyse unerlässlich, zB Ischiasnerv Verletzung folgen. Durch die Nummerierung der DRGs nach ihrer Lokalisation in Bezug auf die Costae, DRGs konsistent identifiziert werden. Die Färbung der Rückenmarksgewebe sowie von DRGs kann durch Ausführen der dargestellten Gewebebehandlung Variationen in Protokollschritt 7 skizziert optimiert werden.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |